益气养阴散结方含药血清及对ａ５４９ 细胞凋亡生成

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1、益气养阴散结方含药血清及对Ａ５４９细胞凋亡生成【摘要】　　目的探讨益气养阴散结方含药血清对人肺癌Ａ５４９细胞凋亡及生存素（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）基因表达的影响。方法根据实验动物学原理制备大鼠含药血清和正常血清，设含药血清组和空白血清组，应用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色法检测益气养阴散结方含药血清对人肺癌Ａ５４９细胞凋亡率的影响，观察凋亡细胞形态学变化，并用逆转录ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ）法检测其对Ｓｕｒｖｉｎｉｎ基因表达的影响。结果与对照组比较，药物组Ａ５４９细胞的凋亡率显著增高（P＜０．０１），ＳｕｒｖｉｎｉｎｍＲＮ

2、Ａ的表达显著下降（P＜０．０５）。结论益气养阴散结方含药血清能明显促进Ａ５４９细胞的凋亡，下调凋亡相关基因Ｓｕｒｖｉｎｉｎ的表达。【关键词】益气养阴散结方肺肿瘤细胞凋亡生存素　　Abstract：ObjectiveＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＹｉｑｉＹａｎｇｙｉｎＳａｎｊｉｅＰｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄａｓＹＹＳＰ）（ｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｓｅｒｕｍ）ｏｎａｐｏｔｏｓｉｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｕｒｖｉｖｉｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ．MethodsＹＹＳＰinistratedｇａｓｔｒｉｃｇａｖａｇｅｔｏｎｏrｍａｌｒａｔｓｔ

3、ｏｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＹＹＳＰ，ｗｈｉｃｈwaｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｇｒｏｕｐｗｉｔｈｍｅｄｉｃｉｎｅ．ＴｈｅｒａｔｓｅｒｕｍｗｉｔｈｏｕｔＹＹＳＰwaｓｔａｋｅｎａｓｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＹＹＳＰｏｎｔｈｅａｐｏｔｏｓｉｓｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓwaｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙａｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ；ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｔｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡwaｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲ.ResultsＣｏｍｐａｒedｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒ

4、ｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｒａｔｅｏｆａｐｏｔｏｓｉｓｉｎｔｈｅｇｒｏｕｐｗｉｔｈｍｅｄｉｃｉｎｅincreasedｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（P＜０．０１），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡdecreasedｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（P＜０．０５）．ConclusionＳｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＹＹＳＰｃａｎｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｄｕｃｅａｐｏｔｏｓｉｓａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｔｈｅｓｕｒｖｉｖｉｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ．　　Keywords：ＹｉｑｉＹａｎｇｙｉｎＳａｎｊｉｅＰｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；Lｕ

5、ｎｇｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ａｐｏｔｏｓｉｓ；Ｓｕｒｖｉｖｉｎ　　原发性支气管肺癌是指原发于支气管黏膜和肺泡的癌症，是最常见的恶性肿瘤之一，预计到２０２５年，每年将有９０万人死于肺癌，中国将成为肺癌患病率第一大国［１］。近年来，中药在肿瘤临床治疗中的作用引起了医学界的瞩目，合理开发和运用中医药的抗肿瘤作用成为研究的热点。　　益气养阴散结方是笔者导师湖北中医学院成肇智教授治疗肺癌的临床验方。为了进一步揭示其抗肿瘤的具体机制，本实验采用血清药理学方法，从细胞水平探讨益气养阴散结方对人肺癌Ａ５４９细胞凋亡及相关基因生存素（Ｓｕｒｖｉvｉｎ）表达的影响。　　１　材料与方

6、法　　１．１　细胞与细胞培养人肺癌Ａ５４９细胞由武汉大学生命科学院惠赠。接种于ＲＰＭＩ１６４０完全培养液（含１０％胎牛血清，１００Ｕ／ｍｌ青霉素，１００Ｕ／ｍｌ链霉素）中，５％ＣＯ２，３７℃温箱中培养，２～３ｄ更换一次培养液，细胞长满后０．２５％胰酶消化、传代。　　１．２　含药血清的制备益气养阴散结方由生黄芪、南沙参、莪术等组成，均购自湖北中医学院附属医院门诊部，传统方法煎制，浓缩为１ｍｇ／ｍｌ。根据实验动物学原理以１０ｍｌ／ｋｇ给大鼠灌胃，２次／ｄ，连续３ｄ，于末次给药后１ｈ，经右心室取血，通过离心取得含药血清［２］；同样的方法生理盐水灌胃后取得空白血清，

7、均置于－２０℃保存备用。　　１．３试剂胎牛血清、ＲＰＭＩ１６４０培养液购自ＧＩＢＣＯ公司；ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ凋亡检测试剂盒购自Ｒ＆Ｄ公司；ＲＴ－ＰＣＲ法所需试剂由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司提供；引物由上海生物工程技术有限公司合成。　　１．４仪器恒温二氧化碳培养箱（ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ公司）；ＥＰＩＣＳ－ＸＬ型流式细胞仪（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）；荧光显微镜（日本Ｐｌｙｍｐｕｓ公司）；Ｈ－３００透射电镜（日本日立公司）；基因扩增仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ公司）；全自动图象分析仪（武汉同济千屏影像工程公司）。　　１．５方法　　１．５．１细胞的药物干预与

8、处理将细胞接种于２４孔培养板中（均设６个复孔），每孔