公共场所嗜肺军团菌污染状况调查分析

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1、公共场所嗜肺军团菌污染状况调查分析［摘要］目的应用PCR技术对奉贤地区部分公共场所空调冷却塔水及其他环境（淋浴设施等）进行军团菌污染状况调查。方法于2010年5月和10月，分别采集中央空调冷却塔水样品及环境样品用聚合酶链（PCR）对其进行嗜肺军团菌检测，同时用常规法进行分型鉴定。结果釆集的125份样品中，PCR法检出嗜肺军团菌45份，阳性检出率为36%,水样检出率远高于环境（分别为67.19%和3.28%）。在检出的59株军团菌中共鉴定出6种不同菌型，其中LP1为重点菌型，占50.85%。且在同

2、一样品中检出不同菌型有2株以上的占35.29%0结论奉贤地区中央空调冷却塔及坏境中存在军团菌污染，需引起重视，以防止军团菌所致的疾病暴发或流行。军团菌是一种革兰阴性杆菌，能引起急性呼吸道传染病「］，军团菌已被发现存在40个种,60多个血清型。经流行病学调查研究，这种细菌存在于各种自然界水源以及空调水管道，供水系统等人工水源中，在引进空调冷却塔做冷却水时，随空调器把细菌散布于室内空气中，被人吸入而引发肺炎。我国自1982年南京首次证实军团菌病例以来已有多起军团菌爆发流行［2］,上海在近儿年内也从患

3、者和环境屮分离到军团菌［3］。而上海地区健康人血清抗体水平调查也证明军团菌早已存在，并对人群构成潜在威胁［4］。近年来从军团菌的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已达到不容忽视的程度，因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。目前用于军团菌检测的常规培养约7〜10d,不仅花费大量时间和精力，还具有敏感性、特异性差的缺点，且操作复杂，易造成漏检和误检。分子生物学技术的发展为军团菌检测提供了新的契机，该课题应用聚合酶链（PCR）技术，检测环境小的军团菌，以分析奉贤地区军团菌的污染状况。1.材料与方法1

4、.1材料1.1.1实验菌株大肠埃希菌（ATCC25922）、肠炎沙门菌（ATCC13076）均购于美国典型微生物菌种屮心保藏屮心提供标准菌株。米克达德军团菌、杜莫夫军团菌由市疾控屮心提供。1.1.2样品来源2010年分别在5月和10月以单纯随机抽样方式选取奉贤地区具有集中式中央空调设备的各大型超市，酒店共10家。以无菌方式采集空调冷却塔水于无菌广口瓶中，每件约200ml（根据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》），共采集64件。以沾湿生理盐水的棉签反复涂抹空调出风口以及酒店浴室莲蓬头出水口表面，

5、剪去棉签接触手部位，将棉签置5ml生理盐水中，共采集61件，采样后即送实验室检验。1.1.3培养基GVPC平板由柯玛嘉公司提供，血琼脂平板，各反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。1.1.4诊断血清军团菌诊断血清由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。1.1.5PCR扩增仪TechneFlexigene；全自动数码凝胶成像系统TanonGIS・2010。1.1.6PCR试剂盒嗜肺军团菌（LP）PCR检测试剂由上海健益生物科技有限公司提供。1.2方法1.2.1分离培养鉴定

6、样品经负压过滤后，剪碎放入蒸馅水屮，混合振荡后吸取1毫升进行酸处理，静置5分钟后同时接种GVPC平板和血平板.36°C,5%CO2培养72h后进行鉴定［5］。1.2.2PCR检测方法样品经负压过滤后，剪碎放入5ml蒸锚水屮，混合后取500pl,12000rpm/min离心5min,弃上清液,加lOOpIDNA提取液入沉淀中,振荡混匀,置100°C水浴加热10min,12000rpm/min离心5min,保留上清液待用。取4上清液加入26plPCR反应液中，同时做阳性对照。振荡混匀，将PCR反应管

7、放入PCR扩增仪中。首先预变性94°C5min,然后按94°C30s、55°C30s、72°C60s循环35次，最后72°C延长5min。取15pl的扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中进行电泳，然后用凝胶成像系统进行分析。1.2.3PCR特异性试验以嗜肺军团菌DNA作为阳性对照，以其他菌株DNA作为干扰菌进行PCR特异性检测。1.2.4测序验证将PCR结果阳性的样品扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序验证。2结果2.1PCR检测结果2.1.1PCR反应和测序验证一共采集125份样品进行嗜肺军

8、团菌的检测，有45份样品检出阳性。经上海生工生物工程有限公司测序验证，送检的阳性样品扩增产物确认为嗜肺军团菌,见图1。2.1.2PCR特异性引物只与嗜肺军团菌发生阳性扩增，扩增长度为430bp,其他菌没有扩增产物，具有很好特异性，结果见图2。M:100bpDNA标准带；1:嗜肺军团菌;2:阴性对照;3:肠炎沙门菌;4:米克达德军团菌;5:大肠埃希菌;6:杜莫夫军团菌图2嗜肺军团菌特异性检测情况2.1.3样品检测情况用PCR检测的125份样品中，水样64份，环境样品61份，水样的阳性检出率远远高于