表达hcv coreant的重组慢病毒的构建

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1、表达HCVcoreAnt的重组慢病毒的构建【摘要】目的构建表达HCV核心区的重组慢病毒，以探讨HCV感染后该病毒核心蛋白对肝脏干细胞转分化的影响。方法利用PCR体系延伸互为模板的引物，通过T载体克隆法获得HCVcoreAnt基因克隆，酶切后连入pLenti6/V5DTOPO质粒，得到pLenti6/V5DHCVcoreAnt，连同pLP/VSVG、pLP1和pLP2四质粒共转染293ET细胞,获得了表达HCVcoreAnt重组慢病毒。收集病毒上清，大量扩增，用免疫组化法检测目的基因在Hela

2、细胞的表达。用类似的方法构建了表达EGFP的重组慢病毒并测定其滴度。结果克隆出HCVcoreAnt基因，经酶切及测序证实结果正确;使用表达HCVcoreAnt重组慢病毒感染Hela细胞，免疫组化实验证实胞浆有HCVcore表达。使用表达EGFP的重组慢病毒感染3T3细胞见到绿色荧光,说明构建慢病毒载体有效。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了表达HCVcore的重组慢病毒，为进一步研究丙肝病毒致癌机制奠定了基础。【关键词】丙型肝炎病毒核心蛋白;重组慢病毒;分子克隆　ABSTRACT:Objective

3、ToconstructarebinantlentiviralvectorforHCVcoreAntandthenstudyitseffectonthetransdifferentiationofhepaticstemcells.MethodsTheHCVcoreAnterstemplateethod,andthensubclonedtopLenti6/V5DTOPO.TherestrictionendonucleaseandT4DNAligaseidspLP1,pLP2andpLP/VSVG)eas

4、uredbyimmunohistochemistry.Thenilarmethod,andthetitersined.ResultsHCVcoreAntedigestionandsequencing,respectively.TheexpressionoftherebinantlentiviralvectorplasmidcontainingHCVcoreAntinHelacellsedbyimmunohistochemistry.The3T3cellstransfectedthelentiviralv

5、ectorcontaininggreenflurosecentproteinedthatthefourplasmidsystemofthelentiviralvectorolecularcloningandrebinationtechniquesinvitro,olecularcloning　丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染大部分转变为持续感染，继而发展为肝硬化和肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)。许多研究表明HCV的核心蛋白具有致癌潜能，且与HC

6、C的发生发展密切相关。本试验通过构建可以表达HCVcoreAnt融合蛋白的真核表达载体，试图为进一步研究丙肝病毒产物核心蛋白对肝脏干细胞的转分化作用奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料克隆载体pGEMTEasy质粒(50ng/μL)，购自Promega公司。限制性内切酶BamHⅠ、HimdⅢ、XhoⅠ、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。一抗为小鼠抗HCV核心蛋白单克隆抗体，购自北京奥博森公司，HRP羊抗小鼠抗体为北京中杉公司提供。pTE28质粒、pGEMTAnt载体、p

7、EGMHCVcorecDNA克隆质粒、病毒穿梭质粒pLenti6/V5DTOPO、pLP/VSVG、pLP1、pLP2、大肠杆菌DH5α及293细胞系，由西安华广生物工程公司提供。　　1.2方法　　1.2.1构建pGEMTHCVcoreAnt载体采用已经构建的HCVcorecDNA克隆质粒为模板，使用PCR技术删除终止子，通过T载体克隆法构建pGEMTHCVcorecDNA克隆质粒。上游引物：5′GGGATCCATGAGCACGAATCCTAA3′，下游引物：5′GAAGCTTTCACA

8、CTTGGTAGGCCGAAG3′。PCR反应体系：10×TaqDNA聚合酶Buffer10μL，dNTP(2.5mmol/μL)及上、下游引物各1μL，TaqDNA聚合酶(2.5u/μL)1μL，消毒去离子水将总体积加至100μL。PCR条件为：94℃变性60s，42℃退火60s，72℃延伸90s，30个循环后，再72℃延伸5min。经筛选阳性克隆、酶切鉴定及测序后，通过常规分子生物学亚克隆方法，利用已有的p