luxsai-2型密度感应系统对禽致病性大肠杆菌的调控研究

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1、AnhuiAgricμLturalUniversityMasterDissertationTheRegulationofQuorumSensingofLuxS/AI-2inAvianPathogenicEscherichiacoliCandidate:BaiHaoSupervisor:Professor.QiKe-zongProfessor.YuSheng-qingAssociateProfessor.HanXian-ganAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricμLtureMa

2、jor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPathologyandBiologicalPreventionCollege:CollegeofAnimalScienceandTechnologyJune2013国家自然科学基金资助项目：《信号分子AI-2对禽致病性大肠杆菌的调控作用研究》项目编号31001078《禽源致病性大肠杆菌HPI毒力岛缺失株构建及其致病性研究》项目编号30871851摘要禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherich

3、iacoli,APEC)引起的严重影响养禽业的传染病之一。LuxS/AI-2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阴性和阳性菌中，可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2)，在细菌的许多生理功能中扮演着重要的角色。目前禽致病性大肠杆菌复杂的血清型和广谱的耐药性，给禽大肠杆菌病的防控提出了新的挑战,该菌LuxS/AI-2型密度感应系统的研究国内外尚未见报道。本研究旨在通过对APEC的LuxS/AI-2型密度感应系统探究，为防控APEC感染，从细菌群体角度提供了新的思路，为进一步

4、研究密度感应系统对APEC的调控功能和机理提供参考。1.禽致病性大肠杆菌AI-2的检测及其因素分析为探讨APEC中是否存在LuxS/AI-2型密度感应系统。利用哈维弧菌BB170(vibrioharveyiBB170)对APEC是否产生信号分子AI-2进行检测，结果表明APEC能产生自诱导信号分子AI-2。为探讨禽致病性大肠杆菌在不同生长时期和不同培养条件下，信号分子AI-2活性与luxS和pfs的转录水平之间的关系。本研究利用哈维弧菌BB170检测不同生长时期和不同培养条件下APEC的AI-2活性。同时利用Rea

5、l-timePCR检测APEC不同生长时期和不同培养条件下luxS和pfs的转录水平。结果表明，APEC在不同生长时期的AI-2活性与luxS的转录水平保持一致，而与pfs的转录水平则并不一致。对影响AI-2活性的因素研究表明，葡萄糖，麦芽糖和NaCl可增强AI-2活性和luxS转录水平，而蔗糖则下调AI-2活性和luxS转录水平。2.禽致病性大肠杆菌AI-2的合成及其对生物被膜的影响通过对APEC的luxS和pfs基因的克隆、表达和纯化，成功获得了可用于AI-2体外合成的可溶性重组蛋白LuxS和Pfs。利用纯化后

6、的LuxS、Pfs与S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)同时体外催化作用后，成功获得浓度为300μmol/L的信号分子AI-2。为研究AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响。本研究采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI-2对APEC生物被膜形成能力的影响。结果表明，AI-2在浓度为0.185mmol/L时，生物被膜形成能力显著增强。3.禽致病性大肠杆菌luxS缺失株的构建及致病性分析LuxS/AI-2型密度感应系统对细菌具有重要的调控作用。为进一步研究该系统对APEC的

7、调控作用，本研究构建了APEC的luxS的缺失株。AI-2活性检测结果显示，luxS的缺失株丧失产生信号分子AI-2的能力。樱桃谷鸭半数致死量检测结果显示，luxS基因的敲除使APEC毒力下降31.5倍。对鸡胚层纤维细胞DF-1细胞的黏附和入侵试I验结果显示，luxS基因的敲除使APEC的黏附和入侵的能力，分别下降了50.0%和40.7%。相对于野生株，luxS的缺失株在体内肝脏、脾脏和血液的载菌量分别下降了46.4倍、5.2倍和3.7倍。Real-timePCR结果显示，与野生株相比，luxS的缺失株的部分毒力基

8、因（iucD,fyuA,vat,ompA,iss,fimC和tsh）转录水平显著下降（P<0.05）。对细菌运动性研究结果表明，luxS的缺失导致了细菌的运动性降低。通过以上研究证实了APEC存在LuxS/AI-2型密度感应系统。APEC在不同生长时期的AI-2活性与luxS的转录水平保持一致，而与pfs的转录水平则并不一致。APEC的LuxS和Pfs可以在