mapk信号途径介导的17β

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1、MAPK信号途径介导的17β【关键词】17β-雌二醇；人精子；顶体反应；膜雌激素受体；丝裂原活化蛋白激酶　　AbstractObjective　Tostudytherapidnon-geniceffectandmechanismof17β-estradiolonhumanspermatozoonactivation.Methods　Humanspermatozoaol/L)orE2-BSA(5μmol/L)for15minutesaftertreatedoxifen(0.05μmol/L)for20m

2、inutes.AcrosomereactionratesestainingandMAPKactivityinedbyAPKactivity(p42/p44).TheeffectsofE2orE2-BSAoxifen.ConclusionsTheremaybesomemembraneestrogenreceptorsonthehumanspermatozoa,ediatetherapidactivationaleffectsofestrogenonhumanspermatozoathroughMAPKp

3、athanspermatozoonacrosomereactionmembraneestrogenreceptormitogen-activatedproteinkinase　　越来越多的研究资料证明，雌激素在精子的成熟及精子功能的获得中都起着非常重要的调节作用，体外环境下，雌激素对精子有一定的激活效应，在精子运动力的获得、精子蛋白的酪氨酸磷酸化、获能、顶体反应和受精等过程中有重要的促进作用［1］。但迄今为止，雌激素人精子激活作用的机制尚未完全阐明。为此，本实验用17β-雌二醇（E2）作用正常人获能精

4、子，观察雌激素对人精子激活的指标之一顶体反应的影响，并探讨参与该过程的MAPK信号通路。　　1　材料与方法　　1.1材料　　1.1.1主要试剂17β-雌二醇（E2）、雌二醇-牛血清白蛋白复合物（E2-BSA）、牛血清白蛋白（BSA）、雌激素受体(ER)拮抗剂Tamoxifen均购自Sigma公司；兔抗p-44/42单克隆抗体购自CellSignaling公司；化学发光增强剂购自Nea公司；俾士麦棕Y购自美国SchmidGMBH公司；玫瑰红购自Fluka公司。　　1.1.2精液标本采集实验所用33例精液

5、标本来自年龄25~45岁﹑有正常生育史﹑身体健康的成年男性志愿者，其精液常规各项指标符合APK蛋白（p42/p44）表达精子经实验因素处理后进行离心、裂解，用BCA法测定精子蛋白浓度［3］。所得蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，以湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，封闭1h后，加入一抗体（抗p42/p44磷酸化单克隆抗体，1:3000）室温孵育1h，PBST洗膜3次，之后加入二抗（HRP标记羊抗鼠IgG，1:5000）室温孵育1h，PBST洗膜3次，与ECL发光底物反应2min，X光片曝光、显影定影。用

6、抗人肌动蛋白抗体β-action作为内参照，进行二次免疫印迹。用图像处理系统对X光片进行扫描测定感光区带的灰度值，以p42/p44蛋白条带与β-action条带的比值表示磷酸化p42/p44MAPK蛋白的表达量。　　1.2.3统计学处理实验数据均以±s表示，利用SPSS11.5统计学软件进行方差分析，P＜0.05被认为有统计学意义。　　2结果　　2.1E2、E2-BSA对人精子AR率的影响结果如表1所示。与空白对照组相比，E2（1μmol/L）、E2-BSA（5μmol/L）作用15min后，精子顶体

7、反应率均明显提高（P＜0.05），且两作用组间无显著差异(P＞0.05)；Tamoxifen（0.05μmol/L）预处理精子20min后，E2（1μmol/L）、E2-BSA（5μmol/L）诱导的精子顶体反应率明显受到抑制，且显著低于E2（1μmol/L）、E2-BSA（1μmol/L）单纯诱导的精子顶体反应率；Tamoxifen（0.05μmol/L）单纯作用组对精子顶体反应率无明显影响（P＞0.05）。表1Tamoxifen对E2、E2-BSA诱导精子顶体反应率的影响（略）注：*P＜0.05v

8、scontrol,#P＜0.05vsE2,▲P＜0.05vsE2-BSA　　2.2E2、E2-BSA对人精子p42/p44磷酸化MAPK蛋白表达的影响　　本实验以磷酸化p42/p44MAPK蛋白与内参照肌动蛋白β-actin条带的灰度值比值表示MAPK活性的变化，图1为APK蛋白表达量分别为：对照组（0.7025±0.1471、0.7446±0.1559），E2（1μmol/L）单独作用组（0.8295±0.1936、0.9799±0.2052），E2-