土壤中微生物dna高效提取方法筛选

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1、土壤中微生物DNA高效提取方法筛选　　摘要：设计了3种从土壤中直接提取微生物DNA的方法，并通过PCR扩增和DGGE电泳比较了不同方法所提取DNA的质量以及对后期分子生物学研究的适用性。结果表明，化学法和酶法相结合的提取方法所获得的DNA完整性最好，适用于PCR扩增，并且通过DGGE电泳分离出最丰富的条带，是一种高效的提取土壤微生物DNA的方法。关键词：土壤微生物；DNA提取；PCR；DGGE中图分类号：Q939.96；Q523文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）01-0216-04Screenin

2、gtheExtractingMethodofTotalMicrobialDNAfromSoilZHOUWei1，HUANGJin-yong2，LIXin-wei1（1.LuoheMedicalCollegeofHigherEducation，Luohe462002，Henan，China；2.BioengineeringDepartment，ZhengzhouUniversity，Zhenzhou450001，China）Abstract：Threemethodsweredesignedtoextractmicrob

3、ialDNAdirectlyfromthesoil，andthedifferentextractionmethodswereevaluatedcomprehensivelyfortheDNAqualityand12applicabilityofthemolecularbiologybyPCRandDGGE.TheresultssuggestedthatthecombinationofenzymaticandchemicalmethodscouldobtainthehighestDNAyieldandintegrity

4、，whichwassuitableforPCR，andthemostabundantbandscouldbeobtainedbyDGGE.ThisdevelopmentofthehighlyeffectiveDNAextractionmethodprovidedafoundationforstudyinginmolecularecologyofsoilmicrobes.Keywords：soilmicrobe；DNAextraction；PCR；DGGE收稿日期：2013-05-10作者简介：周伟（1981-），男，

5、河南南阳人，讲师，主要从事遗传学方面的研究，（电话）13938025634（电子信箱）luohezhouwei@126.com。12微生物在土壤生态系统物质循环和能量转化过程中起重要作用，目前通过纯培养技术只能获得土壤中仅极少数的微生物种类，不能充分体现微生物群落的真实组成[1]。而基于DNA分析的分子生物学技术的引入，降低了对培养技术的依赖性，可以直接对土壤中微生物进行研究[2]。由于土壤中含有大量理化性质复杂的物质，而且微生物与土壤颗粒吸附紧密，不易从中提取DNA；同时土壤中微量的腐殖酸和重金属可能抑制分子生物学

6、操作过程中酶的活性、降低转化效率以及DNA的杂交特异性[3，4]等。因此，从土壤样品中高效地获得高质量的DNA是后期土壤微生物分子生物学研究的前提。土壤中微生物DNA提取的关键在于细胞的裂解，本研究通过对不同的裂解手段进行组合，设计了3种从土壤中直接提取微生物总基因组DNA的方法并对后期扩增效果进行比较分析，以期建立一种高效、简便的土壤微生物DNA提取方法，为分子水平上研究土壤微生物提供参考。1材料与方法1.1土壤样品2011年在河南省漯河市孟庙镇进行取样。供试土壤取自常年以冬小麦-春玉米茬口种植的农田，秸秆全部还田

7、，采用五点取样法取土样，取样深度为0～20cm，混匀后于-20℃保存。1.2试剂与仪器溶菌酶、蛋白酶K购自Sigma公司，所用maker（λ-HindⅢdigestedMarke，DNAMarkerDL2000）、凝胶回收试剂盒、PCRKit购自TaKaRa公司。TGRADIENT温度梯度PCR仪为德国Biometra公司生产，全自动数码凝胶成像与分析系统由天能科技（上海）有限公司生产。1.3方法12对提取土壤微生物DNA方法中不同的细胞裂解方式进行组合，设计3种土壤基因组DNA的提取方法。方法a：酶法与化学法相结合

8、[5]。5g土壤中加入25μL蛋白酶K、13.5mLTENC（50mmol/LTris-HCl、20mmol/LEDTA、100mmol/LNaCl、1%CTAB），混匀后置于37℃摇床225r/min震荡30min；然后加入1.5mLSDS混匀，65℃水浴震荡2h；6000r/min离心15min，取上清液。原离心管中加入9mLTENC、1m