大黄鱼内脏白点病的研究

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1、华中农业大学硕士学位论文大黄鱼内脏白点病的研究姓名：邱杨玉申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：陈孝煊；毛芝娟201206大黄鱼内脏白点病的研究摘要2011年1月，浙江省象山港网箱养殖的大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)出现了一种严重病害，病鱼体表无明显症状，解剖可见脾、肾等内脏出现白点或小结节，造成了大黄鱼的大量死亡。从患病大黄鱼内脏中分离到的病原菌，通过生理生化和分子生物学方法鉴定，以及人工感染等确定其为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)；同时通过组织切片方法，发现在病鱼的肝脏、肾脏、脾脏等组织均发生炎性病变，细胞变形或解体，在脾、肾等组织

2、中，纤维组织增生，围绕菌体形成肉眼见到的“白点”。本研究中建立了一种快速检测致病菌的可视化环介导恒温扩增(Lj6山Ⅲ)方法，针对恶臭假单胞菌基因的保守DNA序列(rpoN)设计4条特异性引物(两条内引物FIP、BIP和两条外引物F3、B3)进行LAMP扩增。优化反应条件后检测到恶臭假单胞菌PT01纯培养物的灵敏度为每个反应4．8cfu，是传统PCR反应灵敏度的10倍左右。本方法能够特异性地从10种不同的革兰氏阴性菌中区分出恶臭假单胞菌，还能够检测到感染鱼体内的致病菌DNA。此外，可视化LAMP方法能够有效避免交叉感染，将SYBRgreenI埋入高熔点微晶蜡中，石蜡块在反应前放入

3、管中，反应后85。C时石蜡融化，染料就能与DNA扩增产物结合。可视化LAMP方法的简单，高灵敏度，高特异性以及低成本的特点使其有望发展成为快速检测恶臭假单胞菌的有效手段。通过杯碟法检测恶臭假单胞菌胞外产酶情况，检测菌株均不产生酪蛋白酶、淀粉酶、磷脂酶等胞外酶，且不具有溶血性。通过银染法观察到恶臭假单胞菌生物膜的形成，确定其容易形成生物膜结构。然后制备了脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、全菌抗原(FKC)等多种免疫成分，对大黄鱼进行人工免疫，21d后通过测定血清中凝集抗体效价、溶菌酶活性、白细胞吞噬活性以及免疫保护率来探讨这些保护性抗原对大黄鱼免疫机能的影响。经FKC免疫后的

4、大黄鱼，其血液白细胞的吞噬活性和血清中的溶菌酶活性在一定程度上有所上升，但与对照组相比并无显著差异(P>O．05)。但FKC免疫组血清抗体效价显著高于对照组(PO．05)。后期的人工攻毒试验也验证了仅FKC免疫组提供了一定的保护(RPS40％)。关键词：恶臭假单胞菌；白点病；病理；LAMP；生物膜；免疫华中农业大学2012届硕士学位论文AbstractIntherecentyears，anewepidemicdiseaseoccurredinnet-cage

5、culturedlargeyellowcroaker(Pseudosciaenacrocea)inXiangshanbay，ZhejiangProvinceresultinginseverelossesinspringandwinter．Diseasedfishshowednoobvioussymptomsontheoutside，butmanywhitespotsof0．5—1．0nllllindiameterinthespleenandkidneywereobserved．Theisolationandidentificationofthecausativeagentinc

6、ombinationwith16SrRNAsequencingshowedthebacteriumPseudomonasputidatoberesponsibleforthatdisease．ThetissuesofdiseasedfishwerepathologicallyanalyzedbyparaffmhistologicalsectiontechniquesandtheisolatedstrainPT01Wasdeterminedasthecausativeagentbyartificialinfection．Affectedfishshowedobviousinfla

7、mmationandcelldeformationordisintegrationoftheliver，kidneyandspleen．Thispaperreportsthedevelopmentofavisualloop—mediatedisothermalamplification(LAMP)assayforrapiddetectionofthepathogen．Fourprimers，F3，B3，FIPandBIP，weredesignedonthebasisofDNAsequence