赤水金钗石斛rdna its序列分析

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1、赤水金钗石斛rDNAITS序列分析葛晓军，肖鲲，李小琼，唐彦萍【摘要】　　目的：对赤水金钗石斛ITS序列进行序列测定与分析，探讨赤水金钗石斛在ITS片段上的遗传特征，提高道地药材赤水金钗石斛在分子水平的鉴定标准。方法：用特异引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后用双脱氧终止法(Sangerdideoxy)测序。结果：通过与基因库登录的金钗石斛ITS对照，赤水金钗石斛ITS1与ITS2序列的起止范围分别为1～231bp和395～636bp。赤水金钗石斛在8位缺失碱基C，在12位缺失碱基A，在82位为碱基A；据此，以NJ法（邻接法）构建了系统树。测序结果登录基因库，序列号：EF618732。结论：金钗

2、石斛ITS1序列基因多态性比ITS2序列更显著；该实验结果为道地药材赤水金钗石斛的物种鉴定补充了新的遗传数据。【关键词】赤水；金钗石斛；rDNAITS　　〔Abstract〕Objective:TostudythegeiccharacterofITSsequenceofChishuiD.nobileandobtainagoodmolecularmarkerforauthenticationofChishuiD.nobile,therDNAITSregionsequencesethodsofDNAsequencing.Methods：ThenuclearribosomalITSplifiedes

3、P1andP2，andthensendtheproductstothesequencingpany.Results：Bycontrasting1to231,ITS2from395to636.BaseCinsite8,BaseAinsite12,BaseAinsite82,issedinITSsequenceofChishuiD.nobile.Accordingtheresult,phylogeictreebasedonITSsequencesdataethod.TheresultofsequencinghasbeensubmittedtoGenbank.AccessionnumberisEF6

4、18732.Conclusion：ThesequenceofITS1containedmorevariablesitesandpotentialinformativesitesthanthatofITS2amongD.nobilespecies.ByourresultforChishuiD.nobile,Nenobile;rDNAinternaltranscribedsequence金钗石斛为传统名贵中药材，药用历史悠久，在《神农本草经》被列为上品，并收载于2000年版的《中国药典》中，有“益胃生津、滋阴清热、明目利嗓”等作用。2006年3月23日，国家质量监督检验检疫总局批准对赤水金钗石斛实

5、施地理标志产品保护，认定金钗石斛为赤水道地药材。伴随着金钗石斛药用价值、经济价值的不断提高，市场上的混淆品、假冒品不断涌现且屡禁不止。另一方面，在中药加工炮制的过程中中药材的成分也会发生变化，导致传统的中药材鉴定方法如性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定结果不稳定。这就迫使人们必须加强金钗石斛真品的鉴别。　　ITS（internaltranscribedsequence）序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中它的序列长度为1000bp到小于300bp大小不等，人们可以从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛用于属内种间或种内群体的系统学研究〔1〕。日渐成熟的rDNA片断序列分析技术，现已广泛应用于中

6、药材的道地性鉴定,如太子参、杜仲、铁皮石斛〔2〕、泽泻〔3〕等的DNA分子鉴定。本实验用改良CTAB法〔4.5〕提取赤水金钗石斛DNA，并利用两个石斛ITS区特异引物，通过PCR扩增得到ITS片段，纯化PCR产物，用双向直接测序和克隆测序获得其ITS序列信息，对两种测序方法所得序列与基因库中已登陆金钗石斛序列进行比较分析。确定赤水金钗石斛与其他地方石斛ITS序列差异，为赤水道地药材金钗石斛提供分子鉴别资料。　　1材料和方法　　1.1样本来源金钗石斛共50株，采自赤水长期镇、官渡、石堡乡。　　1.2赤水金钗石斛总DNA提取及检测（改良CTAB法）参照改良CTAB法〔4〕提取金钗石斛DNA，总DN

7、A纯度及浓度的检测用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法。　　1.3PCR扩增金钗石斛ITS序列（包括5.8S）及产物回收ITS的扩增引物参照Douzery等〔6〕的引物设计P1,上游引物：5＇CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC3＇,位于18S上；P2，下游引物：5＇TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG3＇，位于26S上；采用标准的双链PCR反应扩增核基因的整个