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1、反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌广东医学2006年1月第堑鲞笠塑反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌*樊慧珍黄文杰于化鹏张力南方医科大学珠江医院呼吸科,骨科(广州510282);广州军区广州总医院呼吸科(广州510010)?39?..基础獬;乡艺_ll【摘要】目的探讨早期,快速检测嗜肺军团茵的方法.方法根据嗜肺军团茵特异的巨噬细胞感染增强子mip基因设计引物,通过聚合酶链反应合成一段特异的260bp长链DNA探针,采用反向斑点杂交法检测生物素标记细茵DNA,并应用于痰标本的检测.结果所合成的2.60bpDNA探针具有高度特异性,只和嗜肺军团茵杂交,与其他细茵,真茵
2、,病毒无交叉反应,该探针最低可检测出1ng的细茵DNA.杂交法和培养法分别检测100份痰标本,两者的阳性率分别为8%和2%.结论该方法快速,特异,对嗜肺军团茵的早期诊断具有较高的应用价值.【关键词】嗜肺军团茵DNA探针杂交Rapid0nofI~ioneUa咖ilabyl,el鬻Dot—blothybridi~mtionFan胁饥,啦,Yu胁,砖.及of脚豳n,棚蹦,SouthMed/ca/,cll彻510282[,~traetlObjectiveToexplorearapidmethodforthedetectionoflegionellapneumophil
3、a.MethodsApairofprimersweiE~designedaccordingtothemipgeneoflegionelhpneun~phila.Aspecific260bpDNAprobewassynthesizedbyp0lylnE氍Isechainreaetiof1.BacterialDNAla~edwithbiotinandsputumspecimensweredetectedbyreverseDot—blothy—bridizafion.ResultsThe260bpDNAprobesynthesizedwashighlyspecifi
4、c.Theprobeonlyhybndiz~withlegionellapneu—rnophaawithoutcIDssreactionwithotherbacteria,Ilorviruses.Theprobecandetectaslowas1ngofbacteriumDNA.Onehundredsputumspecimenswereidentifiedwiththehybridizationandculturemethod.withapositiverateof8%and2%respec—tively.COqW.IU~OI1311ismethodisofl
5、lishvalueinrapidandspecificidentificationoflegionellapneumophila.【lwords】Ie_~ionellapneumophilaDNAprobeHybridization嗜肺军团菌(1egionellapneurnophila,LP)是下呼吸道感染最常见的致病菌之一,军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最重的一种,未经有效治疗者其病死率高达45%,因此,早期诊断该种病原菌并及时治疗非常重要.军团菌生长缓慢,在普通培养基上生长困难,培养时间长,所需条件苛刻,而且培养阳性率较低,目前临床上常用的诊断方法是免疫
6、学检测.但由于部分抗体形成较晚,双份血清标本抗体滴度的变化至少需要1周以上的时间等原因,免疫学方法敏感性和特异性欠佳,达不到早期诊断和及时治疗的目的,通常只用于回顾性诊断和流行病学调查.我们利用嗜肺军团菌编码巨噬细胞感染增强子特异的mip基因,建立了一种通过斑点杂交检测该细菌的方法,为嗜肺军团菌感染的早期快速诊断提供了依据.1材料与方法1.1材料I.I.I菌株和临床标本来源嗜肺军团菌,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,卡它莫拉菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌及铜绿假单胞菌的标准菌株均购自中国药品生物制品检定所.白色念珠菌和乙肝病毒DNA,由本院细菌室和传染科提供.100份
7、社区获得性肺炎患者*广东省社会发展攻关基金(编号:2002c30405)(CAP)的合格痰液标本来自本院呼吸科,这100例CAP患者的诊断符合中华医学会呼吸病学分会1999年制定的诊断标准L.1.1,2PCR引物的设计与合成经参考有关文献L和Cenebank检索后,根据嗜肺军团菌编码巨噬细胞感染增强子特异的mip基因设计引物,上游引物为5一GCAATGTCAACAGCAA一3,下游弓I物为5一GC.TAGCG'ILTIV.CA'IG一3,扩增产物的长度为260bp.引物委托上海生工生物工程公司合成.1.1.3主要试剂琼脂糖,dN'FP,TaqDNA聚合酶,DN
8、A梯度Marker均购自大连宝生物工程
