表达鸡传染性喉气管炎病毒gd、ge基因的重组马立克氏病毒构建

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1、表达鸡传染性喉气管炎病毒gD、gE基因的重组马立克氏病毒构建ConstructionofRecombinantMarek’SDiseaseVirusesExpressingtheGlycoproteinsDorEofInfectiousLaryngotracheitisVirus硕士研究生：刘恰导师：吴艳涛教授扬州大学2013年6月刘怡：表达鸡ILTVgD、gE基因的重组MDV构建表达鸡传染性喉气管炎病毒gD、gE基因的重组马立克氏病毒构建＼删硕士研究生：刘怡一一一一一一导师：吴艳涛教授中文摘要鸡传染性喉气管炎(

2、infectiouslaryngotracheitis，LIT)是由传染性喉气管炎病毒(infectiouslaryngotracheitisvirus，ILTV)所引起的急性呼吸道传染病。本病由于发病率高，减缓生长和引起产蛋下降等特点给养鸡业造成巨大经济损失。国内外的研究表明，目前使用的ILTV弱毒疫苗容易毒力返强，ILT的暴发大多与鸡胚源弱毒疫苗(CEO)的使用有关。因此，研制安全、有效的新型疫苗对于ILT的防控具有重要意义。本研究以ILTVAnhui一2011-2株DNA为模板，采用PCR扩增ILTVgD、

3、gE基因：利用马立克氏病毒(MDV)CVl988／Pdspens疫苗株基因组IRS．US连接区同源序列、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)启动子、绿色荧光蛋白(EGFP)基因，构建含gD、gE基因的转移载体质粒pLTR—EGFP-gD和pLTR—EGFP-gE。以磷酸钙沉淀法将转移载体质粒和MDVCVl988／Rispens基因组DNA共同转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，通过筛选、纯化得到带EGFP标志的重组病毒rMDV-EGFP—gD和rMDV-EGFP—gE。利用Cre重组酶去除rMDV-EGFP．g

4、D和rMDV-EGFP—gE基因组中EGFP基因，重新转染CEF细胞，经筛选、纯化得到不含EGFP基因的重组病毒rMDV-gD和rMDV-gE。经Westernblot分析，重组病毒rMDV-gD和rMDV-gE可分别表达ILTVgD蛋白和啦蛋白。本研究评价了1日龄SPF鸡接种重组病毒rMDV-gD和rMDV-gE后对ILTVAnhui．2011-2株及MDVRBlB强毒株的免疫保护效力。其中，重组病毒对ILT的免疫保护试验设立rMDV-gD免疫组、rMDV-gE免疫组、ILTCEO疫苗免疫组、非免疫攻毒对照组和

5、健康对照组，从发病率、死亡率、临床症状、病理组织学变化、对增重的影响和抗体水平等方面评价免疫效力。rMDV-gD免疫组在Iuw攻毒后的发病率(35％)和死亡率(5％)与非免疫攻毒对照组(发病率100％，死亡率36．8％)存在显著差异(p<0．05)；rMDV-gE免疫组的死亡率(19％)与非免疫攻毒对照组差异不显著(p>0．05)。攻毒前后(42日扬州大学硕士学位论文龄～52日龄)各免疫组增重差异不显著(p>O．05)，但CEO疫苗组增重最小(0．113kg)。问接ELISA检测各免疫组攻毒前后的血清抗体效价，结

6、果显示抗体效价的高低与保护效力之间没有相关性。经病理组织学检查，攻毒后rMDV-gD免疫组的气管和肺脏显微病变较ILTCEO疫苗免疫组和rMDV-gE免疫组轻微。在重组病毒对MD的免疫保护试验中，rMDV-gD免疫组和rMDV-gE免疫组对MDVRBlB强毒株攻击能够提供完全保护，与MDVCVl988／Rispens免疫组的效果相当。综上所述，本研究构建的重组病毒rMDV-gD是较理想的LIT新型疫苗候选毒株。关键词：传染性喉气管炎病毒；马立克氏病毒；同源重组；保护效力刘恰：表达鸡ILTVgD、gE基因的重组MD

7、V构建ConstructionofRecombinantMarek’SDiseaseVirusesExpressingtheGlycoproteinsDorEofInfectiousLaryngotracheitisVirusM．S．candidate：YiLiuAdvisor：Prof．YangtaoWuAbstract3Infectiouslaryngotracheitis(ILT)isanacuterespiratorydiseaseofchickenscausedbyinfectiouslaryngotr

8、acheitisvirus(ILTV)．Thisdiseaseleadstoseriouseconomiclossduetoincreasedmorbidity,retardedgrowthandreducedeggproductioninpoultryindustriesworldwide．ThecontrolofthediseaseiSbasedonlive—atte