不同治则方药对快速老化小鼠脑组织细胞因子表达的影响论文

《不同治则方药对快速老化小鼠脑组织细胞因子表达的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

　　不同治则方药对快速老化小鼠脑组织细胞因子表达的影响论文陈云波，王奇，罗荣敬，冯炯，鹿俊磊，程淑意【摘要】目的观察不同治则方药对痴呆动物模型脑组织细胞因子表达的影响。方法7月龄快速老化亚系SAMP8小鼠分为痴呆模型组、阳性对照药脑复康组、六味地黄汤组、四君子汤组、归脾汤组、当归芍药散组等6个组；抗快速老化亚系SAMR1作为正常对照组。给药4周后，用液相蛋白芯片（Luminex）技术同时测定脑组织中的10种细胞因子（GM-CSF，IFN-γ.freeler'sdisease,AD）是目前公认的危害人类健康的主要疾病之一，已成为威胁中国老年人健康，仅位于心脏病、肿瘤、卒中之后的第四大疾病。由于AD病理变化的复杂性，其发病机制尚未揭示［1］，尽管世界各国在寻找AD有效治疗药物的研究中投入了大量的人力和物力，但成果却十分有限。作为天然药物的中药尤其是复方，在防治老年性疾病方面则有着丰富的理论和实践经验以及潜在的优势，因此，阐明中药复方防治AD的药理机制，筛选和研制能延缓AD进程、提高患者生活质量的中药新药将具有重要的现实意义和广阔的应用前景。 本实验研究拟采用新引进的液相蛋白芯片（Luminex）技术［2］，研究不同治则方药对痴呆动物模型脑组织细胞因子的影响。首先在文献检索和预实验的基础上，初筛出10种与AD免疫炎症病理反应相关的细胞因子,它们是粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（Granuloyte-macrophagecolonystimutaingfactor,GM-CSF）、γ-干扰素（Interferonγ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumournecrosisfactor-α,TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-5（IL-5）、白介素-6（IL-6）、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)；然后用4种不同治则的经典方药（即六味地黄汤、归脾汤、当归芍药散和四君子汤）对痴呆动物模型进行治疗；应用Luminex检测技术，比较不同治则方药各自不同蛋白表达靶点（脑组织的皮质和海马）的细胞因子含量变化，从炎症与免疫反应方面阐述中药复方防治AD的药理机制，为其临床应用提供实验依据。1材料与仪器1.1动物SPF级7月龄雄性快速老化小鼠（senescenceaccelerated mouse，SAM）购自天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心（动物质量合格证号：06F1022），其中快速老化亚系SAM-prone/8（SAMP8）小鼠84只，抗快速老化亚系SAM-resistant/1（SAMR1）小鼠15只，体质量约20g。1.2药品和试剂六味地黄汤（熟地、山萸肉、山药、泽泻、丹皮、茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3的比例配比）；归脾汤（白术、茯苓、黄芪、龙眼肉、酸枣仁、木香、炙甘草、当归、远志、人参按3∶3∶4∶4∶4∶2∶1∶3∶2∶2的比例配比）；四君子汤（人参，白术，茯苓，炙甘草按1∶1∶1∶1的比例配比）；当归芍药散（当归，芍药，川芎，泽泻，白术，茯苓按3∶16∶8∶8∶4∶4的比例配比）等4种方药药材由广东省中医院药房提供，按煎煮标准配制，煎煮浓缩至所需浓度（含生药为1g/ml）；脑复康片（吡拉西坦片PiracetamTablets），广东华南药业有限公司产品，批号：051103；氯化钠灭菌注射液，广州中医药大学附属第一医院产品，批号：T051123；MouseMulti-CytokineDetectionSystem2Luminex检测试剂盒，Upstate公司产品，批号：0604026780。1.3仪器 液相芯片分析平台（美国Luminex公司，型号Luminex100）；超低温冰箱（美国Forma公司，型号8525）；台式高速冷冻离心机（德国Beckman公司，型号GS-15R）；电子天平（日本Shimadzu公司，型号AGE120）；纯水器（美国Millipore公司，型号Milli-Q）。2方法2.1分组84只7月龄SAMP8小鼠按区组随机法分为模型组、脑复康组、六味地黄汤组、四君子汤组、归脾汤组、当归芍药散组，每组14只；15只SAMR1作为正常对照组。以各种药物的临床用量作为实验小鼠的用药量，根据体重剂量浓度的换算公式［3］换算成小鼠标准体重剂量，按下列分组连续灌胃给药4周。2.2给药①正常对照组：每天给予生理盐水灌胃，0.2m1/次。②模型组：每天给予生理盐水灌胃，0.2m1/次。③六味地黄汤组（0.2g/20g）、四君子汤组（0.09g/20g）、归脾汤组（0.23g/20g）、当归芍药散组（0.34g/20g），每天分别按相应的剂量（生药/体重）灌胃。④脑复康组（阳性药对照）：每天给予脑复康片生理盐水溶液灌胃，按0.5g/kg体重给药。2.3标本制备 各组8月龄SAM小鼠灌胃治疗后，断头取出其双侧海马和双侧皮质作为样本，分离海马组织时参照本室［4］的方法，取出双侧海马放置于0.5ml的Eppendorf管内，称重，封口，置于-70℃超低温冰箱保存备用。2.4液相蛋白芯片(Luminex)技术检测脑组织标本正式检测前从-70℃超低温冰箱取出，以每克组织加入15ml磷酸盐缓冲液（PBS）的比例，加入0.01mol/LPBS（内含苯甲基氟磺酸100mg/L）液，在微型组织研磨器中充分研磨，3000g，4℃离心10min，待测。严格按Upstate公司的Luminex检测试剂盒说明书进行操作。先将50μl的空白对照缓冲液、不同稀释倍数的标准品和待测样品分别加到可抽滤的96孔微孔板对应孔内，然后加入25μl抗体交联微球进行反应，室温振荡4h后，4℃过夜；次日进行真空低压抽滤、缓冲液洗涤，加25μl检测抗体进行反应；室温振荡1.5h，加入25μl链亲和素－藻红蛋白荧光素进行标记；室温振荡30min，加25μl终止液终止反应，上Luminex分析平台进行检测。检测完毕后，采用美国MiraiBio公司的MasterPlexTMQT多元数据分析软件（随Luminex分析平台安装），绘制标准曲线，用四参数法换算出各细胞因子的含量。2.5统计学处理实验结果用SPSS11.0统计软件处理，所有数据均以±s表示，用方差分析对实验数据进行统计。3结果 3.1各组8月龄SAM小鼠皮质匀浆液10种细胞因子含量的比较结果见表1。与正常对照组比较，模型组除了IL-6和IL-10有下降趋势外，其余8种细胞因子含量均呈升高趋势，但只有GM-CSF的含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P0.05）。观察各药物治疗组对皮质GM-CSF的影响发现，六味地黄汤组、当归芍药散和阳性对照药脑复康的GM-CSF含量均与正常对照组水平接近（P＞0.05），而四君子汤组和归脾汤组则和模型组一样，明显高于正常对照组（P0.05或P0.01）。说明前3种药物能在一定程度上抑制SAMP8小鼠皮质GM-CSF含量的升高。表1各组SAM小鼠皮质匀浆液10种细胞因子含量的比较（略）与正常对照组比较,﹡P＜0.05,﹡﹡P＜0.01;与模型组比较,﹟P＜0.053.2各组8月龄SAM小鼠海马匀浆液10种细胞因子含量的比较结果见表2。与正常对照组比较，8月龄SAMP8小鼠所有10种细胞因子含量均呈下降趋势，除了TNF-α和IL-5外，其余8种细胞因子含量均明显低于正常对照组，差异有统计学意义（P0.05或P 0.01）。结果提示8月龄SAMP8小鼠脑组织中某些细胞因子表达发生了异常改变。从不同药物组对8月龄SAMP8小鼠海马匀浆液10种细胞因子的影响结果发现，阳性对照药脑复康能提高模型小鼠海马中的IFN-γ，IL-4和IL-12的水平（P0.05或P0.01）；当归芍药散能提高模型小鼠海马中的IFN-γ和IL-4的水平（P0.05）；四君子汤组也能提高模型小鼠海马中的IFN-γ水平（P0.05）；而六味地黄汤组则能使模型小鼠海马中的GM-CSF，IFN-γ，TNFα，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12等10种细胞因子指标全部显著升高（P0.05或P0.01），大多恢复到正常水平。结果表明当该时期SAMP8小鼠海马中的免疫机制出现异常反应时，中药复方六味地黄汤、当归芍药散、四君子汤以及阳性对照药脑复康均能起到一定的调节作用，其中六味地黄汤的作用效果较明显。表2各组SAM小鼠海马匀浆液10种细胞因子含量的比较（略）4讨论快速老化小鼠分为快速老化亚系（senescenceacceleratedmouse/prone，SAM-P）及抗快速老化亚系（senescenceaccelerated mouse/resistance，SAM-R），由日本京都大学竹田俊男教授首次培育成功，经20多代交配近繁，获得了遗传性与病理表型一致，符合近交系标准的新系列［5］。SAM-P品系除具有一般老化症状外，还伴随着快速老化出现的学习记忆力障碍和低恐怖低紧张状态，为脑老化痴呆模型小鼠。其具有认知障碍，且在渡过生长期后，伴快速老化自然发生，与临床痴呆的渐进性发生极为相似。大量研究表明，SAM-P品系与其同源对照R1相比，其行为学、形态学、神经生化、多种酶类以及组织蛋白和基因表达均出现异常。SAM-P小鼠各种生化指标的异常变化促使一些学者深入到分子水平探讨其机理。日本学者Tha等［6］研究认为，SAM-P脑中致炎因子表达的升高可能与P8衰老相关的神经功能紊乱或认知功能缺陷有关。本实验用Luminex技术对8月龄SAM-P小鼠脑组织匀浆液同时进行多种细胞因子的检测，结果表明，在被检测的8月龄SAMP8小鼠皮质匀浆液10种细胞因子指标中，与正常对照组比较，除了IL-6和IL-10有下降趋势外，其余8种细胞因子含量均呈升高趋势，但差异都不明显（P＞0.05），只有GM-CSF的含量明显高于正常对照组（P0.05）。GM-CSF最先由Bradley等［7］在澳大利亚发现，在体内由T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等在抗原刺激下产生，是一种调节粒系祖细胞增殖分化和成熟的糖蛋白的因子，能增加中性粒细胞和巨噬细胞的数量及生理功能，发挥抗感染免疫效应；但在大脑中也能刺激小胶质细胞的生长，介导其它炎症因子（TNF、IL-2等）的分泌。瑞典学者Tarkoouse(SAM): abiogerontologicalresourceinagingresearch［J］.NeurobiolAging,.freelaY,MiyazakiH,etal.ChangesinexpressionsofproinflammatorycytokinesIL-1β,TNF-αandIL-6inthebrainofsenescenceacceleratedmouse(SAM)P8［J］.BrainRes.2000,885:25.［7］BradleyTR,MetcalfD.ThegroousebonemarroicGM-CSFincreaseinAlzheimer'sdiseaseandvasculardementia［J］.ActaNeurolScand，2001Mar;103:166.［9］贾丽艳，拓西平，朱嘉琦，等.华中五味子酮对阿尔茨海默病样大鼠海马内IL-1β及iNOS表达的影响［J］.第二军医大学学报，2005,26(2):161.［10］方鉴,张永祥,茹祥斌,等.六味地黄汤对佐剂性关节炎大鼠脾脏细胞表达细胞因子的影响［J］.中国中药杂志,2001,26(2):128.［11］章梅，夏天，张仲海，等.四君子汤对脾虚患者血浆细胞因子的影响［J］.第四军医大学学报， 2000，21(4):411.［12］刘朝阳，代金平，于培龙.归脾汤对慢性肝炎恢复期患者的免疫调节作用［J］.新乡医学院学报,2000,17(5):353.［13］水岛宣昭.当归芍药散对老年痴呆的作用［J］.和汉医药学会志,1989，6(3):456.［14］寇俊萍，华敏，严永清.当归芍药散对小鼠免疫功能的影响［J］.中国现代应用药学,2003,3:171.