肺炎链球菌候选蛋白疫苗clpp的保守性和抗原性

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1、肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性和抗原性作者：李岱容，曹炬，王虹，吴凯峰，尹一兵【摘要】目的:评价酪蛋白裂解酶P(ClpP)作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌（SPN）中的表达情况.方法:以TIGR4型SPN的ClpP基因序列设计引物，分别以12株不同血清型SPN的基因组DNA为模板，对ClpP基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、胶回收产物与PMD18克隆载体连接后进行测序，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析，并利用CC(B)31109(serotype1)，CMCC(B)31203(

2、serotype3)，CMCC(B)31446(serotype4)，CMCC(B)31011(serotype5)，CMCC(B)31207(serotype6B)，CMCC(B)31507(serotype7F)，CMCC(B)31216(serotype9V)，CMCC(B)31614(serotype14)，CMCC(B)31687(serotype18C)，CMCC(B)31693(serotype19F)，CMCC(B)31759(serotype23F)（北京中国医学细菌保藏管理中心），NCTC7466(serotype2，国际

3、通用名为D39)（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌DH5a和原核表达系统(含pET32a(+)/ClpP重组质粒)E.coliBL21(DE3)(重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室)，金黄色葡萄球菌标准菌株(重庆医科大学微生物学教研室)，质粒PMD18T载体试剂盒(日本TaKaRa公司).1.1.2试剂DNA提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒DNA快速制备试剂盒(上海华舜公司)；限制性内切酶EcoRI，SacI，高保真LATaq聚合酶，dNTPs，Buffer，MgCl2(大连宝生物技术公司)；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基βD硫代

4、半乳糖苷(IPTG)，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)(美国Sigma公司)；DNAmarker(上海生工公司)；GoatantimouseIgGHRP(H+L)和3二氨基苯联胺DAB∶3(北京中杉公司)；咪唑，Nacl和Tris碱(美国BBI公司)；HisBindColumn(NiNTA)镍柱(美国Novagen公司).1.1.3仪器热循环仪（TMBioRadPCR，美国genecycle公司）；电泳仪（Pomol/L)2.4μL，P1(5pmol/L)3μL，P2(5pmol/L)3μL，SPNDNA1.5μL，

5、LATaq0.4μL.在PCR仪上按下列条件进行扩增：95℃预热5min后反应30个周期：94℃1min，53℃1min，72℃1min.末轮后72℃延伸5min.取5μL反应产物置10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，DNA胶回收试剂盒回收PCR产物.1.2.2TA克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个PCR产物克隆至PMD18T载体，转入DH5α感受态细胞，在Amp+LB平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感染实验室做双向测序.1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用DNAssi

6、st软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与GenBank数据库对已公布的TIGR4SPN全基因组序列进行相似性分析.1.2.4抗原表位预测用抗原表位预测工具ANTIGENICPREDICTEDANTIGENICPEPTIDES分析不同血清型SPNClpP蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.1.2.5PETClpP重组载体的诱导表达及纯化原核表达系统pET32a(+)/ClpPE.coliBL21(DE3)在终浓度1mmol/LIPTG，37℃，250r/min条件下诱导目的重组蛋白ClpP的表达.收集的菌体超声波碎菌后，采

7、用NiNTA柱纯化目的蛋白，以SDSPAGE和BioRad凝胶图像分析系统检查目的重组蛋白表达与提纯效果.将透析除盐的纯化蛋白溶液经Bradford法定量后备用.1.2.6antiClpP抗血清的制备稀释后重组clpP蛋白溶液与等体积的CFA或IFA充分混匀成乳状，在小鼠腹腔下接种制备好的抗原蛋白.初次免疫时小鼠接受含200μL(含重组蛋白10μg)的CFA与重组蛋白混合物；小鼠再次与末次免疫时接受200μL(含重组蛋白10μg)的IFA与重组蛋白混合物.小鼠经3次免疫后，分离小鼠血清，并用ELISA法测其antiClpP抗体效价.1

8、.2.7D18T载体，同时菌落PCR结果也证明基因克隆正确.2.3测序结果与序列比对不同株的ClpP基因编码区大小与TIGR4菌株中ClpP基因一样，均为591b