单链抗体融合蛋白的研究及应用

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1、单链抗体融合蛋白的研宄及应用丁忠英(湖州市妇幼保健院浙江湖州313000)【摘要】单链抗体具有分子量小，免疫原性低，组织穿透力强，特异性强等优点，通过重组DNA技术将单链抗体(singlechainantibodyfragment,scFv)基因与其他效应蛋白基因融合在一起，经表达后可以得到具有scFv特性和所融合的效应蛋白活性的scFv融合蛋白。这种融合蛋白已应用于许多领域的研究中，并己显示出较高的价值。木文就scFv融合蛋白的研究和应用做一综述。【关键词】单链抗体融合蛋白表达载体【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2014)16-0380

2、-02融合蛋白［1］是指采用重组DNA技术在基因水平上将两种蛋白质或蛋白质的结构域的编码区，依读码框架首尾连接在一起，表达产生的一种新蛋白质，它具有双方蛋白的活性，这种新型的人工蛋白具有极高的应用价值和很好的发展前景，己广泛应用于许多领域的研究中。单链抗体［1］(scFv)是现在研宄最多的小分子抗体，它由一段弹性连接链(linker)把抗体重链可变区(Vh)与轻链可变区(VI)相连而成，是只有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位，只有完整抗体分子的1/6,因而具有比完整抗体具有更大的优越性。因此，采用基因融合的方法在scFv的N端或C端，以一段多肽连接链和效应蛋白连

3、接，可得到具有抗体活性和其他牛.物活性或功能的scFv融合蛋白。这种利用基因工程技术得到的scFv融合蛋白，和scFv—样能在大肠杆菌、酵母、哺乳类细胞、昆虫细胞、植物中得到有效的表达，可以大规模生产抗体融合蛋白，具有很大的应用潜力。1scFv融合蛋白的研究进展1.1活性研究倪剑锋［2］等人将己经突变了稀有密码子的人IL-2(Alal25)基因，与GD2单链抗体基因通过over-lap-PCR法构建成ScFv-IL-2融合基因，并在基因的C端引入histag序列。ScFv-IL-2基因经测序正确后连接到表达载体pSE380上，然后导入大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白鉴定和提

4、纯后，通过EUSA试验结果证明该融合蛋闩保存了与相应抗原的结合活性和IL-2的生物活性。1.2抗降解研究抗人纤维蛋A单链抗体-低分子质量尿激酶(Un-UK)融合蛋白，兼有单链抗体对纤维蛋白的亲和性和尿激酶的溶栓活性，奋望开发成为新型导向溶栓药物，但基于通用连接肽(G4S)3的IIn-lingker-UK融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中表达时出现明显的降解。为解决此降解问题，刘志刚［3】等人利用分子生物学方法，对Iln-UK融合蛋白进行了分子改造，并分别研究了改造后的11种IIn-lingker-UK或UK-lingker-IIn突变体在CHO细胞中分泌性表达吋的稳

5、定性，最终筛选到了一种抗降解的突变体。1.3亲和力和稳定性研究王慧［4］等人以获得的抗A型肉毒毒素单链抗体为模板，进行融合改构，将人IgGl的Fc片段连接到ScFv的C端，在人肠杆菌中实现抗体融合蛋白ScFv-Fc的表达，体外活性检测结果表明，重组抗体融合蛋白ScFv-Fc可以特异结合A型肉毒类毒素抗原，其相对亲和力近似于母本单链抗体，其稳定性高于母本单链抗体。1.4表达载体的研究大肠杆菌表达系统因其遗传背景清楚、操作简便、经济快速等优点一直是重组蛋白的首选表达系统。但当重组蛋白的表达需要转录后加工或翻译后修饰时，大肠杆菌表达系统则往往难以胜任，特别是当需要表达的重组蛋白富

6、含二硫键吋。但选用胞内还原系统缺陷的菌株Origami(DE3)和共表达DsbC等方法可以促进了胞内二硫键的形成及异构化，实现了人源化单链抗体-低分子量尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达［5】。1scFv融合蛋白的应用2.1在诊断方面的应用刘俊霞［6］等人把碱性磷酸酶编码区插入pSTE2-8E5质粒DNA,用scFvC66的重链和轻链可变区DNA取代scFv-8E5的重链和轻链可变区DNA,构成表达载体pSTE2-C66-Ap在大肠杆菌中表达，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析产物活性。结果获得一个分子量为75kD的scFvC66-Ap融合蛋白，可结合来自KGla细胞

7、裂解物中的一个分子量约60kD的蛋白质带,苏结合功能可通过艽碱性磷酸酶活性直接测定。从而建立了一个用大肠杆菌制备单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的方法，它可能取代常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测。2.2在治疗方面的应用王凯［7】等人设计引物扩增人抗HER2单链抗体e23scFv基因和轻链恒定区编码序列(Ck),连接成ScFv/Ck片段，人工合成鱼精蛋白截短体(tP)序列,连接于ScFv/Ck末端、构建成ScFv/Ck/tP融合基因，将其克隆入原核表达载体pET32a后，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS中诱导表