大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究论文

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1、大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究论文【摘要】目的探讨中药大青叶单体1#，2#，3#，4#体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法通过观察病毒引起的细胞病变效应（Cytopathogeniceffect,CPE）和MTT［MethylThiazolylTetrazolium，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐］法检测药物抗RSV活性,计算药物对病变的抑制率和半数抑制浓度（50%inhibitingconcentration,IC50），并从药物抗病毒吸附.freell,治疗指数(TI

2、)分别为6.15，10.50，9.21，13.22，其抗病毒效果优于病毒唑(IC50=103.20μg/ml,TI=5.21)和抗病毒口服液(IC50=105.21μg/ml,TI=5.03)，P0.01。结论大青叶单体1#，2#，3#，4#能安全高效地抑制RSV在Hep-2细胞中的增殖，抑制作用发生在病毒入侵细胞后。【关键词】大青叶单体呼吸道合胞病毒细胞病变效应法MTT法大青叶（FoliumIsatidis，简称FI）为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort的干燥叶。味甘，气寒，无毒，入肝、心、胃

3、经，清热凉血，为解毒要药。《名医别录》记载：“疗时气头痛，大热，口疮。”《本草纲目》记载：“主热毒痢，黄疸，喉痹，丹毒。”它既能清心胃实火，治温热病心胃毒盛，发斑发疹，又善解毒利咽，凉血消肿，用治喉痹口疮、咽喉肿痛。据报道，大青叶在临床上多用于流行性感冒持续高热、上呼吸道感染、流行性乙型脑炎、急性传染性肝炎等病毒性疾病。而呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起，其中呼吸道合胞病毒（RSV）居首位［1］。鉴于此，我们从中药大青叶中提取有效成分，制备成大青叶单体，实验选用微孔细胞培养和MTT法，以Hep-2细胞作为体外

4、筛选细胞模型，检测其对RSV的抑制作用，为筛选新型抗病毒药物和大青叶的临床应用提供思路和理论依据。1材料中药大青叶（FoliumIsatidis，简称FI）单体1，2，3，4#（褐色颗粒，溶于水），由华中科技大学同济医学院同济医院药剂科方建国教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制药厂生产，批号080302。Hep-2(鼻咽癌)细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供，RSV由英国Glasgol浓度分种于40孔板，每孔0.1ml。置33℃，5%CO2培养箱中培养24h。待细胞长成单层后，弃培养液上清，换含不同浓度的含药

5、维持液，每孔200μl。大青叶1，2，3，4#单体的浓度分别为10，20，40，80，160，320，640，800，1600μg/ml。每种浓度重复4孔，实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和中药抗病毒口服液对照。继续培养48h后，以MTT法检测细胞存活率。并根据如下公式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。细胞存活率（%）=（药物组平均OD570/细胞对照组平均OD570）×100%。2.3细胞活性测定(MTT染色法)根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞活性。弃培养上

6、清液,每孔加5mg/mlMTT的不含血清的RPMI-164050μl，37℃,5%CO2孵育4～6h,黄色的MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶，小心吸出MTT,PBS洗3次，每孔加50μlDMSO终止反应,振荡混匀,.freelin后甲簪结晶被溶解,在波长570nm下测定吸光度OD值。OD值与活细胞的数量呈正相关。2.4药物抗RSV活性机理的实验2.4.1药物对RSV生物合成的抑制作用实验于已长成单层的Hep-2细胞40孔板上，每孔接种100μl的100TCID50的RSV病毒液，于33℃吸附90min

7、，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在大青叶无毒浓度范围内，加入2，4，8，16，32，64，128μg/ml的不同浓度的含药维持液每孔0.2ml，每日观察CPE,隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照CPE为“+++～++++”（CPE记录方法为：“-”为无CPE;“+”为25%细胞出现CPE;“++”为50%细胞出现CPE；“+++”为75%细胞出现CPE;“++++”为100%细胞出现CPE）时弃培养液上清，用MTT法检测病毒抑制率,并根据如下公

8、式计算药物对RSV的病毒抑制率［2］。病毒抑制率（%）=药物处理组OD570-病毒对照组OD570细胞对照组OD570-病毒对照组OD570×100%2.4.2药物直接灭活病毒实验将50μl的100TCID50/ml滴度的RSV和150μl不同浓度的药物作用4h，反应体系为0.2ml。含并保证药物的终浓度与药效学实验相同。然后将混合液接种于单层