禽致病性大肠杆菌非编码小rna（ryhb）缺失对其致病性的影响

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1、＇－单化代巧？ｉ：１０３６４分类ｙ；＇＇：１２７２０２３０：学４密级义考学位论文禽致病性大肠杆菌非编码小ＲＮＡ（ＲｙｈＢ）缺失对其致病性的影响Ｔｈｅｅｆｆｅｃｏｆ－Ｒｌｔｉｏｎ化ｅｔｓＳｍａｌｌｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡｈ巧ｄｅｅｏｎ（ｙＡｖｉａｎＰａｔｈｏｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＣｏｌｉａｔｈｏｅｎｉｃｉｔ．ｇｐｇｙ研究生；尹磊指导教师；祁甫宗教授申请学位口类级别；农挙硕ｄｂ专业名称：某础兽睽学研究方向：动物病理与牛物防治所在学院；动物科巧学院

2、支答辩委员会主席：巧２０１５年６月AnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationTheeffectsofSmallnon-codingRNA(RyhB)deletionontheAvianPathogenicEscherichiaColipathogenicity.Candudate:YinLeiSupervisor:Professor.QIKe-zongAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultureMajor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPat

3、hologyandBiologicalControlCollege:AcademyofAnimalScienceandTechnologyJune2015独创性声明本人声明所吊交的论义是我个人在守师指甘下进行的研究Ｔ作妓取得的研究成果。尽’‘我所化，除了义中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰气过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学化或化书而化用过的材料。与我一同Ｔ作的同志对本研究所做的任何巧献均已在论义中作了明偏的说明并表示了谢怠。研巧生签名：：时间巧＾月多Ｕ３ＩＩＩ关于论文使用授权的说明ＩＩ本

4、人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学化论文的规巧，目ｙ；学校有化化留送么？论义的复印件和磁拖，，允许论文被省阅和借阅可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制下段保任、，’汇编学化论文、巧挪学化论文的全部。同息安徽农业大学可Ｗ用不同方式在不同媒体上发表、或部分内容。Ｉ（保密的学位论文在解密后应遵守此协议）：研究生签名：时间＞ｒ年月ＳＵ／ｊ＾国家自然科学基金资助项目：《PhoP/Q对APEC关键毒力因子及β-防御素抗感染的调控研究》项目编号31372402中文摘要禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC)能引起禽类局部或全

5、身性的急性、慢性感染，因其毒力因子的复杂性，给养禽业的发展带来了严重的危害。近年来，人们提出了非编码小RNA(smallnon-codingregulatoryRNA,sRNA)，作为一种新发现的基因调节子，其在转录后可水平调节基因的表达。大肠杆菌作为RNA介导调控的模式病原菌，其自身对毒力机制，病原致病机制、代谢途径等已进行了深入研究。RyhB作为目前调控靶mRNA数目最多的小分子RNA之一，鉴于其作为大肠杆菌诸多调控网络的关键组成部分，在细菌的致病过程中发挥着重要作用，但是有关RyhB与禽致病性大肠杆菌致病性及毒力之间的关系却未见报道，因此开展RyhB与APEC致病性之间的关系研究具有

6、重要意义。本研究以sRNA（RyhB）为研究对象，通过构建APEC缺失株△RyhB和基因回复株△RyhB-comp，研究基因缺失对其生物学特性、毒力因子转录水平、黏附CEF细胞能力、半数致死量以及感染雏鸡病理变化的影响，揭示RyhB基因与APEC致病性之间的关系，为进一步研究APEC黏附和侵袭宿主细胞的致病性功能调控通路（Pathway）奠定基础。具体研究内容及结果如下：1、禽致病性大肠杆菌RyhB缺失株及回复株的构建本实验应用Red同源重组技术，通过PCR方法将RyhB-Up、RyhB-Down、PKD3-Cm进行基因扩增，运用overlap的方法，扩增出RyhB同源重组片段，用于打靶目

7、的序列。利用30℃热诱导蛋白，将同源重组片段电转入含PKD46的原始出发株，进行目的基因替换。利用氯霉素抗性标记筛选出阳性转化子，将PCP20质粒电转入阳性菌株消除氯霉素抗性，经PCR验证成功构建出APEC野生株RyhB的缺失株△RyhB。同步经RyhB基因扩增，所得RyhB目的片段和pSTV28载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，然后用T4连接酶连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，氯霉素抗性平板筛选