降解纤维素菌种筛选与纤维素降解分析

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1、-------国内图书分类号：Q933国际图书分类号：579.25工学博士学位论文降解纤维素菌种筛选及纤维素降解研究博士研究生：白洪志导师：杨谦教授申请学位：工学博士学科、专业：环境科学与工程 所在单位：生命科学与工程系答辩日期：2008年10月 授予学位单位：哈尔滨工业大学-----------ClassifiedIndex:Q933 U.D.C:579.25DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringSCREENINGOFCELLULOSEDEGRADATIONFUNGIANDTHEST

2、UDYOFITSDEGRADATIONCHARACTERISTICSCandidate:BaiHongzhiSupervisor:Prof.YangQianAcademicDegreeAppliedfor:DoctorofEngineering Speciality:EnvironmentalEngineering Affiliation：LifeScienceandEngineeringOct,2008DateofDefence:HarbinInstituteofTechnologyDegree-Conferring-Institut

3、ion:-----------摘要摘要利用纤维素的最佳方法是微生物降解转化，鉴于目前纤维素降解菌株酶活力低、纤维素酶诱导产酶及纤维素降解机理不完全清楚等限制纤维素资源有效利用的情况下，为了有效利用纤维素这种可再生能源，筛选高效降解菌，研究菌株产酶机制以及纤维素降解机理仍然具有重要的理论和实践意义。本文从57份土样中，通过分离纯化得到97株菌株。对其进行刚果红鉴别培养基和滤纸条液体培养法初筛，并结合复筛得到2株纤维素酶活较高的菌株。经形态学鉴定H-11为简青霉（Penicilliumsimplicissimum），C-08为绿色木霉（Tr

4、ichodermaviride）。研究了几种影响二菌株发酵产酶的因素，液体发酵结果表明：麸皮和稻草为适合碳源，两者比例H-11为4:3，C-08为5:2；最适有机氮源为豆饼粉，而无机氮源分别是KNO3和(NH4)2SO4。H-11产酶最适为豆饼粉，而C-08产酶的(NH4)2SO4:豆饼粉比例为1:5。最适产酶碳源和氮源比例，H-11为7:1，C-08为5:1；最适百分含量，都为3.6%；最适产酶pH，H-11为3.6，C-08为3.2；最适温度都为30℃；最适产酶时间H-11为144h，C-08为96h。固态发酵结果表明：秸秆粉和麸皮

5、为2∶4最适合产酶；尿素和氨态氮 适合H-11产酶。氨态氮适合C-08产CMCase，NO3-利于产Xylanase，其中NH4NO3最好；料水比1∶1比较适合H-11产CMCase，1∶1.5适合产Xylanase。料水比1∶2适合C-08产CMCase，1∶2.5适合产Xylanase；H-11随底物粒度的降低CMCase增加，在60~100目时产Xylanase最低。稻草粉粒度40~100目时，适合C-08产CMCase，此范围外适合产Xylanase；初始pH为3和4时则适合H-11菌株产CMCase和Xylanase。pH值为

6、4适合C-08 产酶；孢子接种量为7~8×107孢子/mL时适合两株菌产酶；28℃适合H-11产酶，在低于28℃时适合C-08产酶；发酵时间H-11为60h，C-08为72h。 固定化研究表明，制备小球的最适海藻酸钠溶液浓度为5%。麸皮汁较适 合菌株产酶，H-11比C-08产酶能力强。菌株间亲和性不强。H-11则在pH为3 和4时，更适合产CMCase和Xylanase，C-08产酶适宜pH为7。固定化细胞产酶 能力强于游离细胞。Tween-80有利于提高菌株的产酶活力。利用液体培养和洗涤菌丝诱导培养法研究了碳源对菌株的诱导特性。结果发

7、现D-甘露糖对H-11有较好的诱导作用，葡萄糖对C-08有较好的产酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08产生FPase、CMCase、C1和β-Gase，各种酶------------I------------哈尔滨工业大学工学博士学位论文产量在菌株间及菌株内差别很大。制备细胞外、细胞壁膜、细胞内纤维素酶，并用其分别转化纤维二糖，对转化产物高效液相色谱定性分析，从而探讨碳源的诱导本质。结果显示：H-11胞内酶和C-08的胞外酶的转化产物，除产生葡萄糖外，亦产生一种未知的物质A。胞壁膜酶无转化作用。H-11的胞外酶和C-08的胞内酶液对纤维

8、二糖除水解外亦有转化作用。从而证明纤维二糖不是菌株的诱导物。将H-11液体发酵粗酶液经硫酸铵分级沉淀、柱层析后得到电泳纯的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase组分。对纯组分的理化性质研究表明：三组分