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时间:2018-07-07
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1、腺病毒介导EGFP基因转染神经干细胞的实验研究【摘要】目的探讨腺病毒(adenovirus)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在神经干细胞(NSCS)的表达规律及转染对神经干细胞增殖、分化的影响。方法用不同感染复数的携带EGFP基因的腺病毒(Ad/EGFP)转染NSCS,在荧光倒置相差显微镜下观察EGFP的表达情况,同时用台盼蓝染色、细胞球计数、免疫细胞化学方法分别检测对照组和转染组细胞的活力、增殖、分化情况。结果Ad/EGFP转染16h后NSCS发出绿色荧光,在第7天左右荧光强度达高峰并可持
2、续稳定表达20天左右,Nestin表达阳性。在分化后细胞的胞体与突起均可见绿色荧光,部分细胞β-Ⅲtubulin、GFAP表达阳性。同时观察到对照组和转染组的NSCS在第7天、14天、21天时细胞活力、增殖、分化情况均无统计学差异(P>0.05)。结论Ad/EGFP可以高效转染新生大鼠海马NSCS,且不影响NSCS的存活、生长和分化。EGFP基因是神经干细胞的理想的报告基因。【关键词】神经干细胞腺病毒增强型绿色荧光蛋白转染基因表达Abstract:ObjectiveToobservetheex
3、pressionofenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)inneuralstemcells(NSCS)ediatedenhancedGFPgene(Ad/EGFP)andthechangesinthebiologicalcharactersofNSCSinrelationtothetransfection.MethodsNSCSfromthehippocampusofneonateraticroscopeandfluorescentmicroscope.Thev
4、itality,multiplicationanddifferentiationofthecellsinedbyusingtrypanbluestainingetc.,andtheresultsissionofgreenfluorescenceinneurospheresstarted16hoursafterthetransfection,intensifiedgradually,reacheditspeakonday7andmaintainedthathighlevelformorethan20d
5、ays.ThegreenfluorescenceultiplicationanddifferentiationbetethodforgeiclabelingofNSCS.Keycells;adenovirusvector;enhancedgreenfluorescentprotein;transfection;geneexpression神经干细胞(NSCS)是指一类具有多分化潜能(能分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞),能自我更新和克隆性增殖的一群细胞[1]。在NSCS移植研究中,有必要对
6、NSCS进行示踪标记,以便实时跟踪和区分植入的NSCS和宿主细胞。绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因是一种新的报告基因,其表达产物GFP可在紫外光或蓝色光激发下稳定地发出绿色荧光,不需要任何底物或辅助因子。在GFP的基础上进行F64L和S65T突变后的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)进一步增强了GFP的荧光性能,使结果更容易观察检测[2]。本实验从新生SD大鼠海马组织中分离神经干细胞,并通过观察携带EGFP基因的腺病毒(Ad/EGFP)转染NSCS后EGFP表达
7、规律及转染对NSCS的活力、增殖、分化等的影响,探讨EGFP作为NSCS的示踪标志物的可行性,为进一步的NSCS移植研究提供体外研究基础。1材料和方法1.1动物24h之内的新生SD大鼠,由徐州医学院实验动物中心提供。1.2主要试剂和仪器DMEM/F12、B27、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮生长因子)均购自Gibco公司。抗体为:Nestin兔抗鼠多克隆抗体(博士德公司),GFAP单克隆抗体(Sigma公司),β-Ⅲtubulin单克隆抗体(Sigma公司),生物素标记山羊抗小鼠I
8、gG(北京中杉生物试剂公司),山羊抗兔Cy3-IgG(博士德公司),DAB(北京中杉生物试剂公司),胎牛血清(FBS,杭州四季青生物试剂公司)。仪器:CO2培养箱(Thermo,美国),荧光倒置相差显微镜(OlympusIX70,日本)。病毒载体:Ad/EGFP,滴度为2×1011pfu/L。1.3方法1.3.1NSCS的分离、培养及鉴定取新生大鼠置于0.5%碘伏中消毒,取脑,分离海马,剥离脑膜血管,将海马组织移入含有2%B27的高糖DMEM/F12培养液中,尽量将组
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