解淀粉芽孢杆菌b9601y2抗性基因标记及其在作物根部的定殖能力

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第31卷第3期华中农业大学学报Vo1．31No．32012年6月JournalofHuazhongAgriculturalUniversityJune2012，313~319解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2抗性基因标记及其在作物根部的定殖能力王志远吴兴兴吴毅歆毛自朝何月秋。1．农业生物多样性应用技术国家工程研究中心，昆明650201；2．云南农业大学农学与生物技术学院，昆明650201摘要以质粒pMarA转入解淀粉芽孢杆菌植生亚种B9601-Y2菌株，获得了卡那霉素抗性标记遗传稳定的菌株Y2一pMarA。采用浇灌法、拌种法和浸根法接种大白菜，并用浇灌法接种烟草，观察菌株在大白菜和烟草根部的定殖与消长动态。结果表明：通过10#g／mL卡那霉素的LB平板和PCR方法，证明标记菌株Y2一pMarA均能在植株根际、根表和根内定殖。在播种时浇灌大白菜37d后，在自然土处理中根际土、根表土和根内菌量分别为浇灌7d后菌量的94．31、95．O0和84．75，在灭菌土中则分别为75．26、84．92和177．74；在拌种处理大白菜时，自然土处理中根际土、根表土和根内菌量分别为拌种7d后菌量的94．44、95．27和6l_O6，在灭菌土处理中则分别为75．64、9O．91和69．O6；在浸根10min后移栽，标记菌株能在大白菜根际土壤中扩散和进入根内；至移栽后33d，自然土处理中根际土、根表土和根内菌株定殖密度分别为6．28×10、9．54×10和4．69×10。cfu／g~灭菌土处理中则分别为6．97×10、1．12×10和1．02×10cfu／g。关键词穿梭质粒；标记菌株；定殖；生防菌株中图分类号S482．292文献标识码A文章编号1000—2421(2012)03—0313—07植物病害的生物防治是实现农业可持续发展的1材料与方法重要措施。有益微生物在作物根际定殖能力的强弱决定着其应用效果的高低，检测微生物在作物根际1．1供试材料和土壤中的消长规律是确定生防菌株防治潜力的重芽孢杆菌Y2菌株是由笔者所在实验室分离保要依据_1]。随着微生物分子生态学的进展，特别是存的菌株；质粒pMarA由德国Borriss教授惠赠。基因标记技术的应用已为生物农药的理论研究提供试验用土取自云南农业大学实验农场，类型为红壤。了有效手段_4J。将土样过筛除去石块、枯草等杂物后装人花盆中(直芽孢杆菌B9601一Y2(简称Y2)是从小麦的根际径30cm，高15cm)；另取部分土样于121℃湿热分离到的1株有益菌，现已通过分子技术将其鉴定灭菌60min，再按同样方法装入花盆中。供试作物为解淀粉芽孢杆菌植生亚种(Bacillusamylolique—为大白菜(青岛83—1)和烟草(云烟85)，将种子表面facienssubsp．plantarum)[。芽孢杆菌B9601一Y2经消毒和冲洗后，吸去多余水分，自然晾干备用。菌株能促进植物生长和植株插条生根，同时还能抑1．2质粒pMarA转化及转化子筛选制真菌性、细菌性和线虫性病害。笔者利用适合在质粒pMarA的提取[6根据上海生工质粒试剂芽孢杆菌中复制与表达的穿梭质粒pMarA，通过电盒所提供的程序进行。参照Wuenscher等_7]的电转化将其转入芽孢杆菌B9601一Y2菌株，并以抗性转化法，利用基因电转化仪(Electroperator2510，基因标记分析Y2菌株在大白菜和烟草根部的定殖Eppendorf)将质粒pMarA转入Y2菌株。用500与消长动态，旨在为研究该菌株防病促生长的作用L过夜培养的Y2菌液接种到50mLLBSP培养机制和将其作为生物制剂的开发与应用提供科学基(1×LB，250mmol／L蔗糖，5Ommol／L磷酸钾，依据。pH7．2)中，菌株生长到指数生长期，通过离心收集收稿日期：2011—04—08基金项目：国家自然科学基金项目(30660007)和科技部国际科技合作项目(2o09DFA3236O)王志远，博士研究生．研究方向：植物病害生物防治．E-mail：yuan33441@sina．COrn通讯作者：何月秋，博士，教授．研究方向：植物病害生物防治．E-mail：ynfh2007@163．corn 314华中农业大学学报第31卷细胞并用SHMG培养基(250mmol／L蔗糖，出，各重复取1株，共取4株。1mmol／LHEPES，1mmol／L氯化镁，质量分数2)烟草。浇灌法处理后1Od(即长出第1片真1O的甘油)洗涤培养基中的盐分，然后用1mL叶后)开始取样，每5d取样1次，共取样7次，即播SHMG重悬菌体。用500ng质粒(约5uL)~Iek到种后1O、15、2O、25、3O、35、40d取样调查根际土、根100L上述悬浮细胞中，混合并放置冰上20min。表土及根部组织。取样时将烟草植株轻轻地从土中将混合液转人至预冷、灭菌的样品杯(0．2cm电极拔出，各重复取1株，共取4株。间距)中。电转化的条件为电压1750V，电容25根际土：取拔出的植株苗，充分抖动植株，收集F。转化后细胞悬浮于900txLLBSP培养基中，抖落的土壤，称质量后置于装有50mL无菌水的三37℃下200r／rain振荡2h，然后涂布于LB平板上角瓶中，摇床上100r／rain振荡30min。(含lOt~g／mL卡那霉素)，并于37℃下过夜培养。根表土：将采过根际土的植株根系剪下称质量，依据质粒pMarA中的卡那霉素抗性基因序列置于装有50mL无菌水的三角瓶中，在摇床上100设计检测引物对KmpmarA1／2(KmpmarA1：5r／rain振荡30min后取出，用吸水纸吸尽根周围的TCCGTCGATACTATGTTATACG一3：Kmpmar水分后再称质量，2次质量之差即为根表土质量_9]。A2：5'-TATGGACAGTTGCGGATGTAC一3)，以根内：将称质量后的根系用0．1升汞消毒3～PCR方法检测与确定转化子，并以野生型菌株Y25min，分别用20mI无菌水冲洗3次，再用吸水纸为对照。吸尽根系表面水分后至研钵中充分磨碎。组织磨碎1。3菌株质粒稳定性测定后用20mL无菌水转入三角瓶中，再用10mI无菌参照钟晓东E。]的方法进行。将0．19／6过夜活化水冲洗研钵，一同转入三角瓶中，共冲洗3次。菌株，接种无抗生素的LB液体培养基，于3O℃下取处理好的土样或根组织的悬浮液，按稀释平200r／rain培养5h，再取样以0．1接种无抗生素的板法逐级稀释，再分别移取样品200I均匀涂布于IB液体培养基，培养条件相同，如此重复培养50h。卡那霉素(10ug／mL)的LB平板上，于30℃条件然后涂布无抗生素LB平板，随机选取300个克隆下培养20h后，分别统计平板上的菌落数。每个处转入含10t~g／mL卡那霉素的LB平板，以抗性菌株理3次重复。定殖密度的计算公式：所占百分比来计算菌株质粒的遗传稳定性。定殖密度(cfu／g)一(同一稀释梯度3次重复的1．4标记菌株的接种平均菌落数×稀释倍数)／f4品质量将标记菌株用LB培养液培养，接种时菌体浓2结果与分析度为1×10cfu／mL。方法分浇灌法、拌种法和浸根法3种。浇灌法：每盆播种100粒种子后，在种子2．1Y2菌株转化子的获得附近施入菌悬液1mL，再覆盖厚约1cm的土壤，置利用电转化法使质粒pMarA转化解淀粉芽孢于温室中培养；拌种法：将种子置于含1甲基纤维杆菌Y2菌株，并通过抗生素平板筛选转化子，同时素的菌悬液中拌匀，晾干后播种，每盆播种50粒；以PCR检测转化子的质粒和菌体(图1)，证实质粒浸根法：幼苗长至5叶期时，用菌液浸根10rain，再pMarA成功地转化了Y2菌株。转化菌株命名为将植株移植到方盘中，每盘50株。3种接种方法均Y2一pMarA，即作为标记菌株。以液体培养基处理为对照，重复3次。2．2质粒遗传稳定性的检测1_5定殖能力的测定将标记菌株Y2一pMarA在不含抗生素的LB上1)大白菜。浇灌法与拌种法处理后7d(即自连续稀释培养10次，每隔5h取样涂布在不含抗生长出第1片真叶后)开始取样，此后每3d取样1次，素的培养基上，再随机挑取300个菌落于卡那霉素共取样11次，即播种后7、1O、13、16、19、22、25、28、LB平板上检测。结果表明，随着培养代数的增加，31、34、37d取样调查根际土、根表土及根部组织；稳定性下降。在5h内稳定性为100，10h为浸根法在移栽后3d开始取样，此后每3d取样99．67，至50h稳定性仍达9O．679／6(图2)。按在1次，共取样11次，即分别于浸根处理后3、6、9、12、实验室条件下芽孢杆菌分裂1代通常需要20～l5、l8、21、24、27、3O、33d取样调查根际土、根表土3omin计算，Y2-pMarA菌株连续分裂100～150及根部组织。取样时将大白菜植株轻轻地从土中拔代，其稳定性仍达91；按在土壤中分裂1代所需 第3期王志远等：解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2抗性基因标记及其在作物根部的定殖能力315时间为50~100h计算[如]，如果Y2一pMarA菌株在土壤中能生存，那么其中的质粒至少在120d内是，稳定的，这一稳定性应能满足试验需要。bp每001904981584961375949294790888684O5l015202530354045501：DNAmarker(＆0RI+HindⅢ)；2：阳性对照(pMarA)；3，4：转化子质粒；5，6，8：转化子菌落；7：阴性对检测时间／hDetectiontime照(B9601一Y2)。1：DNAmarker(EcoRI+HindⅢ)；图2Y2-pMarA菌株的质粒稳定性2：Positivecontrol(pMarA)；3，4：PlasmidfromtheFig．2StabilityofplasmidinstrainY2一pMarAtransformants；5，6，8：Transformantcolonies；7：Nega—2．3Y2一pMarA菌株在大白菜根部的定殖tivecontrol(B9601一Y2)．1)浇灌法接种测定Y2一pMarA菌株在大白菜图1引物为KmpmarA1／2转化子的PCR检测根部的定殖与消长动态。利用浇灌法接种处理的Fig．1PCRdetectionofthetransformantsY2一pMarA菌株在定殖的试验过程中表现为先上升withprimersKmpmarA1／2后下降的趋势(表1)。表1浇灌法接种Y2一pMarA菌株在大白菜根际、根表和根内的定殖密度Table1ColonizationnumberofY2一pMarAinrhizosphereIrootsurfaceandinnerrootofChinesecabbagebydrenching10du／g自然土处理中，根表土在播种19d后菌株定殖2)拌种法接种测定Y2一pMarA菌株在大白菜密度就达到最高水平，为1．73×10。cfu／g，而根际根部的定殖与消长动态。与浇灌法相比，拌种法接土和根内则在22d后分别达到1．34×10cfu／g和种处理的菌株定殖量总体上略低些，但变化趋势与1．92×lOcfu／g；灭菌土处理中，根表土和根内的浇灌法相似，即先上升后下降(表2)。在播种19d定殖密度也在19d后达到最高水平，分别为2．58×后根表土与根内菌株定殖密度达到最高水平，在灭10。cfu／g和3．58×10cfu／g，根际土到25d后才达菌土处理中分别为3．18×10cfu／g和3．80×10到2．31×10cfu／g。整个过程中根际土、根表土和cfu／g，在自然土处理中分别为2．13×10cfu／g和根内均回收到菌株，而且至37d后菌量仍保持较高1．89×10cfu／g，而自然土处理和灭菌土处理的大水平。在自然土处理中，其定殖密度分别为9．62×白菜根际土分别在播种22d和25d后菌株定殖密l0、1．14×1O、4．39×10cfu／g，分别达到第1次度才达到最高水平，分别为1．70×10cfu／g和取样7d后菌量的94．31、95．OO和84．75；在2．85×10cfu／g。直至37d后，在自然土处理中，灭菌土处理中，其定殖密度分别为14．34×10、根际土、根表土和根内的定殖密度仍达第1次取样1．51×1O、11．55×10cfu／g，分别达到第1次取7d后菌量的94．44、95．27和61．06，而在灭样7d后菌量的75．269／5、84．92和177．74。在菌土处理中，其菌量则为75．649／6、90．91和整个过程中，灭菌土处理中的菌量高于自然土处理。69．06 316华中农业大学学报第31卷3)浸根接种法测定Y2-pMarA菌株在大白菜度达到最高水平，为1．58×10cfu／g，而灭菌土处根部的定殖与消长动态。与上述2种方法相比，浸理15d后菌株定殖密度就达到最高水平，为3．16×根法接种的根际与根表菌株定殖密度表现出不同的10c{u／g。至移栽后33d，自然土处理的根际、根表趋势，即一直维持在较高的水平，定殖动态变化不明与根内菌株定殖密度分别为6．28×10、9．54×显；根内菌量相对偏少，移栽后12d才能检测到菌10、0．47×10cfu／g，灭菌土处理的根际、根表与体，其动态变化和浇灌及拌种相似，即呈现先上升再根内菌株定殖密度则分别为6．97×10、11．17×下降的趋势(表3)。自然土处理24d后菌株定殖密1O、1．O2×10cfu／g。表3浸根法接种Y2-pMarA菌株在大白菜根际、根表和根内的定殖密度Table3ColonizationnumberofY2。pMarAinrhizosphere，rootsurfaceandinnerrootofChinesecabbagebysoakingroot10cfu／g2．4Y2一pMarA菌株在烟草根部的定殖菌株在自然土和灭菌土中的定殖动态近似，根在烟草播种后，浇灌Y2一pMarA菌悬液，从第际和根表在初期有较高的定殖密度，随后出现短暂1次取样开始均能连续从烟草根际土、根表土回收下降，此后再上升，后期则出现明显回落。至40d到标记菌株(表4)。根内在灭菌土处理20d和自然后，在自然土处理的根际土、根表土和根内菌株定殖土处理25d后才能回收到标记菌株。根际和根表密度分别为3．64×10。、2．54×10。、0．68×10。cfu／g，的菌株定殖密度保持在1．84×1O。～1．53×10灭菌土处理的菌株定殖密度分别为4．16×1O。、c{u／g的水平，根内保持在6．78×10。～4．04×l0。6．55×10。、1．OO×10。du／g。从总体定殖数量来cfu／g的水平。看，自然土中菌株数量均低于灭菌土。 第3期王志远等：解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2抗性基因标记及其在作物根部的定殖能力317自然土Naturalsoil灭菌土Sterilizedsoil播种后取样天数／dSamplingdaypostseedingInnerrootRhizosphereRootsurfaceIn⋯n．errootRhizosphereRootsurfacelOl5．410．O02艘2．O2嚣0．O0157．500．O08．990，O02O1O．230．O09．491．24252．851．0511．341．043O1．841．136．743．05355．2O4．048．822．26403．640．684．161．O02．5回收菌体的检测与验证增到与卡那霉素抗性基因大小一致的条带(图3)，从大白菜和烟草定殖试验中历次回收保存的菌即在抗性平板上获得的菌株，均为标记菌株Y2一株中，随机挑取部分菌株培养，其培养性状与野生型pMarA，证明采用抗性质粒转化野生型菌株Y2用菌株无差异，部分回收菌株经PCR验证后，均能扩于该菌株定殖研究是可靠的。bp000000l|瓣||750500||瓣泳道1；2000plusmarker；2～8：大白菜定殖回收菌；9：野生型菌株Y2；10～13：烟草定殖回收菌Lane1：2000plusmarker；2-8：RecoveredstrainsofChinesecabbagecolonization；9：Wild-typeY2；10—13：Recoveredstrainsoftobacoocolonization．图3大白菜和烟草定殖试验中回收菌的POR检测Fig．3PCRdetectionofrecoveredstrainsincolonizationtestofChinesecabbageandtabacoo度，不但耗时较长，而且获得的抗性菌株稳定性较3讨论差[1718]。本试验利用质粒载体上的卡那霉素抗性基长期以来，芽孢杆菌的转化一直是困扰其遗传因作为筛选标记，排除土壤中杂菌的干扰，分析了生研究的一个难题。尽管有转化成功的报道，但转化防菌Y2在根部的定殖动态，且具有较好的重复性。的方法没有广泛适用性，这极大地制约了多种芽孢随着植物促生根际细菌研究的兴起，越来越多杆菌尤其是具有生防作用芽孢杆菌遗传转化研究的优良性状的菌株从实验室研究阶段进人大田应用阶进展[1。本试验采用枯草芽孢杆菌的经典Spizizen段。然而在自然条件下，时有应用效果不佳的情况转化方法E]、传统芽孢杆菌的SP培养基转化法和发生，其原因是有土著微生物的竞争或其他不良环电转化法[13-16]均未成功地转化Y2菌株。经过对转境因子的影响[19-20~，因此，定殖能力是影响植物根际化方法不断地摸索和条件的优化，最终利用Wuen—促生细菌能否在大田应用中取得良好效果并最终开scher等[7]电转化法成功获得Y2菌株的转化菌株发为生物农药的重要因素之一。本试验采用携带卡Y2一pMarA，表明Y2菌株具有特殊性。Y2一pMarA那霉素抗性基因的质粒pMarA成功转化具有应用菌株的获得有利于Y2菌株的遗传操作和定殖与开发前景的野生型菌株Y2，且Y2菌株转化子与研究。野生型菌株培养性状没有差异，PCR扩增也证明转基因标记法是将外源基因即标记／报告基因引化是成功的，在实验室证明其分裂100150代后，入到目标菌株中，并在菌体中能稳定遗传，通过检测该质粒仍保持91的稳定性；在温室盆栽试验中，基因表达产物来监测细菌的分布并区别于其他微生即使在浇灌后37d，大白菜根围土、根表土和根内菌物。生防菌在植株根围定殖常用的是用利福平诱导量在自然土处理中仍达到第1次取样7d后菌量的抗性菌株，但该方法需要逐步提高利福平的诱导浓94．31、95．OO和84．75，在灭菌土处理中则分 318华中农业大学学报第31卷别为75．26、84．92和177．74，证明Y2菌株[5]BORRISSR，CHENX，RUECKERTC，eta1．Relationshipof在大白菜根围、根表和根内有很好的定殖能力，并具BacillusamyloliquefacienscladesassociatedwithstrainsDSM7TandFZtM2：aproposalforBacillusamyloliquefaciens有良好的促进生长和防治病害的作用。subsp．amyloliquefacienssubsp．nov．andBacillusamyloliq—根际细菌引人后，能否在作物根部定居、繁殖，uefacienssubsp．plantarumsubsp．nov．basedontheirdis—并同根围固有微生物竞争营养和空间位点，决定了criminatingcompletegenomesequences[J]．IntJSystEvol其在根部的存活能力，从而决定其生防能力[2。研Microbiol，2011，61(8)：1786—1801．究Y2菌株的定殖、消长规律，不仅有助于了解其应[6]BRETONYL，MOHAPATRANP，HALDENWANGWG．InvivorandommutagenesisofBacillussubtilisbyuseof用范围和效果，也有利于揭示其与土壤环境之间关TnYLB1，amariner-basedtransposon[J]．ApplEnvironMi—系。本试验结果表明，Y2菌株的定殖因接种方式和erobiol，2006，72(1)：327—333．时间的变化而变化，其中大白菜浇灌与拌种方式接[7]wuENSCHERMD，KOHLERS，BUBERTA，eta1．Theiap种中，菌株定殖密度均随时间延长而先增长随后降geneofListeriamonocytogenesisessentialforcellviability，低，而浸根接种中Y2菌株定殖密度在根际土和根anditsgeneproduct，p60，hasbacteriolyticactivity[J]．JBac—teriol，1993，175(11)：3491-3501．表土一直保持较高水平，证明Y2菌株不仅能停留[8]钟晓东．锰超氧化物歧化酶(Mn_s0D)基因在野生型芽孢杆菌在根表面，且能在根围中扩散，这也是该菌株能较好(Bacillusspp．)中的转化和表达[D]．北京：中国农业大学图书定殖的原因之一。与播种时浇灌及拌种处理相比，馆，1998．浸根后12d才检测到根内的Y2菌株存在，这从另[9]赵秀香．烟草黑胫病多功能生防菌剂的研制[D]．沈阳：沈阳农一方面证明菌株能在大白菜根内定殖，且经根外进业大学植物保护学院，2006．[103HECKERM，VOLKERU．GeneralstressproteinsinBacillus入有一个时间过程，播种时浇灌和拌种处理，根内部subtilis_J]．FEMSMierobiolEcol，1990，74：197—214．较早出现菌体的原因可能与种子萌发、菌体从根毛[11]信珊珊，祁高富，朱发银，等．1株解淀粉芽孢杆菌发酵条件的组织易于进入根内有关。Y2菌株能在根外和根内优化及其对油茶炭疽病的防效[J]．华中农业大学学报，2011，定殖可能与其具促进植物生长的能力有关_2。从3O(4)：4l1—415．浇灌、拌种和浸根3种施用方法来看，Y2菌株进入[12]SPIZIZENJ．TransformationofbiochemicallydeficientstrainsofBacillussubtilisbydeoxyrIbonuc1eate[J]．ProcNatAcad根内的速度存在差异，浸根处理菌株进入根内较慢，Sci，USA，1958，44：1072—1078．因此，在作为农药施用时宜早不宜迟。[13]唐雪明，邵蔚蓝，王正祥，等．地衣芽孢杆菌感受态细胞的形成Y2菌株能在大白菜和烟草根围、根表和根内定及高效电转化[J]．生物技术，2002，12(4)：13—15．殖的结果表明，该菌株具有较广泛的适应性，但其是[14]彭清忠，彭清静，张惟村，等．短芽孢杆菌的转化方法[J]．吉首否在其他植物根围也有很好的定殖能力还有待进一大学学报：自然科学版，2004，25(4)：35—38．[15]徐敏，马骏双，王正祥．高渗透压对细菌电转化率的影响口]．无步研究证实。从定殖群体数量在自然土中较灭菌土锡轻工大学学报，2004，23(4)：98一100．中少的结果分析表明，Y2菌株定殖能力还受土壤中[16]张献芳，文凯，逯晋忠，等．2株内生细菌在油菜体内的定殖、促微生物种群的影响，因而在农田应用时，为了更好地生长及抗虫性检测[J]．华中农业大学学报，2011，30(2)：143—发挥其促进生长和防治病害的作用，宜适当提高用147．菌量或增加施用次数。[17]张淑梅，王玉霞，李晶，等．基因标记枯草芽孢杆菌BS-68在黄瓜上定殖[J]．生物技术，2006，16(4)：73—74．[18]田涛，亓雪晨，王琦，等．芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小参考文献麦体表定殖的初探[J]．植物病理学报，2004，34(4)：346—351．[19]KLOEPPERJW，SCHROTHMN，MILLERTnEnhanced[1]黄金玲，刘志明，陆秀红，等．根际细菌9个菌株对南方根结线plantgrowingbysiderophoresproducedhyplantgrowingpro—虫的盆栽防效[J]．华中农业大学学报，2010，29(6)：700—703．motingrhizobacteria[J]．Nature，1980，286：885—886．[2]祝明亮，张克勤，李天飞，等．烟草根际厚孢轮枝菌生态效应研[2O]杜立新，冯书亮，曹克强，等．枯草芽孢杆菌BS-208和BS-209究[J]．微生物学通报，2002，29(2)：4-8．菌株在番茄叶面及土壤中定殖能力的研究EJ]．河北农业大学[3]K10EPPERJⅥAreviewofissuesrelatedtomeasuringcolo—学报，2004，27(6)：78—82．nizationofplantrootsbybacterial[J]．CanJMicrobiol，1992，[21]郭荣君，刘杏忠，杨怀文，等．芽孢杆菌BH1防治大豆根腐病的38(6)：667—672．效果及机制[J]．中国生物防治，2003，19(4)：180184．E4]韦兵，唐欣昀．假单胞菌JK45菌株lux基因标记及在土壤中[22]刘拴成，杨进成，马丽华，等．解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2提高的存活[J]．农业环境科学学报，2006，25(6)：1524—1528．玉米生长和产量的效应[J]．玉米科学，2010，18(6)：28—32． 第3期王志远等：解淀粉芽孢杆菌B9601一Y2抗性基因标记及其在作物根部的定殖能力319ResistancegeneslabelingandcolonizationabilityofabiocontrolagentB9601一Y2ofBacillusamyloliquefaciensincroprhizospheresWANGZhi—yuanWUXing-xingWUYi—xinMAOZi—chaoHEYue—qiu’1．NationalEngineeringCenterofAgriculturalBiodiversity，Kunming650201，China；2．CollegeofAgronomyandBiotechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，ChinaAbstractThekanamycin-resistantlabelingstrainY2-pMarA，whichhasagoodstabilityofgenet—ics，wasgainedbyelectrotransformationofshuttleplasmidpMarAintoBacillusamyloliquefacienssub—sp．plantarumB9601一Y2．Chinesecabbagewasinoculatedbydrenching，coatingseeds，soakingrootandtobaccobydrenching．Theresultsshowasfollows：LBagarplatecontaining10／~g／mLofkanamycinandPCRprovedthatY2一pMarAcouldcolonizeinrhizospheresoil，rootsurfaceandinnerroot．Afterseedingfor37d，theChinesecabbage，underthenaturalsoilcondition，colonizationnumbersofrhizo—spheresoi1，rootsurface，andinnerrootofnaturalsoilwere94．31，95．00and84．759／6ofseedingfor7drespectively；thecorrespondingratiosinsterilizedsoilwere75．26，84．92and177．74re—spectively．IntheChinesecabbagewithcoatingseeds，theratiosofcolonizationnumbersofrhizospheresoil，rootsurface，andinnerrootofnaturalsoilwere94．449／6，95．27and61．06ofseedingfor7drespectively，whiletheywere75．6，9O．9and69．1insterilizedsoilrespectively．BytransplantingChinesecabbageseedlingssoakedfor10min，Y2一pMarAstraincouldexpandintothesoilandentertherootsoftheplant．Aftertransplantingfor33d，thecolonizationdensityintherhizospheresoi1，rootsur—faceandinnerrootinthenaturalsoilwere6．28×10。，9．54×10and4．69×10。cfu／grespectively；whilethecorrespondingdensitywere6．97×1O，1．12×10。and1．02×10efu／ginsterilizedsoilrespec—tively．Keywordsshuttleplasmid；labelingstrain；colonization；biocontro1agent(责任编辑：陈红叶)