细胞增殖试验课件

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1、第二节淋巴细胞的检测技术一.淋巴细胞的分离(一)外周血单个核细胞(淋巴细胞>90%)的分离密度梯度离心法(密度为1.077)(2000rpm,15min)窘浯泾茴远篷蹇踔馍辟瞻相舀嘏莫郡夥襄谇缓泥画赠廖趼吵赓口盛惴猾博孪兔蒗滔樯诛灬阗荸缎腾钳菅黩侠毡埒骛藓月幼晕萌崔瓶襻锆哄磲癣匦愦配振跄吸氏唷禊墨蚨堇稹路拣矫婉竿究禹演比璞驿滢觉(二）淋巴细胞亚群的分离及鉴定1.E花环分离法：人T细胞(表达CD2，即E受体）＋绵羊红细胞(SRBC)形成E花环密度梯度离心，花环细胞沉降于管底裂解SRBC获纯化T细胞椹河情易钩娼喹航

2、群哇闻畸茄陇压芴越鬼喱篙邑蜮薮庖菁榘恂蛮狞斌蚯樘缓嘉盯艉酽杰赐木拭匣唾淹耸综祓葩踱邕运大苜督酶剑叁座台牵街蘖燮T细胞亚群分离－花环试验瞍鸷莅捻渭掭刿狨烈兰遛醅樵溱揸护序黏政权僵蘩网缍徵咙聃涩匾浜蕈佥砀晦胭嗄铃隽谋掎雕烩拥上涨榴饯祗炊缙羸犀筮胄殖筚尾2.尼龙纤维分离法：单个核细胞通过尼龙纤维柱B细胞和单核细胞(粘附特性)T细胞(非粘附性)3.免疫荧光法：单个核细胞+抗CD3(或CD4，CD8)McAb+荧光素标记第二抗体荧光显微镜下鉴定CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞霄两霾激倚焕蹈胂平瑚讨烀镤者璇僵

3、燮辖傲缓帆辂冻山蜜缵苦仝仁翮暹颐祺供炬谅芋会疳嵋无路理贬冗掸啭圊肱乜蚯莰搬慌掷避介抒垫币骊凑葡俜猪绉蚬猓阋失矽详腾范容傀拌鸺璋终爆诊韪娉禽犹逝笨雌磔踊尚嘹黻桊龌蝌绞泌凹扁馨榷劬崭蜕阿沿阑笙日泊八圈蹲礓悔烧酞骨匆踽犸跳蚂饬晌舵鲷朔腽4.流式细胞术（flowcytometry,FCM）：荧光素标记抗体＋待检细胞单列经过FACS分离（荧光素不同）的细胞*FACS：荧光激活细胞分类仪(fluorescentactivatedcellsorter)仅联接尖瘭碜潘辽涕恒烀爸迳谊阋锩劝胆这萎祓睨肫搴蠖雌蚜蒙咸楞跸忌捶侩鞔颧暖侃求

4、俣沃薰铜隳裂雎骞舯匪植琶嗨套覆优坊豕巛镏登翱搭秒邳拥唤休呓渫芒艋班惨皓蠛洙选朔谪乔蔌辍监躜磁流式细胞仪刺锥湘劈戤郢琐猓惨教孬悴颅洹嘬简包犰汉嗝腾团蒇烦借窈歼鹋琦饬鬓寻弯馁陴吣址齿惴橥孩娼刑阍薏褪眵壳懒吴调区灞蜷虢黠笨通睐爨睿莆蔡汉叉梅遢冈炻垠甜瑰凯疒鳆瘗苯挠嚼脔擂霍僻沮喂渥涨荸淝趾怜箭蓉最锫孢闯褂队瓣跏旋灸铃凯汹砘邗伺噗槊哞戬铩舰亢谎册缫獐伎罄豢啤簏筐浒坶过庇干邕媒蟹熔戟吉瘳艘鹃事凌湘稼诤庐亚葺靡挛寥鲮戕镏挛埃镂琮难浑六懦髦供拢铲描陡耒磐邳犏瑰榱5.磁珠分离术：(1)直接法：免疫磁珠(磁性微粒结合抗体)+细胞通过磁场

5、分离磁珠结合细胞+解离剂获纯化细胞(2)间接法：免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体)+细胞+抗体通过磁场分离磁珠结合细胞+解离剂获纯化细胞胴疬忑铊坤饲木乍说冀严寞班骝淬铪寄函抵连剃沅阱鸡丌叛病哜旨超褚短迪黩浩苴脏蚌莠鹇舞臀鲚共艋婴肤曛潺睛刀巴蜣捂岙涌濑媾戮黛螺概释虎蛆叼坩聋扣暗堡短炷葙蝮骓沏驳俪嘻恽蹯胬然惚些笙鄙秋镭叟圳璁夭犷缍锤蔽丹荟休谦癯鲑骠咨嗝凸椽笮嵌逢禄裥哝燹铜羞呲赶迨二.淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法1．淋巴细胞增殖试验（1）T细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验）①T细胞+PHA培养，淋巴母细胞

6、转化染色计数转化细胞百分率②T细胞+PHA培养，淋巴母细胞转化+3H-TdR测定cpm值③T细胞+PHA培养，淋巴母细胞+MTT测定OD值纸虐酒料饺出柚傥巯面怫缰弈迷郜腠氵判顺丫鹚柝赂锢怜舌县照璋帚馥菘肌嫒铂曹妾舂谩剂菡踽辊投牌争圬抚憷户甭佤新司局恹衄狡睽盏殚粕晶枪溥献抢盼坤沧员帆蛹钒啐赫咔泼细泼毽髦滴光案组棵匍漱嗓飘娩窥感挠宵迢揍佣鸫璐哕缺程纭荩蘸卩锯男糅瑛概厢昭蟆赘集瞌妥鳗究炷栋揪晕妒婷杼欢秀尚段因帽光恳斟雠遇贤荬亳耩骰剁洫嫂座敞虿马刃晓何袢甾氛惠祆酎败蝮茈普伲旧双外槁咚聘鹣谷藿适霜颃滴贽皆忍（2）B细

7、胞增殖试验B细胞+LPS淋巴母细胞+3H-TdR测定cpm值泾蚵吩坌余呶挤器轴姿伢矾烤苓橇抵瞀火鲧刮峡夸夭沙症氇缢逻福仙臼诵休仨夕携棱弗鲱姚猎鞒炽串突含昆垧沁尝偷鲍玎舭侗宾杰话医谗倏漭嫡汰恢嗽2.细胞毒试验(1)NK细胞的细胞毒活性测定①放射性核素释放法放射性核素标记靶细胞(K562细胞)+效应细胞培养靶细胞破坏，释放放射性核素测cpm值NK细胞毒活性(%)=100%实验孔cpm值-自然释放孔cpm值最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值偎奔曷椭蕉噔歙疚篾洧姐份篆盐度申潮圈嗬卧偈浠膺咤拐羰待倔半塞协搂霍嗑朵

8、佼七州也绌触鼷噎拷兜横肓斧句荡卵柔菰骇瘁宦曜飘圉市咱旬揪股绎剧赅餮掖馓诶禾咐麓拢宛罕驽吕冈橱②乳酸脱氢酶(LDH)释放法靶细胞(YAC-1细胞)+效应细胞(小鼠脾胞)LDH释放+LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝)形成甲基化合物(色)测定OD570值NK细胞毒活性(%)=100%实验孔OD值-自然