斑蝥酸钠对人肺癌lac细胞周期的影响及分子机制的研究论文

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1、斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞周期的影响及分子机制的研究论文【摘要】探讨斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞周期的影响及其分子机制。【方法】取细胞生长期的LAC细胞，分别加入2.5、12.5、25μg/mL的斑蝥酸钠，20μg/mL羟基喜树碱（HCPT），并以生理盐水作用阴性对照，每组均设3个复孔；采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测斑蝥酸钠对人肺癌LAC细胞增殖抑制作用；采用流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡及p53、bcl2基因的蛋白表达。【结果】斑蝥酸钠具有明显的抑制人肺癌LAC细胞增殖的作用，其抑瘤效应优于羟基喜树碱(HCPT)组。斑蝥酸钠作用于肺癌

2、LAC细胞后引起S期细胞明显减少，细胞被阻止于G0/G1期，部分细胞发生凋亡.freelg/L）及bcl2、鼠IgG（205mg/L）均为DAKO公司产品；羊抗鼠FITCIgG、柠檬酸固定液由中科院上海细胞生物研究所流式细胞室提供。1.4主要仪器96孔培养板（英国CORNINC）；CO2培养箱（德国HEREUS）；倒置显微镜（日本OLYMPUS）；博赛（BIOCELLHT）系列酶标仪（美国ANTHOS公司）；微量振荡器（北京海淀电子医疗仪器厂）；流式细胞仪（FACS－420型，美国BECKMANCOULTER公司）。1.5方法1.5.1肿瘤细胞悬

3、液的制备将冻存的人肺癌细胞LAC按常规方法复苏，接种于含体积分数为10%FCS的RPMI1640培养液的50mL培养瓶中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，弃培养液，加入250g/L胰蛋白酶和0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化液37℃消化2～5min，离心弃上清液,重悬细胞于含体积分数10%FCS的RPMI1640培养液中,台盼兰染色活细胞计数,调整细胞数为1×106/mL，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μL。1.5.2药物及浓度阳性对照药HCPT（1mg/mL）和实验用药斑蝥酸钠0.05mg/mL，依据静滴给药后，药物的血浆峰值（

4、ρ1）浓度计算公式，ρ1/（μg·ml-1）［ρ2/(mg·mL-1)为每日用药量］。实验时根据换算结果加入到细胞培养液中，进行各项实验检测。斑蝥酸钠注射液成人给药量为0.5mg/d，依上述公式计算，得出斑蝥酸钠注射液的血浆峰浓度为2.5μg/mL。据此，斑蝥酸钠注射液实验浓度设定为2.5、12.5、25μg/mL3个浓度（以下简称BM1、BM2、BM3）；阳性对照药物HCPT。成人给药量为4mg/d，设定实验浓度为20μg/mL，以生理盐水（NS）为阴性对照组。1.5.3MTT法检测细胞增殖［3］96孔板置于37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度培养

5、箱中培养24h，实验孔分别加入HCPT10μL和BM1、BM2、BM3各10μL，对照孔加入等量NS液，每组3孔。继续培养48h，离心弃上清，每孔加入MTT（5mg/mL，10μL），继续培养6h，再离心弃上清，加入DMSO100μL，置微量振荡器5min，即放入自动读数酶标仪，以570nm为检测波长，测各孔的吸光度（D）值，根据下列公式计算抑瘤率：p抑瘤/%=（D对照组－D实验组）/（D对照组×100%。将实验重复3次。1.5.4流式细胞仪定量检测药物作用后肿瘤细胞凋亡将冻存的人肺癌细胞LAC按常规方法复苏，接种于含体积分数为10%FCS的RPMI

6、1640培养液的50mL培养瓶中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，随机分组加药，加入斑蝥酸钠注射液2.5μg/mL(血浆峰浓度)、HCPT20μg/mL，并设NS为对照组,置37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，药物作用48h后，离心收集细胞，用体积分数70%乙醇固定，进行流式细胞仪分析。上机前离心去除固定液，采用溴化乙啶（EB）一步插入法，DNA定量荧光染色（染液含EB10μg/mL、RNA酶10μg/mL，1%TritonX100），每组设3份样品，每份样品细胞调至1×106/mL，0℃～4℃染色30min后，流式细胞仪上机检测。

7、将实验重复3次。1.5.5流式细胞仪检测LAC细胞p53、bcl2基因的蛋白表达细胞悬液的制备同1.5.4。上机前离心去除固定液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，分别加入1：100稀释的鼠抗人p53单抗和1：40稀释的bcl2单抗，37℃孵育30min，PBS洗2次，弃上清，加入1：20稀释的羊抗鼠FITCIgG100μL，37℃孵育30min，离心洗2次，加入1mLPBS，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。BiosConsort30软件处理数据，计算阳性蛋白标记率。将实验重复3次。1.5.6统计学处理结果比较用方差分析，并行两两比较的q检验，

8、全部数据处理均在微机上用SAS6.04软件完成。2结果2.1斑蝥酸钠对LAC细胞增殖的影响表1结果显示，斑蝥