腺病毒载体介导scl基因转染 cajal间质细胞及其表达

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1、腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal间质细胞及其表达作者：张林童卫东刘宝华李春穴　【摘要】目的构建含有人干细胞白血病(stemcellleukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体，并观察其对Cajal间质细胞的转染及其介导的SCL基因的表达。为下一步在体转染Cajal间质细胞，观察其对Cajal间质细胞表型逆转的影响奠定基础。方法利用AdEasy系统、细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒AdGFP/SCL。通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对培养的Cajal间质细胞的转染效率。通过RTPCR法分析转染Cajal间质细胞后SCLmRN

2、A的表达。结果酶切鉴定及PCR结果证明成功构建了含有人SCL基因的重组腺病毒，病毒滴度为1.6×1011pfu/ml；对Cajal间质细胞的转染率高达100%；RTPCR法检测转染Cajal间质细胞后SCLmRNA有表达。结论成功构建的含人SCL基因的重组腺病毒对Cajal间质细胞有很强的转染能力，可介导SCL基因在Cajal间质细胞中表达。【关键词】腺病毒载体；干细胞白血病基因；同源重组；转染；Cajal间质细胞【Abstract】ObjectiveToconstructrebinantadenovirusvectorcontaininghu

3、manstemcellleukemia(hSCL)genetoobserveitsabilityintransfectingCajalinterstitialcellsandmediatingSCLgeneexpression,aylaybasisforfurtherinvivotransfectionofCajalinterstitialcellstoobservetheeffectoftherebinantadenovirusvectoronchangesofmonotypeofCajalinterstitialcells.MethodsTh

4、erebinantadenovirusAdGFP/SCLbasedonthehomologousrebinationinbacteria.Then,CajalinterstitialcellsculturedinvitroediatedhSCLicroscope.TheexpressionofhSCLmRNAtransfectedeasuredbyRTPCRmethod.ResultsRestrictionendonucleaseandPCRanalysesconfirmedthatthehSCLgenel.Theadenovirushada

5、hightransfectionefficiencyupto100%.RTPCRanalysisshoRNAinCajalinterstitialcellstransfectedbyhSCL.ConclusionsTherebinantadenoviruscontaininghumanhSCLgeneissuccessfullyconstructedbyhomogenousrebinationinbacteriaandithasahightransfectionefficiencyandcanmediateexpressionofCajalin

6、terstitialcells.【Keycellleukemiagene;Homogenousrebination;Transfection;Cajalinterstitialcells干细胞白血病(stemcellleukemia,SCL)基因最早发现于T淋巴细胞急性白血病细胞内，编码一种螺旋环螺旋类转录因子。研究证明SCL是ckit上游的重要调控基因，通过作用于ckit基因启动子调节ckit表达，具有强烈的促ckit表达作用［1］。近期研究表明，一些外源性因素导致ckit表达下调，引发SCF/ckit通路异常，驱使Cajal间

7、质细胞发生平滑肌细胞样表型转化(而非凋亡)，最终导致胃肠动力障碍，可能是慢传输型便秘(sloega公司，脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自Roche公司，小量质粒DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Omega公司，RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司，PCR引物由上海生物工程有限公司合成。1.2重组腺病毒的快速构建参照2结果2.1构建的中间质粒及重组腺病毒鉴定酶切鉴定：对pcDNA3.1(+)/SCL质粒进行EcoRⅠ酶切，可得到约1kb小片段和约5kb大片段，其中约1kb小片段与插入的目的片段大小相一致(图1)。对pAd

8、TrackCMV/SCL质粒进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切，前者得到约1kb小片段和约9kb大片段，其中约1kb小片段与插入的目的片段