益气养阴散结方含药血清及对ａ５４９ 细胞凋亡生成素基因表达影响的实验研究

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1、益气养阴散结方含药血清及对Ａ５４９细胞凋亡生成素基因表达影响的实验研究【摘要】　　目的探讨益气养阴散结方含药血清对人肺癌Ａ５４９细胞凋亡及生存素（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）基因表达的影响。方法根据实验动物学原理制备大鼠含药血清和正常血清，设含药血清组和空白血清组，应用ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ染色法检测益气养阴散结方含药血清对人肺癌Ａ５４９细胞凋亡率的影响，观察凋亡细胞形态学变化，并用逆转录ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ，ＲＴ－ＰＣＲ）法检测其对Ｓｕｒｖｉｎｉｎ基因表达的影响。结果与对照组比较，药物组Ａ５４９细

2、胞的凋亡率显著增高（P＜０．０１），ＳｕｒｖｉｎｉｎｍＲＮＡ的表达显著下降（P＜０．０５）。结论益气养阴散结方含药血清能明显促进Ａ５４９细胞的凋亡，下调凋亡相关基因Ｓｕｒｖｉｎｉｎ的表达。【关键词】益气养阴散结方肺肿瘤细胞凋亡生存素　　Abstract：ObjectiveＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＹｉｑｉＹａｎｇｙｉｎＳａｎｊｉｅＰｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄａｓＹＹＳＰ）（ｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｓｅｒｕｍ）ｏｎａｐｏｔｏｓｉｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｕｒｖｉｖｉｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ．M

3、ethodsＹＹＳＰinistratedｇａｓｔｒｉｃｇａｖａｇｅｔｏｎｏrｍａｌｒａｔｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｔｈｅｓｅｒｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＹＹＳＰ，ｗｈｉｃｈ.　　２　结果　　２．１荧光显微镜观察结果凋亡细胞的细胞核及细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，少量黄绿色碎片，而坏死细胞的细胞质内黄绿色或橘黄色荧光均减弱或消失。　　２．２透射电镜观察结果凋亡细胞染色质固缩，多聚集于核膜内侧，呈境界分明块状或月行小体，细胞浆浓缩，内可见完整的细胞器。　　２．３ＡｎｎｅｘｉｎＶ／ＰＩ法检测结果见图１，ＵＬ区为细胞坏死，ＬＬ区为细胞存

4、活，ＬＲ区早期凋亡，ＵＲ区为晚期凋亡，凋亡总计＝ＬＲ区＋ＵＲ区。含药血清处理后，细胞凋亡增多（见表１），凋亡率明显高于空白血清组（P＜０．０５）。　　图1含药血清诱导细胞凋亡的流式细胞仪结果（略）　　表1含药血清诱导细胞凋亡的结果（略）　　与空白血清组比较，*P<0.05，n=6　　２．４　ＲＴ－ＰＣＲ法检测结果在紫外透视仪下初步观察条带（见图２），可见空白血清组所得条带亮度明显强于含药血清组，说明经药物干预后，肺癌细胞内的ＳｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ的表达受到了抑制。经过电泳凝胶成像自动分析系统半定量分析（见表２）和统计

5、学处理，含药血清组ＳｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ的表达明显低于空白血清组，其差异具有显著性（P＜０．０５）。　　图2SurvivinmRNA电泳图表2各组SurvivinmRNA相对表达含量（略）　　与空白血清组比较，*P<0.05；n=4　　3讨论　　中医学研究认为气阴两虚是肺癌最基本的病机特征，并贯穿于肺癌发病的始终，因此临床治疗多以益气养阴为主，并取得了一定疗效［３，４］。而笔者导师成肇智教授认为，肺癌的发生多是在气阴两虚的基础上六淫等邪乘虚侵肺，热毒痰淤胶结，逐渐形成肺部肿块。因此，选用益气养阴散结法更切合病机。根据

6、这一思路确定的益气养阴散结方在临床工作中取得了很好的效果。本方是由生黄芪、南沙参、莪术等组成，方中莪术行气破血消积，生黄芪补气升阳，调节机体免疫能力，同时又可防莪术耗气伤气之弊，沙参润肺滋阴，沙参之寒与黄芪之温相配，则寒而无伤脾之虞，燥而无劫阴之虑。诸药配伍，攻补兼施，共奏益气消淤、扶正祛邪之功。随着中医学与现代科技的逐渐结合，如何从分子水平阐明其抗肿瘤的具体机制正成为研究的需要。　　细胞凋亡是由基因控制的细胞的自我消亡，近年来的研究发现，细胞凋亡在许多疾病的发生，尤其是在肿瘤的发生、发展和转归中起重要作用。凋亡受抑、细胞死

7、亡不足是肿瘤发病的重要途径之一，如果病变组织内肿瘤细胞存活延长，使细胞群体内存活与死亡的平衡被破坏，存活大于死亡，则肿瘤细胞数目净增多。因而，从发病学角度来看，细胞凋亡实际上是机体天然的抗癌机制之一。研究表明，许多抗癌药物正是通过诱导增强细胞的凋亡实现其抗肿瘤的作用［５，６］。　　细胞的凋亡过程受到很多基因的调控，具体机制也十分复杂，现有研究表明［７］，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，可全面抑制Ｆａｓ、ｃａｓｐａｓｅ、ｂａｘ、某些化疗药物、ＴＮＦ、Ｘ射线等多种凋亡刺激因子的作用。其作用可能的途径有两条，一

8、是直接或间接抑制ｃａｓｐａｓｅｓ的活性，另一条是与纺锤体的微管蛋白特异性结合，促进细胞分裂，抑制凋亡。　　本研究结果证明，益气养阴散结方能有效促进肺癌细胞的凋亡和降低ＳｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ的表达，可能的机制是益气养阴散结方能有效下调Ｓｕｒｖｉｖｉｎ编码的ｍＲＮＡ在肺癌细胞中的表达，导致Ｓ