羊布鲁氏菌病ielis抗体检测方法的建立及布鲁氏菌omp28基因的克隆与表达

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1、中国兽医药品监察所硕士学位论文羊布鲁氏菌病iELIS抗体检测方法的建立及布鲁氏菌omp28基因的克隆与表达姓名：王秀丽申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：蒋玉文2012-06摘要布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种重要的人兽共患传染性变态反应疾病，具有重要的公共卫生学意义。免疫接种和准确诊断是有效防控该病的两大重要手段。目前布鲁氏菌病的诊断方法大都是基于LPS抗原建立的，本研究试图建立一种基于LPS抗原，用丁-羊布鲁氏菌病抗体检测的iELISA方法。为了提高iELISA检测方法的特异性和灵敏性，

2、本研究对OIE手册介绍的热酚水法提取的布鲁氏菌粗制LPS从纯度、产率、活性等方面比较了冷甲醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、酶消化处理法对LPS的纯化效果，结果证明酶消化处理的纯化效果最好。用确定的LPS提纯工艺纯化的LPS作为抗原建立羊布鲁氏菌病iELISA抗体检测方法，并对相关反应条件进行了优化，以方阵滴定法对LPS抗原的浓度和待检血清的稀释倍数进行滴定，确定LPS的最佳包被浓度为0．171xg／ml，待检血清的最佳稀释倍数为1：100。通过控制单一变量法对封闭液、封闭时间、待检血清的反应时间、酶标记兔抗羊IgG抗

3、体的稀释倍数及反应时间、显色时间等其它影响反应的因素进行了优化。最终确定相关条件为抗原4。C包被8h，O．4％明胶封闭30min，待检血清37℃孵育10rain，HPR标记兔抗羊IgG抗体稀释40000倍，37℃孵育lOmin，TMB25℃显色10min。对385份已知背景的羊血清的检测结果统计，片jROC曲线进行分析，确定iELISA检测结果的判定标准为：S／P≥0．2为阳性，S伊<0．2为阴性。依据结果的判定标准，确定检测系统成立的条件为强阳性对照血清O．D．450IIl。>O．83，弱阳性对照血清0．D

4、．450～>0．35，阴性对照血清O．D．450。。<0．15。对所建立的iELISA的敏感性、特异性、重复性(批间重复性和批内重复性)、稳定性、符合率等进行评价。结果表明，该方法敏感性高，比SAT和RBPT灵敏度高60—150倍；特异性好，可有效的区分布鲁氏菌与大肠杆菌O：157和都柏林沙门氏菌的交叉感染；重复性良好，批内重复和批间重复性试验结果变异系数均小于10％；稳定性良好，保存期试验结果显示抗原包被板在4℃保存11个月检测结果稳定；对来自不同地区的385份临床血清进行检测并与RBPT和SAT结果比较，

5、结果阳性符合率98．41％，阴性符合率为96．65％。对1932份临床血清样品进行检测，并与RBPT进行比较，总符合率为91．7％，大量文献报道及本研究结果显示，基于LPS抗原检测布鲁氏菌IgG抗体的检测方法不能与小肠结肠炎耶尔森菌0：9IgG抗体区分。OMP28是布鲁氏菌的重要抗原蛋白，而小肠结肠炎耶尔森菌中不含有此蛋白。为开发一种可区分布鲁氏菌与小肠结肠炎耶尔森菌0：9感染的诊断方法，本研究克隆了不同布鲁氏菌的omp28基因并通过序列比对以及在GenBank中BLAST搜索，结果显示，omp28基因在4i

6、同种布鲁氏菌巾的相似性达到99％以上，本研究还构建了pET32a．omp28表达载体，并对重组表达载体表达产物进行了鉴定和蛋白的纯化，为进～步研究奠定了基础。关键词：布鲁氏茵，iELISA，omp28基因ABSTRACTBrucellosisisawidespreadandeconomicallycrucialzoonosiswithimportantpublichealthsignificance．Immunizationandaccuratediagnosisarethemostimportantmeas

7、urestocontrolandpreventthisdisease．Atpresent，mostofthediagnosticmethodsforbrucellosiswasbasedonLPSantigen，andaLPS—iELISAwasdevelopedinthisstudyforantibodydetectionagainstbrucellaingoatsandsheep．Inordertoimprovethespecificity,LPSwhichwasthedominantantigenofb

8、rucellamustbepurified．AheatphenosolublebacteriacrudeextractLPSwasobtainedaccordingtoOIEmanual．andColdMethanolPrecipitattion，AmmoniumSulfatePrecipitation，EnzymeDigestionwerecomparedforpurificationofcrud