survivin反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究

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1、Survivin反义核酸诱导乳腺癌细胞凋亡的实验研究作者：段体德1，刘德权2，杨策尧1【摘要】目的探讨Survivin反义核酸技术诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及效果。方法本实验共分6组，分为以脂质体介导反义寡核苷酸组（ASODN/Lip）、无义寡核苷酸组（NODN/Lip）及RPMI1640培养液的空白对照组（Lip），转染人乳腺癌MCF-7细胞系，应用Hoechst33258/PI双重染色观察MCF-7细胞的形态学改变，透射电镜观察细胞超微结构，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化，DNA凝胶电泳观察凋亡情况，研究Survi

2、vin反义寡核苷酸对MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制作用。结果Hoechst33258/PI染色及透射电镜观察可见转染后的细胞结构呈凋亡样改变；流式细胞仪检测见转染后细胞凋亡显著增加，并出现G2/M期阻滞现象；DNA凝胶电泳在600ng/ml，800ng/mlASODN/Lip组的电泳图谱上呈现出明显的“梯状”现象。结论凋亡抑制基因Survivin表达下调对乳腺癌细胞的生长抑制作用主要是通过诱导细胞发生凋亡以及阻止有丝分裂发生在G2/M阻滞期来实现，Survivin靶向反义核酸技术可能成为乳腺癌基因治疗的一种有效方法。【关键词

3、】乳腺癌；Survivin基因；反义核酸技术；凋亡【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectofcellsapoptosisonhumanbreastcanceraftersurvivinentsanbreastcancerMCF-7celllineandRPMI1640culturemedium(normalcontrol).ThestudyusedHoechst33258/PI，electronmicroscope，floeterandingelelectrophoresisofDNAto

4、observethecellsapoptosis.ResultsThecellsapoptosisaftertransfectionicroscopeandingelelectrophoresisofDNA.TheresultoffloetershoenaappearedinG2/Mperiod.ConclusionTherestrictionbythereductionofsurvivinexpressioninbreastcancercellsismainlyfunctionedthroughitsinductionof

5、cellsapoptosisandpreventionofmitosisatG2/Mperiod.Survivintargetingtherapycanbeusedasanimportantmethodinbreastcancertreatment.【Keyl，分别接种于30ml培养瓶、96孔培养板及铺有盖玻片的6孔培养板，37℃，5%CO2常规培养至80%汇片后进行转染。1.2脂质体介导SurvivinASODN转染MCF-7细胞1.2.1寡核苷酸的设计及合成采用SurvivinmRNA231-251设计互补ASODN，反

6、义寡核苷酸（ASODN）序列5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′；对照无义寡核苷酸（NODN）序列5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′，对照序列经GeneBank比对无相关基因，两条序列每端5个磷酸基采用硫代磷酸型，即在合成时用硫基取代寡核苷酸片段磷酸上的羟基，部分反义寡核苷酸5FAM荧光素标记，由上海生物工程公司提供。1.2.2转染混合物的制备及配制A液：Survivin反义寡核苷酸及对照序列的浓度设定为：200，400，800，1200，1600（ng/ml），用不含血清及抗生素的RPMI1640

7、将反义寡核苷酸配成上述浓度溶液。B液：将Lipofectin：RPMI1640（不含血清及抗生素）=4μl∶100μl的比例配成B液。将等体积的A液与B液混合，室温下放置40min左右，使脂质体与寡核苷酸充分包裹。寡核苷酸的终浓度为100，200，400，600，800（ng/ml）。1.2.3转染将不同浓度的ASODN-RPMI1640转染混合物加入培养瓶或培养板中。本实验设6组分别为：（1）Lip组以RPMI1640培养液代替转染混合物作为空白对照（加入Lip）；（2）无义对照（NODN）组，以NODN/Lip-RPMI

8、1640转染细胞作为无义对照；（3）200ng/mlASODN转染组；（4）400ng/mlASODN转染组；（5）600ng/mlASODN转染组；（6）800ng/mlASODN转染组，37℃，5%CO2常规培养24h，弃去转染混合物，胰酶消化收集细胞。96孔板中的细胞用于检测细胞贴壁