trail基因转染神经干细胞的实验研究

《trail基因转染神经干细胞的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中图分类号：R-332；R392.11硕士学位论文TRAIL基因转染神经干细胞的实验研究院（系）、所临床医学院研究生姓名邢亮学科、专业外科学导师姓名蒋正方教授二Ο一三年四月目录1TRAIL基因转染神经干细胞的实验究………………………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………21.3前言……………………………………………………………51.4第一部分大鼠神经干细胞培养及慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞的实验研究………………………………………61.4.1引言………………………

2、……………………………………61.4.2材料与方法……………………………………………………61.4.3结果……………………………………………………………111.4.4讨论……………………………………………………………151.4.5参考文献………………………………………………………191.5第二部分TRAIL基因转染神经干细胞的实验究…………211.5.1引言……………………………………………………………211.5.2材料与方法……………………………………………………211.5.3结果……………………………………………………………271.5.4讨

3、论……………………………………………………………331.5.5参考文献………………………………………………………371.6结论……………………………………………………………391.7英汉缩略词对照表……………………………………………402致谢……………………………………………………………413神经干细胞治疗胶质瘤的实验研究进展（综述）…………42TRAIL基因转染神经干细胞的实验研究摘要目的：探讨Trail基因在体外转染神经干细胞应用基因治疗的可行性以及转染后神经干细胞能否保持增殖及分化特性。方法：实验共分两部分第一部分；(1)从12～14天孕

4、龄的大鼠胎鼠脑中分离出神经干细胞，并用无血清培养技术进行培养并传代；用免疫荧光对神经干细胞进行鉴定；(2)取传至第3～4代神经干细胞，分别按感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)为0、1、5、10、20加入携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的慢病毒载体(Lentivirusvector)稀释液。于荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率并摄片，行流式细胞仪检测以及神经球计数，得出各组NSCs的GFP阳性转染率以及神经干细胞球生成率。第二部分；（1）取传至第3～4代神经干细胞，用

5、最适感染复数的慢病毒介导的GFP-TRAIL融合基因转染神经干细胞，观察目的基因转染情况及LV／TRAIL-GFP对神经干细胞增殖影响，利用免疫荧光及western-blot鉴定TRAIL基因在神经干细胞表达情况；（2）对转染后神经干细胞进行Nestin鉴定，再将转染后以及未转染的神经干细胞接种于用1%多聚赖氨酸包被的盖玻片上，用含10%胎牛血清和BMEM/F12培养基诱导细胞分化，在倒置显微镜下观察细胞转染前后的分化情况,并通过免疫荧光鉴定分化的细胞。结果：第一部分；（1）经无血清培养的细胞呈悬浮生长，可形成大小不等的细胞球，对细胞行免疫荧光

6、染色呈现Nestin阳性。（2）转染报告基因GFP后，除MOI值为0的空白对照组外，荧光显微镜下观察其余各孔在2～3天后均有绿色荧光的GFP阳性表达。MOI值从0增至10，经流式细胞检测GFP阳性表达率逐1渐提高(P<0．05)，MOI值为10的组可获得>90％的转染率。经细胞计数发现MOI值从10增至20，形成的神经干细胞球数目却明显减少(P<0．05)。第二部分：（1）将慢病毒介导的GFP-TRAIL融合基因以MOI值10转染神经干细胞细胞，GFP绿色荧光24小时开始出现，72小时达最高分值，并且可以稳定表达，转染后的神经干细胞能增殖并传代

7、。Western-blot结果显示GFP-TRAIL融合蛋白能持续稳定表达，对转染后神经干细胞行免疫荧光染色结果显示Trail表达蛋白阳性。（2）转染后神经干细胞免疫荧光染色呈现Nestin阳性。对转染组及未转染组神经干细胞行诱导分化，转染后神经干细胞能分化神经元及神经胶质细胞，且与未转染组比较无统计学差异，对转染后神经干细胞分化形成的神经元及神经胶质细胞行免疫荧光染色呈现NSE阳性和GFAP阳性。结论：（1）慢病毒可携带TRAIL成功转染神经干细胞；(2)转染TRAIL后神经干细胞仍具有增殖和分化潜能；（3）神经干细胞可以稳定持续表达TRAI

8、L基因；（4）本实验为TRAIL转染后神经干细胞下一步体内、体外实验奠定基础。关键词：神经干细胞；Trial基因；转染Experimentalstud