eb病毒lmp2t b细胞重叠表位的预测 筛选及鉴定

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1、优秀毕业论文温州医学院硕士论文EB茄莓LMP2T、B细胞重叠表位的预测、筛选和鉴定中文摘要目的：基于本实验室对EB病毒(Epstein．Barrvirus，EBV)潜伏膜蛋白2fEBLatentmembraneprotein2,LMP2)B细胞表位筛选的结果，对已筛选的3个免疫优势B细胞表位及其上下游的氨基端肽段预测其T表位，进一步筛选和鉴定EBVLMP2T、B细胞重叠表位，为其单克隆抗体的制备及EBV相关肿瘤免疫防治研究提供理论依据。采用SYFPEITHI细胞表位在线预测服务(http：／／www．syfpeithi．de／)。运用SYFPEIn缸服务器上的E

2、PITOPEPREDICTION方法，在本实验室已筛选的3个B细胞优势表位及其上下游分析预测MOMP的HLA．A*0201限制性细胞毒T细胞(cytotoxicityTcell，CTL)表位。根据筛选肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分，选择分值较高的氨基酸肽段为免疫优势T细胞表位，即为EBVLMP2CTL表位和B细胞重叠表位，并进一步对筛选的T、B细胞重叠表位进行鉴定和免疫效应的研究。方法：1．EBVLMP2HLA—A*0201限制性CTL和B细胞重叠表位的预测从SwissProt蛋白数据库获得EBVLMP2的氨基酸序列，以数据库Syfpei

3、thi、NetCTL为主、并结合HLA．Bind、Rankpep等在线软件，对本实验室已鉴定的3个EBVLMP2免疫优势B细胞表位及其上下游肽段，分别预测EBVLMP2中HLA．A*0201限制性CD8+CTL表位，结果其中2个B细胞表位上下游分别重叠含CTL表位，选择CTL和IB细胞表位重叠的EBVLMP2中的氨基酸短肽，作为T、B细胞重叠优势表位为目的表位进行鉴定，并进一步进行免疫效应的研究。2．表位肽的合成由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案进行合成，采用高效液相色谱法IqPLC纯化及进行质谱法分析鉴定。3．CTL和B细胞重叠表位肽的鉴

4、定对上述合成的CTL和B细胞重叠表位肽作进一步鉴定。(1)重叠表位肽的CTL表位活性鉴定：①利用T2细胞分析预测的重叠肽与HLA．A*0201分子结合的亲和稳定性：②利用乳酸脱氢酶(LDH)释放法，检测重叠精品参考文献资料优秀毕业论文温州医学院硕士论文表位肽诱导的体外细胞毒杀伤活性；③通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色(ICS)方法，检测重叠表位肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN，水平，鉴定EBVLMP2的HLA-A*0201限制性CTL表位的活性。(2)重叠表位肽的B细胞表位活性鉴定：利用动物免疫的方法，即采用纯化的合成肽偶联BSA，在BALB／C雌性小

5、鼠(5只／组)后背部皮下多点免疫注射，以沙眼衣原体(ct)主要外膜蛋白(MOMP)表位肽偶联BSA为对照，共免疫3次，间隔两周，于免疫第0w，1w，3w，5w，7w，9w周分别收集血清，制备免疫血清抗体。采用间接ELISA方法检测重叠表位肽在不同免疫时间段的抗体效价，免疫原性，及其诱导抗体与EBV抗原的结合能力是否受CTL表位存在的影响。结果：1．CTL和B细胞重叠表位预测结果及初步筛选根据Syfpeithi预测，以本实验室对EBVLMP2的B细胞表位鉴定结果为基础，选择含分值较高的HLA-A*0201限制性CTL表位RIEDPPFNSL(199～2081、LS

6、STEFIPNL(383-392)作为目的CTL和B细胞重叠表位肽，分别命名为EBpl3、EBpl4。同时以HLA．A241j艮锖tJ性表位肽TYGPVFMCL(419～427)作为阴性对照，以HLA—A*0201限制性CTL表位肽LLWTLVVLL(329～337)作为阳性对照，分别命名为EBpl1NEBpl2。2．重叠表位肽的合成由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案合成，经高效液相色谱法HPLC纯化，以此获得纯度接近或高于95％的肽产物，经质谱法MS鉴定氨基酸的序列，同时测定分子量，所得测定值与理论值相符。成功获得了高纯度的合成肽EBpl

7、1、EBpl2、EBpl3矛IEBpl4，为进一步表位鉴定奠定了基础3．重叠表位肽的进一步鉴定(1)肽亲和稳定实验结果：显示重叠表位肽EBpl3、EBpl4与T2细胞的结合亲和力(FI)分别为3．21、2．24，稳定性DC50均>8h；阳性肽EBpl2与阴性肽EBpll的亲和力(FI)分别为5．00和1．58，稳定性DC50分别为>8h和<2h。本实验筛选的EBpl3和EBpl4与T2细胞的结合的亲和力以及稳定性与与阴性对照肽有显著性差异(Po．05)。(2)LDH释放试验结果：利用HLA．A2阳性个体的外周血单个核

8、细胞(PBMC)为效应细