磺胺嘧啶人工抗体和单链抗体的制备及特性研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写璜选．蛳字日期：工Q，飞年乞月气Fl学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分

2、内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手写)：量彭工一签字日期：二烈3年6月件日一⋯瓢蚴易签字日期：年6月fFI摘要食品和生态环境中的磺胺类药物残留，不仅危害人类键康，而且造成巨大经济损失，越来越受到人们的关注。建立磺胺嘧啶的快速、准确检测方法对食品安全，人类健康以及打破发达国家技术壁垒具

3、有重要意义。论文针对这一急需解决的重要问题，制备了磺胺嘧啶人工抗体(Artificialantibody)，建立了分子印迹柱．高效液相色谱法检测食品样品中磺胺嘧啶残留的方法。同时进行了磺胺嘧啶单链抗体(Single-chainvariablefragment，scFv)的研究，构建了单链抗体随机突变文库，以期从分子水平探讨更新、更快速准确的方法。主要研究结果如下：1．采用紫外吸收光谱法和1HNMR实验的方法研究了磺胺嘧啶模板分子和丙烯酰胺功能单体之间的相互作用。结果表明，磺胺嘧啶和丙烯酰胺分子问会形成氢键作用，并随着磺胺嘧啶浓度的增加，丙烯酰胺混合液的紫舞吸收会发生红移现象且吸

4、收峰的强度减弱。2．采用本体聚合法制备了磺胺嘧啶分子印迹聚合物，并采扫描电子显微镜法、傅立叶变换红外光谱分析法、Brunauer-Emmett．Teller实验方法、及吸附动力学实验等方法研究磺胺嘧啶分子印迹聚合物的特性。结果表明，MIP表面含有大量模板分子被洗脱后所留下的立体空穴，MIP的比表面积为182．2m29-1，MIP的吸附容量为7．8mg儋。3．采用单因素实验方法优化磺胺嘧啶分子印迹柱的固相萃取条件。结果表明，在2．5％乙腈．水溶液(v／v)为萃取液，流速为2mL／i，40％乙腈．水溶液(v／v)为洗脱液，洗脱体积为3mL最佳的条件下，磺胺嘧啶分子印迹柱的萃取效率为

5、99％。4．建立了分子印迹柱．高效液相色谱检测猪肉中磺胺嘧啶残量的方法。结果表明，在最佳固相萃取条件下，猪肉样品中磺胺嘧啶的浓度在50-4000pg／kg范围内，检测线性关系良好，线性回归方程为y=0．063x+0．0294，(R2=0．9998，11--3)，定量限为33．3ug／l(g，检出限为10ttg／kg，加标回收率≥75．6％，相对标准偏差≤6．1％。5．采用RT-PCR技术与SOE-PCR技术构建了磺胺嘧啶单链抗体的基因，并采用生物信息学方法分析磺胺嘧啶单链抗体的结构特性。结果表明，磺胺嘧啶单链抗体的重链和轻链的可变区均含有鼠源的3个CDR区和4个FR区；NCBI

6、DNABlast未见相同序列，但重链可变区基因与鼠源的IGHVI．14"01酶同源率达83．7％，轻链可变区基因与鼠源的IGKV6-20*01同源率达91．6％；单链抗体氨基酸序列提交至ExPASy分析可知，单链抗体的分子量为26582．4，分子式为Cll碡117删3lj0376s9，等电点为7．6，亲水性指数为一0．484，不稳定系数为49．38，该单链抗体属于不稳定蛋白。6．采用分子生物技术与基因克隆技术构建了磺胺嚏啶单链抗体的原核表达载体摘要pET22b-SD，并将其转化至E．coliBL21(DE3)中，采用单因素实验方法优化了重组菌株E．coliBL21(DE3)的表

7、达条件。结果表明，重组菌株E．coliBL21(DE3)以包涵体形式表达了磺胺嘧啶单链抗体：诱导表达的最佳条件为诱导温度为30℃、IPTG诱导浓度为300州、起始pH7、装料系数为30％和诱导时间为8h；蛋白印迹和酶联免疫吸附实验表明磺胺嘧啶单链抗体具有生物活性。7．采用基因克隆技术将磺胺嘧啶单链抗体基因克隆至分泌型pPIC9K表达载体中，并转化至毕赤酵母GSl15。结果表明，MM平板和MD平板筛选获得Muts型毕赤酵母GSl15重组子，含G418抗生素的YPD平板筛选获得多拷贝毕赤酵母GS