复方君子汤诱导白血病k562细胞凋亡的机制研究

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1、复方君子汤诱导白血病K562细胞凋亡的机制研究摘要：目的本研究探讨复方君子汤对抑制白血病K562细胞生长增殖和诱导凋亡的作用机制。方法用不同浓度复方君子汤作用于K562细胞，应用MTF法观察复方君子汤对K562细胞生长增殖的影响，AnnexinV/PT染色和流式细胞仪检测细胞凋亡，Westernblot检测Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达。结果在一定浓度的复方君子汤作用后的K562细胞的增殖被抑制，随着浓度的增加及使用时间的延长，K562细胞的增殖抑制率及凋亡比例明显增加；同时，Caspase-8蛋白及FaS蛋白的表达明显上

2、升。结论一定浓度的复方君子汤可抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与上调Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达有关。关键词：复方君子汤；白血病；K562细胞；细胞凋亡;机制中令D分类号：R289.5文献标志码：A文章编号：1007-234903-0018-04白血病是一种常见的恶性血液系统肿瘤，严重危害人类生命健康，细胞分化与凋亡受阻是白血病发病的重要机制之一，因此探索诱导白血病细胞凋亡的新药是目前研究白血病治疗的热点之一。中医认为白血病的发病是由于机体正气亏虚，邪毒伤髓，毒瘀互结，继而发病，治疗上当遵循益气养阴、扶正祛邪

3、与活血化瘀三法并用之原则，复方君子汤是福建中医药大学附属人民医院经过临床实践总结而成，在急性白血病的临床治疗中取得良好疗效。为进一步研究复方君子汤抗白血病的生物学作用，笔者观察了复方君子汤对人白血病细胞K562生长的影响，并对其相关作用机制进行了探讨。现将结果报道如下。1材料和方法1.1主要试剂复方君子汤由福建中医药大学附属人民医院中药制剂室提供。四甲基偶氮唑蓝购自Serva公司；胎牛血清购自杭州四季青生物公司；台盼蓝购自Chroma公司;改良型PRMI-1640培养基为海克隆生物化学制品公司产品；二甲亚砜购自北京化工厂；Annex

4、inV/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。1.2细胞来源人红白血病细胞株K562由河南省肿瘤医院中心实验室提供。1.3主要仪器倒置相差显微镜为日本OLYMPUS公司产品；水套式c02培养箱为长沙长棉应用技术研究所产品；立式灭菌器为山东新华医疗器械公司生产；电热恒温鼓风干燥箱为上海新苗医疗器械公司产品；酶标仪为BIORAD公司生产；净化工作台为苏浄集团公司产品；流式细胞仪为BeckmanCoulter公司产品；高速低温离心机为Beckman公司产品。1.4细胞培养K562细胞使用含10%小牛血清、链霉素及青霉素各10

5、0U/ml的nyQ改良型PRMI-1640培养液培养，置于浓度为5%，温度为37°C、湿度为100%的C02培养箱中培养，每2-3天换液1次，选取对数生长期细胞进行实验。1.5MTF法测定细胞增殖抑制率选取对数生长期K562细胞按2.0xl05/ml密度分别接种于96孔培养板，随机分为五组，分别为：①空白对照组;②As:03组：加入AS2O3；③复方君子汤组：加复方君子汤，每组设8个平行复孔，置于CO2培养箱中共同培养，分别于24h，48h.72h取各组培养板，每孔加入20glMTF，继续培养4h，离心后弃上清液，加入lOOulDM

6、SO，摇匀并震荡lOmin，在酶标仪上读取450nm处测吸光值。计算K562细胞增殖抑制率=[1-]><100%。1.6AnnexinV/PI双染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡分别收集各组培养24h，48h，72h后的细胞，并将其浓度调整为5.0xl05/mL。将细胞重悬浮于100

7、iL结合缓冲液。加入10uLAnnexinV和5uLPI，轻轻混匀，4°C避光反应30分钟。再加入100

8、J结合缓冲液，在1小时内上机检测荧光强度，重复3次。1.7Westernblot检测Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表达收集经10.0mg/L的复

9、方君子汤处理后的K562细胞2.0xl05/ml,经离心、PBS缓冲液洗涤，同时设立不加药物的空白对照组，用1xNuPAGELDS细胞裂解液裂解细胞后，采用考马斯亮蓝法测定总细胞提取液中的蛋白浓度。取30Rg经SDS-PAGE电泳分离，然后转移至醋酸纤维素膜上，5%无脂牛奶封闭2h，加一抗在4°C过夜孵育，TBS缓冲液洗涤3次，二抗室温孵育2h,化学发光法检测蛋白表达。1.8统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示，两组均数之间比较采用t检验；组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用卡方检验。