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1、川芎简单序列重复间区多态性和扩增片段长度多态性分子标记技术多态性比较研究论文陈要臻，王岚，马逾英，张正银，樊哲仁，唐琳【摘要】目的寻找川芎的高效分子标记。方法以四川崇州都江堰、新都3个产地的川芎为材料，应用100条简单序列重复间区多态性（ISSR）引物、64对扩增片段长度多态性（AFLP）引物对30个川芎个体进行多态性筛选。结果筛选到简单序列重复间区多态性特异性引物共10条，扩增片段长度多态性特异性引物共6对；分别扩增出106和256条条带.freelchuanxiongHort.为伞形科藁本属的多年生植物，是著名传统中药材。以根茎供药用，具有活血行气，祛风止痛的功效
2、，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕腹痛、胸肋刺痛、头痛、风湿痹痛等［1］。在中国普遍分布在四川、江西、云南、吉林、甘肃、贵州、江苏等省。四川为川芎道地产区［2］，川芎已有一千五百多年栽种的历史。长期的自然选择和人工选择使不同产地的川芎从外部形态到有效成分的组成及含量上均存在一定差异［3］。但目前有关川芎的研究大多集中在药用成分分析，药理作用等方面［3，4］，遗传多样性研究几乎是空白。因此，寻找高效率鉴定川芎不同种质资源的有效分子标记技术方法具有重要意义。简单序列重复间区多态性(ISSR)和扩增片段长度多态性(AFLP)这两种分子标记方法已在遗传群体结构分析、亲缘关系分析以
3、及基因图谱构建等方面得到了应用［5～8］。ISSR与AFLP标记均具有无需预先知道受试基因组DNA序列,DNA用量少,灵敏度高,对反应条件不敏感,重复性好,能提供丰富的关于基因组的信息等优点,一般而言,AFLP具有更高的灵敏度,能检测出更高的遗传多样性,但所需仪器和药品价格昂贵,实验成本高,.freel以上，每株采集的叶片迅速装入自封袋中用硅胶干燥保存，并尽快进行总基因组DNA的提取。2方法2.1基因组DNA的提取采用CTAB,并进行改良［10］。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，紫外分光光度仪测定DNA浓度。2.2ISSR扩增及检测ISSR引物(UBCsetNo.9
4、)由加拿大哥伦比亚大学提供。从100条引物筛选出扩增条带清晰、重复性较好的引物用于PCR扩增。ISSR反应体系为25μl,包括2μlDNA模板(25ng/μl)、0.5μl引物(1mmol/L)、5μldNTP(1mmol/L)、2μl10×PCRbuffer，1UrTaqDNA聚合酶和14.5μlddH2O。dNTP，rTaqDNA聚合酶均购自TaKaRa公司;扩增反应在PTC100TM(ProgrammableThermalCon2troller,MJResearchInc,美国)PCR扩增仪上进行;PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s，48～
5、52℃退火45s，72℃延伸2min,共计45个循环;72℃延伸7min;4℃10min终止反应;扩增反应结束后,用2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE),电压80V,电泳时间30min,然后用EB染色,凝胶成像系统照相,观察扩增结果。2.3AFLP扩增及检测接头与引物按照文献［11］提供的序列,由北京赛百盛公司合成。从选择性引物中筛选出条带清晰、反应稳定的引物组合进行AFLP分析;AFLP反应参照文献［12］进行。取400ng总DNA用EcoRⅠ(Biolabs)和MseⅠ(Biolabs)双酶切,酶切产物用T4-连接酶(TaKaRa)与接头连接;然后用无选择性碱基的引物
6、进行预扩增,预扩增程序为:94℃变性2min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环后,72℃延伸5min,PCR反应结束后,置4℃保存。取10μl预扩增产物0.1×TE稀释10倍,作为选择性扩增反应模板;选择性扩增采用“Touchdoin,94℃变性30s,65℃退火30s(每个循环降低0.7℃),72℃延伸1min,共12个循环;94℃变性30s,55.5℃退火30s,72℃延伸1min,在进行23个循环后,72℃延伸5min，PCR反应结束后，置4℃保存；5μl选择性扩增产物样品加入等体积甲酰胺染液在95℃加热5min后立即在冰浴中冷
7、却。以100bpLaddermarker作参照，用6%的变性聚丙烯酰胺胶,70I)。E=n×PPB(n为每对平均引物扩增的条带数)；MI=E×H。用NTSYS-pcVersion2.10e软件进行UPGMA(Unethodusingarithmeticaverage,非加权配对算术平均法)聚类分析，得到30个样品的聚类树状图。用TFPGA软件的Mantel检验软件检测这两种标记的相关性。3结果3.1ISSR与AFLP的多态性效率比较利用合成的100条ISSR引物对30个川芎进行PCR扩增，初步筛选10条引物(见表1)。这10条ISSR引物共产生了10
