重组sv40大t抗原慢病毒表达载体构建

《重组sv40大t抗原慢病毒表达载体构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、郑州大学2008届硕十学位论文中文摘要重组Sv40大T抗原慢病毒表达载体的构建硕士学位申请人李培杰推荐导师赵国强教授赵明耀教授郑州大学基础医学院病理与病理生理学教研室郑州450052摘要研究背景与目的:SV40大T抗原是由Sv40病毒早期编码区编码的一种多功能磷酸蛋白，在病毒复制过程中发挥着重要作用。SV40大T抗原具有活化宿主细胞核糖体基因、诱导DNA合成、修饰蛋白质合成起始因子等作用，并且能结合、调控某些关键性的细胞调控蛋白，如视网膜母细胞瘤蛋白家族成员(如pRB)、肿瘤抑制因子P53等，诱导多种细胞的永生化。通过对SV40大T抗原介导的永生化细胞系的深

2、入研究发现，SV40大T抗原基因与宿主细胞DNA稳定整合重组后，不但能在细胞内表达Sv40大T抗原，加快转化细胞的生长速率，同时也能保留原始细胞的许多分化表型，具有相对稳定的增殖特性和功能状态，而非原始基因的表达很少见。因此，通过建立SV4O大T抗原所介导的永生化细胞系，不仅有助于我们了解细胞的增殖与衰老的分子机制，为我们攻克肿瘤和延缓衰老提供理论依据。同时可多次传代的永生化细胞，以其具有的相对稳定的增殖特性和功能状态，可以作为标准细胞应用在细胞工程和组织工程等研究领域的。本课题拟构建含有重组SV40大T抗原基因的慢病毒表达载体pLentiGFP一Tag，转

3、染包装细胞系293FT获得重组慢病毒，通过感染真核细胞，观察所构建的慢病毒表达载体在宿主细胞内的整合情况及所携带的sv40大T抗原的表达对宿主细胞传代的作用，为研究和建立Sv40大T抗原介导下的永生化细胞系奠定基础。方法:以含有SV4O大T抗原基因的质粒为模板，通过PCR克隆出SV4O大T抗郑州大学2008届硕士学位论文中文摘要原基因作为靶基因;将靶基因连接到pGEM一TEasy载体上，以pGEM一T-Tag克隆质粒转化感受态E.coliJM109，利用Amp抗性和蓝白筛选试验筛选出含有所需的pGEM一T-Tag质粒的白色菌落，以T7/sP6为引物扩增靶基因

4、来确认所需的阳性克隆，并进行DNA测序以确认克隆的靶基因的准确性;将重组质粒pGEM一T-Tag和慢病毒载体pLentiGFP同时用BamHI酶切，电泳胶回收纯化后对线性载体pLentiGFP进行经化处理，再将线性载体pLentiGFP与靶基因sV40大T抗原基因连接，以重组载体pLentiGFP一Tag转化感受态E.coliDH5a，将培养出的菌落以亚克隆鉴定引物Ll/T2为引物鉴定出阳性克隆(正插重组子)。将筛选出的阳性克隆表达载体pLentiGFP一Tag与慢病毒辅助包装载体共转染293FT细胞，培养产生出慢病毒颗粒。以慢病毒颗粒感染家兔骨髓基质细胞，

5、通过观察重组慢病毒所携带的EGFP基因在细胞内的表达及进行RT-PCR的检测确认重组慢病毒与宿主细胞的整合和Sv40大T抗原基因在细胞内的表达。其后进行感染细胞的连续传代培养，观察SV40大T抗原对细胞传代生长的作用。结果:1.靶基因的扩增及电泳分析:以含有SV40大T抗原基因的质粒为模板，目的基因扩增引物Tl/T2为引物通过PCR技术扩增得到与SV40大T抗原基因片段大小相符的约2154bp的基因片段，电泳分析证实。2.靶基因的克隆及鉴定:靶基因与pGEM一TEasy载体连接后，组成重组质粒pGEM一T-Tag，经由转化感受态E.coll’JM109，蓝白

6、筛选试验后随机选取其中的4个阳性菌落，以克隆鉴定引物T7/SP6为引物进行PCR扩增，均得到大小约为2330bp的基因片段，为阳性克隆，再由DNA测序后确认与SV40大T抗原基因序列一致。3.靶基因的亚克隆及重组子的鉴定:将轻化后的pLentiGFP双粘质粒与双粘靶片段sv40大T抗原基因相连接，组成重组子pLentiGFP一Tag，转化感受态E.coll’DH5a后，对4个阳性克隆以亚克隆鉴定引物Ll/T2为引物进行PCR扩增，其中有3个克隆的扩增产物大小约为2274bp，为阳性克隆(正插重组子)。4.重组慢病毒的包装纯化及滴定:将筛选出的阳性克隆表达载体

7、pLentiGFP一Tag与慢病毒辅助包装载体p△8.2.和pVSVG共转染293FT细胞48一72小时后，郑州大学2008届硕士学位论文中文摘要离心获得pLentiGFP一Tag包装的慢病毒，病毒滴度为2.4xIO6Iu/m1。5.重组慢病毒的感染及靶基因的表达:在表达Tag的慢病毒感染家兔骨髓基质细胞48小时后观测到绿色荧光蛋白在细胞内的广泛表达，空白对照组未发现绿色荧光蛋白的表达。进一步通过RT-PcR检测到表达Tag的慢病毒感染组细胞内有SV4O大T抗原mRNA的高水平表达，对照组均为阴性。6.sv40大T抗原对细胞生长的作用:表达Tag的慢病毒感染

8、组细胞培养至第10代，依然生长良好。对照组细胞5代后