大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究

大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究

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1、大青叶有效单体抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究【摘要】  目的探讨中药大青叶单体1#,2#,3#,4#体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用。方法通过观察病毒引起的细胞病变效应(Cytopathogeniceffect,CPE)和MTT[MethylThiazolylTetrazolium,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测药物抗RSV活性,计算药物对病变的抑制率和半数抑制浓度(50%inhibitingconcentration,IC50),并从药物抗病毒吸附,药物对病毒

2、的直接杀灭作用及抑制病毒在细胞内的生物合成3个方面初步探索大青叶单体抗RSV活性的作用机制。结果大青叶单体1#,2#,3#,4#对RSV无直接灭活作用,也不能阻止RSV的吸附,而能抑制RSV在Hep-2细胞内的的生物合成,其半数抑制浓度(IC50)分别为32.57,26.37,31.60,29.61μg/ml,治疗指数(TI)分别为6.15,10.50,9.21,13.22,其抗病毒效果优于病毒唑(IC50=103.20μg/ml,TI=5.21)和抗病毒口服液(IC50=105.21μg/ml,T

3、I=5.03),P<0.01。结论大青叶单体1#,2#,3#,4#能安全高效地抑制RSV在Hep-2细胞中的增殖,抑制作用发生在病毒入侵细胞后。【关键词】大青叶单体呼吸道合胞病毒细胞病变效应法MTT法  大青叶(FoliumIsatidis,简称FI)为十字花科植物菘蓝IsatisindigoticaFort的干燥叶。味甘,气寒,无毒,入肝、心、胃经,清热凉血,为解毒要药。《名医别录》记载:“疗时气头痛,大热,口疮。”《本草纲目》记载:“主热毒痢,黄疸,喉痹,丹毒。”它既能清心胃实火,治温热病

4、心胃毒盛,发斑发疹,又善解毒利咽,凉血消肿,用治喉痹口疮、咽喉肿痛。据报道,大青叶在临床上多用于流行性感冒持续高热、上呼吸道感染、流行性乙型脑炎、急性传染性肝炎等病毒性疾病。而呼吸道感染中90%以上是由呼吸道病毒引起,其中呼吸道合胞病毒(RSV)居首位[1]。鉴于此,我们从中药大青叶中提取有效成分,制备成大青叶单体,实验选用微孔细胞培养和MTT法,以Hep-2细胞作为体外筛选细胞模型,检测其对RSV的抑制作用,为筛选新型抗病毒药物和大青叶的临床应用提供思路和理论依据。  1材料  中药大青叶(Fol

5、iumIsatidis,简称FI)单体1,2,3,4#(褐色颗粒,溶于水),由华中科技大学同济医学院同济医院药剂科方建国教授提供。病毒唑和抗病毒口服液由南京第三制药厂生产,批号080302。Hep-2(鼻咽癌)细胞为武汉大学典型培养物保藏中心提供,RSV由英国Glasgol浓度分种于40孔板,每孔0.1ml。置33℃,5%CO2培养箱中培养24h。待细胞长成单层后,弃培养液上清,换含不同浓度的含药维持液,每孔200μl。大青叶1,2,3,4#单体的浓度分别为10,20,40,80,160,320,6

6、40,800,1600μg/ml。每种浓度重复4孔,实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和中药抗病毒口服液对照。继续培养48h后,以MTT法检测细胞存活率。并根据如下公式计算细胞存活率,找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。细胞存活率(%)=(药物组平均OD570/细胞对照组平均OD570)×100%。  2.3细胞活性测定(MTT染色法)根据Mosmann建立的四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活性。弃培养上清液,每孔加5mg/mlMTT的不含血清的RPMI-164050μl,37℃,5%

7、CO2孵育4~6h,黄色的MTT被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶,小心吸出MTT,PBS洗3次,每孔加50μlDMSO终止反应,振荡混匀,在15min后甲簪结晶被溶解,在波长570nm下测定吸光度OD值。OD值与活细胞的数量呈正相关。  2.4药物抗RSV活性机理的实验  2.4.1药物对RSV生物合成的抑制作用实验于已长成单层的Hep-2细胞40孔板上,每孔接种100μl的100TCID50的RSV病毒液,于33℃吸附90min,弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果,在大青叶无毒浓度范围内

8、,加入2,4,8,16,32,64,128μg/ml的不同浓度的含药维持液每孔0.2ml,每日观察CPE,隔天换新鲜含药维持液。实验同时设正常细胞对照、病毒对照、阳性药物病毒唑和抗病毒口服液对照。约在病毒对照CPE为“+++~++++”(CPE记录方法为:“-”为无CPE;“+”为25%细胞出现CPE;“++”为50%细胞出现CPE;“+++”为75%细胞出现CPE;“++++”为100%细胞出现CPE)时弃培养液上清,用MTT法检测病毒抑制率,并根据如下公式计算药物

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