端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验

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1、端粒酶反义寡核苷酸诱导肝癌细胞凋亡的实验【】目的研究端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞株的凋亡诱导作用及其机制。方法以人肝癌细胞株smmc7721、正常肝细胞株l02为研究对象，采用trapelisa法对肿瘤细胞端粒酶活性进行定性定量分析；细胞形态学、tunel染色、dna琼脂糖凝胶电泳观察端粒酶反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用，用流式细胞仪对细胞周期进行时相分析，mc7721，正常肝细胞株l02，购自中科院上海细胞生物技术研究所。1.1.2trap反应试剂、tunel检测试剂、ancs15r低温离心机，perkinelmerg

2、enepcr仪，mk2酶标仪。1.2方法1.2.1端粒酶反义dna的设计选择近端粒酶rna模板区的20个核苷酸为反义靶位，设计合成端粒酶反义dna序列、正义序列、随机序列，见表1。硫代反义dna由中科院上海细胞所合成与纯化，纯度达98%以上。表1端粒酶模板区反义、正义及随机序列（略）tab1thesequenceofsense,antisenseandcontrolscrabled1.2.2trappcrelisa检测肿瘤细胞端粒酶活性［3］。1.2.3合成dna对肝癌细胞端粒酶活性的影响1×106smmc7721培养于nun

3、clon24孔板，培养液1ml含10%热灭活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，培养条件为37℃、5%co2。正义、随机、反义dna终浓度为10μmol/l，以pbs为对照，作用时间分别为12、24、36、48、60h，培养结束后胰酶消化，pbs洗2次，trapelisa法定量测定端粒酶活性，每一dna设3复孔。进一步观察倍比稀释后的端粒酶反义dna（浓度为10、5、2.5、1.25μmol/l）作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。1.2.4凋亡研究(1)tunel染色观察细胞染色及细胞调亡4×105/ml培养

4、细胞种植于12孔细胞培养板，不同寡核苷酸作用14天后pbs洗涤2次进行细胞爬片，按tunel试剂盒说明对细胞进行固定、通透、标记反应，苏木素染色，封片，拍照。(2)流式细胞仪细胞周期分析1×104细胞经5μmol/l反义dna作用14天的细胞进行细胞周期时相分析。(3)dna抽提及电泳将1×106经反义dna作用14天的细胞移入1.5ml离心管，加裂解液及蛋白酶k，55℃水浴20min，加rna酶10μl作用2min，酚、氯仿异戊醇各抽提1次，加3m乙酸钠、无水乙醇沉淀dna，3000g离心10min，气干，te溶解沉淀。取抽

5、提好的dna5μl，在1.8%琼脂糖凝胶、5v/cm电压下，电泳3h，以hindⅲ酶切的λdna为分子标志，302nm紫外光透照并照相。1.2.5mc7721肝癌细胞（以未作任何处理的smmc7721阴性对照），裂解液裂解，蛋白产物进行sdspage电泳（15%浓缩胶，5%分离胶），电泳产物半干电转移至nc膜上（转移时间p21为45min，cyclind1、cdk2为1h），50g/l脱脂奶粉室温封闭4h，tbs漂洗3次，分别加入抗小鼠cyclind1，抗兔cdk2、p21单克隆抗体及作为内参照的βactin单克隆抗体，4℃过

6、夜反应，tbs漂洗3次，再加入相应二抗，室温反应4h，tbs漂洗3次后，dab显色。1.3统计学方法方差分析,p0.05为差异有统计学意义。2结果2.1合成反义、正义、随机序列dna作用不同时间对肝癌细胞株smmc7721端粒酶活性的影响10μmol/l合成端粒酶反义dna对肝癌细胞端粒酶活性具有显著抑制作用，这种抑制作用开始于12h，60h端粒酶活性被完全抑制，而正义链及随机链对细胞端粒酶活性无显著影响，见表2、图1。表2合成dna对smmc7721细胞端粒酶活性的影响（1×106/ml）（略）tab2theeffectio

7、nofsynthesiseddnaontelomeraseactivity（1×106/ml）：thedifferenceissignificantparedtothecontrol，p0.01a:controlscrambled;b:sense;c:antisense图1端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性的抑制作用（略）fig1theinhibitoryeffectofantisensetelomeraseoligonucleotidefortelomeraseactivity2.2反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用2.2.1

8、tunel标记在倒置显微镜下我们观察反义寡核苷酸作用14天的细胞，发现60%的癌细胞被染成棕色，并有凋亡小体的产生，凋亡细胞数显著高于正义序列，见图2。a:antisenselightmicroscope(×800)；b:senselightmicroscope(×400)图