罗格列酮改善高脂饲养大鼠胰岛素抵抗机制的研究论文

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1、罗格列酮改善高脂饲养大鼠胰岛素抵抗机制的研究论文.freelg/kg，罗格列酮粉剂（99%）由史克必成有限公司提供，其余两组给予相当剂量的蒸馏水灌胃，实验周期为7周。1.2空腹血糖、胰岛素（Ins）的测定大鼠禁食8～10h后，从后眼眶静脉丛取血，血糖用葡萄糖氧化酶法测定。胰岛素以放射免疫法检测。采用北京北方生物技术研究所生产的放免试剂盒及上海核福光电仪器有限公司生产的SN-682型放射免疫计数仪测定血清胰岛素。1.3胰岛素敏感性的测定动物空腹采血后恢复2～3天再行葡萄糖-胰岛素耐量实验（G-InsTT）测定大鼠

2、胰岛素敏感性。大鼠于非空腹状态下，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，行颈外静脉和股动脉插管，先从静脉注射葡萄糖（700mg/kg），随即注射普通胰岛素（0.175u/kg），从股动脉抽血用葡萄糖氧化酶法，测定实验前及注射胰岛素完毕后第3、6、9、12、15min的血糖值。胰岛素敏感性用K值表示，具体方法为：以时间为横坐标，血糖值经自然对数转化后为纵坐标，直线回归所得到的回归系数乘以-100即为K值。K值减小表示机体对胰岛素不敏感，即有IR。1.4脂肪组织的留取葡萄糖-胰岛素耐量实验测定后，大鼠断头处死，尽可能留取同一

3、部位股部皮下、附睾周围腹腔脂肪组织，即刻采用上海天平仪器厂生产的电子微量天平称重。称重后保存在-80℃液氮中。1.5脂肪组织中肿瘤坏死因子（TNF-α）、瘦素（leptin）、PPAR－γ基因mRNA水平的测定取附睾周围腹腔冻存的脂肪组织（0.9g），用TRIzol一步法提取总RNA，经电泳显示28S、18S条带，测定OD260/OD280比值大于1.8。应用RT-PCR法检测脂肪组织中TNF-α、leptin、PPAR－γ基因mRNA表达水平，逆转录酶、Tag酶及缓冲液购自Promega公司，PCRmarke

4、rs由华美生物工程公司提供。引物序列为：TNF-α有义链5′-AGGCGCTCCCCAAAAAGATG-3′，无义链5′-TGGCGGAGAGGAGGCTGACT-3′，扩增产物480bp；Leptin有义链5′-ACCCCAGCGAGGAAAATGTG-3′，无义链5′-GGAAGGCAAGCTGGTGAGGA-3′，扩增产物288bp；PPAR-γ有义链5′-AAGACATCCCGTTCACAAGA-3′，无义链5′-GCTGGTCGATATCACTGGAG-3′，扩增产物459bp；内参照GAPDH有义链

5、5′-TTCATTGACCTCAACTACATG-3′，无义链5′-GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3′，扩增产物443bp。由上海博彩生物试剂公司合成。PCR反应体系为25μl，其中包括10×PCR缓冲液2.5μl、25mmol/LMgCl21.5μl、10mmol/LdNTPs0.5μl、引物2μl、Taq酶2.5μl、cDNA2μl。循环参数：94℃预变性×1min，58℃退火×1.5min，72℃2min，循环35次，最后7次延长至10min，4℃保存。取产物10μl用2％琼脂糖凝胶电泳，60

6、V电泳1h，透射紫外灯下观察结果并拍照。通过电泳图像分析仪进行灰度测量，基因表达水平用TNF-α、leptin、PPAR-γ与GAPDH灰度比值表示。1.6脂肪细胞凋亡观察取液氮中腹腔内附睾周围脂肪组织，在-30℃冰冻切片机中切成8μm薄片，贴在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，37℃烤30min，用4%多聚甲醛固定30min，0.01%TritonX-100-PBS洗3×3min，再用0.4%胃蛋白酶消化30min，PBS洗3×3min，加TUNEL混合液，37℃×1h，PBS洗3×3min，甘油封片，荧光显微镜下观

7、察。观察后再PBS洗3×3min，滴加抗FITC二抗（即用液）4℃过夜，PBS洗3×3min，AKP显色30min，核固红衬染，PBS洗3×3min，明胶甘油封片，光学显微镜下观察。采用TUNNEL法，按试剂盒说明的步骤进行染色。阳性细胞计数：在荧光显微镜下计数400倍视野中的阳性细胞数，每个标本共随机观察5个视野，计算平均数。TUNEL试剂盒由Roche公司生产。1.7统计学方法所有定量指标均以均数±标准差（x±s）表示，实验数据采用SPSS统计软件进行方差分析。2结果2.1一般指标的改变实验期间，各组摄食量

8、未见明显差异，高脂饲养2组大鼠大便较正常对照组偏少、较软。高脂饲养2组大鼠体重较正常对照组增高，但均无统计学意义，见表1。表1各组大鼠体重的变化（x±s，g）2.2血糖、胰岛素的改变高脂饲养2组空腹及餐后血糖较正常对照组明显升高（P0.05）。与高脂对照组相比，药物治疗组血糖有下降趋势，但无统计学意义。高脂饲养2组动物空腹胰岛素水平明显升高，与正常对照组相比差异有显著性（P0.05），