腺病毒介导egfp基因转染神经干细胞的实验研究论文

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1、腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究论文【摘要】目的探讨腺病毒（adenovirus）介导的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在神经干细胞（NSCS）的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒（Ad/EGFP）转染NSCS，在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况，同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16h后NSCS发出绿色荧光，在第7天左右荧光强度达高峰并可

2、持续稳定表达20天左右，Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光，部分细胞β-Ⅲtubulin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异（P0.05）。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS，且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。【关键词】神经干细胞腺病毒增强型绿色荧光蛋白转染基因表达Abstract:ObjectiveToobservetheexpres

3、sionofenhancedgreenfluorescentprotein（EGFP）inneuralstemcells（NSCS）ediatedenhancedGFPgene（Ad/EGFP）andthechangesinthebiologicalcharactersofNSCSinrelationtothetransfection.MethodsNSCSfromthehippocampusofneonateraticroscopeandfluorescentmicroscope.Thevitali

4、ty,.freelultiplicationanddifferentiationofthecellsinedbyusingtrypanbluestainingetc.,andtheresultsissionofgreenfluorescenceinneurospheresstarted16hoursafterthetransfection,intensifiedgradually,reacheditspeakonday7andmaintainedthathighlevelformorethan20da

5、ys.ThegreenfluorescenceultiplicationanddifferentiationbetethodforgeiclabelingofNSCS.Keycells;adenovirusvector;enhancedgreenfluorescentprotein;transfection;geneexpression神经干细胞（NSCS）是指一类具有多分化潜能（能分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞），能自我更新和克隆性增殖的一群细胞［1］。在NSCS移植研究中.freela

6、公司），β-Ⅲtubulin单克隆抗体（Sigma公司），生物素标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉生物试剂公司），山羊抗兔Cy3-IgG（博士德公司），DAB（北京中杉生物试剂公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物试剂公司）。仪器：CO2培养箱（Thermo，美国），荧光倒置相差显微镜（OlympusIX70，日本）。病毒载体：Ad/EGFP，滴度为2×1011pfu/L。1.3方法1.3.1NSCS的分离、培养及鉴定取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒，取脑，分离海马，剥离脑膜血管，将海马组织移入含有2%

7、B27的高糖DMEM/F12培养液中，尽量将组织剪碎，轻轻吹打制成细胞悬液，400目筛网过滤，台盼蓝染色，细胞计数，以2×106个/L接种到6孔培养板内，最后加入EGF（终浓度20μg/L）和bFGF（终浓度20μg/L），置37℃、5%CO2平衡湿度培养箱中。每2～3天半量换液1次，每7～10天传代1次。对第3代培养7天的细胞球参照文献［3］用Nestin免疫荧光染色法进行鉴定，荧光倒置相差显微镜观察拍照。1.3.2Ad/EGFP转染NSCS把第3代培养7天的细胞按2×105个/孔接种到24孔板，每

8、孔加入DMEM/F12+EGF+bFGF培养液1ml，转染前1天半量换液。实验分为5组，感染复数（multiplicityofinfection，MOI）分别为0∶1（对照组）、10∶1、20∶1、50∶1、100∶1，每组设8孔。根据感染复数计算加入所需腺病毒悬液的体积数，在EP管中将所需的腺病毒悬液与无血清的DMEM/F12培养液混合，将混合液按照分组分别加入到每组细胞中，每孔0.2ml。将24孔板置于37℃、5%CO2培养箱中培养，4h后用DMEM