探讨肺炎链球菌候选疫苗蛋白spd0295的重组表达

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1、探讨肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达　　肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是引起细菌性肺炎、中耳炎、菌血症及脑膜炎等的主要致病菌，其在世界范围内有较高的致病率与死亡率，尤其是对婴幼儿及老年人存在高致病性。目前，市售的S.pn疫苗主要有2大类，一类是以23价S.pn疫苗为代表的多糖疫苗，存在免疫原性和诱导非T细胞依赖性免疫反应弱、对老年人及2岁以下儿童保护效果差等诸多缺点。而另一类则是以PCV7为代表的结合疫苗，在使用过程中存在荚膜血清型转换、价格昂贵等缺点;目前发现的93种S.pn血清型中，PCV疫苗覆盖面

2、极为有限，不能产生广泛的保护效应。因此，开发成本低、免疫原性好、保守性高的S.pn蛋白疫苗，促进S.pn疫苗更新换代显得尤为必要。磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(thephosphoenolpyruvatedependentphosphotransferasesystem，PTS)由非特异性酶I(EnzymeI，EI)、热稳定组氨酸蛋白(histidineprotein，HPr)和对糖有特异性的酶II(EnzymeII，EII)组成。该系统在多种革兰阳性菌中具有转运碳源、趋化效应、磷酸化作用以及对其它代谢通路的调节作用。其中EII由EIIA、EIIB及

3、EIIC组成，而SPD0295是肺炎链球菌EIIB的核心组分，其对碳源具有特异性转运功能，可能是潜在的候选疫苗靶点，而目前国内外关于该蛋白的研究很少。因此，本研究拟探讨SPD0295重组蛋白的抗原性、其在不同S.pn菌株中的保守性及其对肺炎链球菌的黏附抑制效应，为S.pn蛋白疫苗的开发提供初步理论依据。　　1材料与方法　　1.1实验材料　　所用6～8周龄、体质量18～20g的雌性Balb/c小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，并负责长期饲养。NCTC7466(D39)、TIGR4型S.pn标准菌株购自欧洲国家标准菌种库;CMCC(B)31693(serot

4、ype19F)、CMCC(B)31446(serotype4)、CMCC(B)31614(serotype14)、CMCC(B)31207(serotype6B)、CMCC(B)31436(serotype3)等临床菌株，均由中国医学细菌保藏管理中心提供;pET28a、E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)均由重庆医科大学临床检验诊断学教育部重点实验室长期保存;A549细胞株由重庆医科大学生物工程系提供。基因组DNA抽提试剂盒、DNA纯化试剂盒和Prime-Star高保真DNA聚合酶，限制性内切酶EcoRⅠ及XhoⅠ均由TaKaR

5、a公司提供;DNAmarker从上海生物工程公司购进;6×His标签抗体、HRP标记羊抗鼠IgG抗体，均从北京中杉公司购进;质粒抽提试剂盒为美国Omega公司提供;T4-DNA连接酶为美国Promega公司产品;硫代半乳糖苷为美国Sigma公司产品、铝佐剂为美国Pierce公司产品;His-BindColumn(Ni-NTA)树脂为美国GE公司产品。　　1.2目的基因　　扩增-80℃冰箱取出S.pnD39标准菌株，室温复苏后取少量加于C+Y培养基中，37℃增菌培养至细菌生长到对数中、后期，按基因组DNA抽提试剂盒说明书提取全基因组DNA，PCR

6、技术扩增spd0295基因的开放读码框架(约492bp)。引物由上海生物有限公司合成，其中：上游引物P1：5′-GCCGGAATTCATGACAATGCCAAATATT-3′，含EcoRⅠ酶切位点;下游引物P2：5′-GCGCTCGAGTTAAATATAGTCCATAATG-3′，含XhoⅠ酶切位点。扩增体系为:ddH2O32.5μl、5×buffer(含Mg2+)10.0μl、P1(10pmol/L)1.0μl、P2(10pmol/L)1.0μl、dNTP(10mmol/

7、L)4.0μl、S.pn基因组DNA1.0μl、Prime-Star0.5μl共50μl，扩增条件为：98℃10s、55℃15s、72℃40s，反应30个循环;最后72℃延伸10min，取5.0μl产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　1.3重组质粒构建　　分别用EcoRⅠ及XhoⅠ对上述纯化后目的DNA和pET28a质粒进行双酶切，酶切产物纯化后在T4-DNA连接酶作用下连接16h，然后转化提前制备好的感受态细胞DH5α，铺于含Kana抗性的LB平板，37℃培养过夜。次日挑取单个菌落进行增菌培养，同时进行菌液PC

8、R、双酶切鉴定和送金斯瑞公司进行测序鉴定。　　1.4目的蛋白的表达