肺炎链球菌候选蛋白疫苗clpp的保守性的论文

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1、肺炎链球菌候选蛋白疫苗ClpP的保守性的论文【摘要】目的:评价酪蛋白裂解酶p(clpp)作为候选疫苗的保守性和抗原性，分析在不同血清型肺炎链球菌（spn）中的表达情况.方法:以tigr4型spn的clpp基因序列设计引物，分别以12株不同血清型spn的基因组dna为模板，对clpp基因进行聚合酶链反应(pcr)扩增、胶回收产物与pmd18克隆载体连接后进行测序，运用生物信息学方法对其核苷酸及推测的氨基酸序列及抗原性进行分析，并利用oniae，spn）是引起获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎的主要病原菌.随着多重耐药菌株的不断发现，疫苗在预防和控制spn感染中的作

2、用越来越重要［1］.spn根据荚膜可分为90多个血清型，开发对所有血清型spn都具抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前spn疫苗的发展方向.研究发现的spn蛋白质候选疫苗酪蛋白裂解酶p(caseinolyticproteasep,clpp）是atp依赖的丝氨酸蛋白水解酶［2］，其在spn的生存、致病和入血过程中起着重要的作用［3-4］，针对其靶点的疫苗或抗生素也越来越显示出其潜在的价值.本研究探讨clpp在不同spn菌株中的保守性与抗原性，以及在不同血清型spn中表达情况，旨在为自主开发spn蛋白疫苗奠定基础.1材料和方法1.1材料1.1.1菌种与质粒12株不

3、同血清型spn：cmcc(b)31109(serotype1)，cmcc(b)31203(serotype3)，cmcc(b)31446(serotype4)，cmcc(b)31011(serotype5)，cmcc(b)31207(serotype6b)，cmcc(b)31507(serotype7f)，cmcc(b)31216(serotype9v)，cmcc(b)31614(serotype14)，cmcc(b)31687(serotype18c)，cmcc(b)31693(serotype19f)，cmcc(b)31759(serotype23f)

4、（北京中国医学细菌保藏管理中心），nctc7466(serotype2，国际通用名为d39)（欧洲国家标准菌种库）；大肠杆菌dh5a和原核表达系统(含pet32a(+)/clpp重组质粒)e.colibl21(de3)(重庆医科大学临床检验诊断学重点实验室)，金黄色葡萄球菌标准菌株(重庆医科大学微生物学教研室)，质粒pmd18t载体试剂盒(日本takara公司).1.1.2试剂dna提取试剂盒，凝胶回收试剂盒及日常型质粒dna快速制备试剂盒(上海华舜公司)；限制性内切酶ecori，saci，高保真lataq聚合酶，dntps，buffer，mgcl2(大

5、连宝生物技术公司)；丙烯酰胺，双丙烯酰胺，异丙基βd硫代半乳糖苷(iptg)，完全弗氏佐剂(cfa)和不完全弗氏佐剂(ifa)(美国sigma公司)；dnamarker(上海生工公司)；goatantimouseigghrp(h+l)和3二氨基苯联胺dab∶3(北京中杉公司)；咪唑，nacl和tris碱(美国bbi公司)；hisbindcolumn(ninta)镍柱(美国novagen公司).1.1.3仪器热循环仪（tmbioradpcr，美国genecycle公司）；电泳仪（pog2+)6.0μl，dntp(10mmol/l)2.4μl，

6、p1(5pmol/l)3μl，p2(5pmol/l)3μl，spndna1.5μl，lataq0.4μl.在pcr仪上按下列条件进行扩增：95℃预热5min后反应30个周期：94℃1min，53℃1min，72℃1min.末轮后72℃延伸5min.取5μl反应产物置10g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定后，dna胶回收试剂盒回收pcr产物.1.2.2ta克隆载体的构建与鉴定将回收纯化的12个pcr产物克隆至pmd18t载体，转入dh5α感受态细胞，在amp+lb平板上培养得到多个阳性克隆，单个阳性克隆细菌经增菌后进行质粒抽提后双酶切鉴定，并将质粒送往重庆医科大学感

7、染实验室做双向测序.1.2.3序列比对与氨基酸序列预测利用dnassist软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与genbank数据库对已公布的tigr4spn全基因组序列进行相似性分析.1.2.4抗原表位预测用抗原表位预测工具antigenicpredictedantigenicpeptides（<ahref="bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型spn"target=_blankclpp蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.>bio.dfci.harvard.edu/tools/）分析不同血清型

8、spnclpp蛋白的抗原表位及其氨基酸组成.1.2.5petcl