秦巴山区厚朴中产酚类物质内生真菌的分离及鉴定

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1、１０７２０单位代码：分类号：Ｑ９３９．９开学号：１５０７１００５０８密级：？Ａ＾＾＾（｜ＳｈａａｎｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ硕士学位论文秦巴山区厚朴中产酚类物质内生真菌的分离及鉴定ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ－ｒｏｄｕｃＥｎｄｏｈｔｉｃＨｄｒｏｘｅｎｚｅｎｅｉｎｐｙｙｙｂｐｇＦｕｎｉｉｎＭａｎｏｌｉａＯｃｉｎａｌｉｓｆｒｏｍｉｎｂａｇｇｆｆｉＱＭｏｕｎｔａｉｎ：论文作者彭浩副教授指导教师、职

2、称：Ｉ陈文强Ｉ教授、学科、专业名称：微生物学研究方向：微生物资源保育及开发应用二〇一八年六月分类号：Q939.9单位代码：10720密级：公开学号：1507100508硕士学位论文秦巴山区厚朴中产酚类物质内生真菌的分离及鉴定IsolationandIdentificationofHydroxybenzene-producingEndophyticFungiinMagnoliaOfficinalisfromQinbaMountain论文作者：王颖指导教师、职称：陈文强教授、彭浩副教授学科、专业名称：微生物

3、学研究方向：微生物资源保育及开发应用二〇一八年六月摘要厚朴酚及和厚朴酚为我国著名药用植物厚朴的主要活性成分，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗溃疡、抗炎、防龋等药理作用，应用广泛、需求量大。厚朴酚与和厚朴酚来源于厚朴或凹叶厚朴的根皮及枝皮，随着其市场的扩大，厚朴资源惨遭破坏。本研究以秦巴山区厚朴为试材，分析其内生真菌生物多样性，初步建立秦巴山区厚朴内生真菌种质资源库；筛选代谢产生厚朴酚及和厚朴酚的内生真菌，并采用L49(3)正交试验对产酚内生真菌的培养基组成及培养条件进行优化，为下一步利用微生物发酵法制备厚朴酚及和厚朴酚

4、奠定基础。1.秦巴山区厚朴内生真菌的分离及初步鉴定利用组织培养法对秦巴山区不同地域厚朴进行内生真菌的分离，共获得151株纯培养菌株，初步鉴定出144株，其分属于6目，7科，16属。其中，青霉属（Penicillium）21株、镰刀菌属（Fusarium）18株、毛霉属（Mucor）15株，为优势类群，分别占总菌数的13.91%、11.92%和9.93%。其余7株真菌由于其不产生孢子或无特征菌丝结构，无法用经典形态学方法进行鉴定。结果表明，秦巴山区厚朴内生真菌具有一定的物种多样性，且不同组织部位对内生真菌的丰度有一定

5、影响。分离自茎部的内生真菌数量和种类最多，其次是根部，叶中最少；另外，不同采样地点厚朴内生真菌数量及种类存在一定相似性及差异。2.产厚朴酚及和厚朴酚内生真菌的筛选及鉴定对151株内生真菌进行液体摇瓶发酵，然后对发酵液依次进行抽滤，乙酸乙酯萃取，负压旋转蒸发浓缩得到萃取物。通过高效液相色谱仪（HPLC）、超高效液相-三重四级杆串联质谱仪（UPLC-MS/MS）对萃取物中的厚朴酚及和厚朴酚进行检测，共筛选出14株产酚菌株，占此次分离内生真菌总数的9.93%，其中青霉属（Penicillium）6株，占产酚菌株总数的42

6、.86%；曲霉属（Aspergillus）2株，占产酚菌株总数的14.29%；其余6株分别为：毛霉属（Mucor）、木霉属（Trichoderma）、镰刀菌属（Fusarium）、交链孢霉属（Alternaria）、粘帚霉属（Clonostachys）和蜡蚧菌属（Lecanicillium），各占产酚菌株总数的7.14%。在上述产酚菌株中，以菌株Y-18和Y-88的产量最高。菌株Y-18和厚朴酚的产量为532.443µg/L，而菌株Y-88厚朴酚及和厚朴酚的产量分别为579.140µg/L、471.627µg/L。

7、经过形态学i观察和ITS序列分析将菌株Y-18鉴定为半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），粘帚霉属，粉红粘帚霉（Clonostachysrosea）；将菌株Y-88鉴定为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目（Moniliales），丛梗孢科（Moniliaceae），蜡蚧菌属，Lecanicilliumsaksenae。3.菌株Y-88的培养基及培养条件优化以碳源、氮源、MgSO4·7H2O和KH2PO4为影响因素，以厚朴酚与和厚朴酚的产量

8、为考察指标，在单因素试验基础上，采用L49(3)正交试验对菌株Y-88的培养基组成进行优化，优化得到菌株Y-88发酵培养基产厚朴酚最佳配方（g/L）：葡萄糖20.00、蛋白胨6.00、KH2PO44.00、MgSO4·7H2O3.00、VB10.10，水1L，产量为702.261±32.016ug/L，较优化前提高21.26％；优化得到菌株Y-88发酵培养基