表达基因ⅶ型新城疫病毒f或hn糖蛋白的重组马立克氏病毒构建及其免疫效力试验

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3、Ｗ乃．．玄—：＇．义、接心嫁鬟１．／Ｖ，．稽＇＇－１２０１５６月年—护每二；一？？、：冷节聲．气接＾．？＇．＇．．、．．．－娘冰．ｒ：的请絮宗立伟＝表达基因Ｗ型新城疫病毒Ｆ或ＨＮ糖蛋白的重组马立克氏病毒构建及其免疫效力试验１表达基因ＶＨ型新城疫病毒Ｆ或ＨＮ糖蛋白的重组马立克巧病毒构建及其免疫效力试验摘要新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ）是由新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）引起的一种高度接触性传染病，给世

4、界养禽业带来巨大的经济损失。当前，Ｗ型ＮＤＶ是在中国、日本、韩国等地呈优势流行的基因型。由于常规ＮＤＶ疫苗裹株与当前流行的ＮＤＶ毒株分属于不同基因型，导致免疫鸡群仍然时常发生非典型新城疫，因此有必要研制与流行株基立克氏病病毒’因型匹配的新型疫苗。本研巧＾＞马（ＭａｒｅｋｓｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓＭＤＶ）｜＾，ＣＶ巧８８／Ｒｉ巧ｅｎｓ疫苗毒株为载体，分别构建表达基因Ｖｎ型ＮＤＶ主要保护性抗原Ｆ和ＨＮ蛋白的重纪病毒，并对这两株重组病毒的免疫保护效果进行评价，为基因Ｗ型ＮＤＶ的防控提供新型疫苗

5、。为了使目的基因在重组ＭＤＶ中高效表赵本研究首先对目的基因的启动子进行了筛选。分别构建含有Ｐｅｃ和ＣＭＶ两个启动子的绿色英光蛋白（ＧＦＰ）重组质粒，转染ＤＦ１－ｂ细胞，通过观测巧光强度Ｗ及ｗｅｓｔｅｍｌｏｔ试验来判定两个启动子的活性，结果显示ＣＭＶ启动子的活性强于Ｐｅｃ启动子。ＲＴ－ＰＣ民－２０采用扩増基因Ｗ型ＮＤＶ（ＤＴ１４）的Ｆ和ＨＮ基因，并分别克隆入含有ＣＭＶＴＭ－－－－ＥＡＳＹＭＥＡＳＹＦ和ＥＡＳＹ－启动子的ｐ１表达载体中，阳性质粒命名为ｐＭｌｐＭｌＨＮ。扩增Ｆ、ＨＮ基因的表达盒

6、与本室构建的含有ＭＤＶＣＶＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ疫苗毒株ｓｏｒｆｌ／ｓｏｒ色Ｕ－Ｆ－－序列的ｐ／Ｄ质粒连接，得到的转移载体命名为阳／Ｄ、ｐＵ／ＤＨＮ。将转移载体ｐＵ／ＤＦＵ／Ｄ－ＨＮ分别与ＧＦＰ的重组ＭＤＶ－和表达（ｒＭＤＶＧＦＴ）的基因组共转染鸡胚成纤维细胞ｐ（ＣＫＯ。通过有限稀释的方法获得不含ＧＦＰ的能稳定表达相对应Ｆ、ＨＮ基因的重组病－－ｒｒＭ－ＨＮ－毒ＭＤＶＦ和ＤＶ。对获得的重组病毒ｒＭＤＶＦ和ｒＭＤＶＨＮ进斤聚合酶链式反应（ＰＣＲ）－、免疫印迹试验（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）、间接免

7、疫炎光试验（ＩＦＡ）鉴定，确定新城疫病毒的Ｆ、ＨＮ基因在马立克病毒中插入正确，且能够稳定表这。本研究还评价了ｒＭＤＶ－ＦＷ及ｒＭＤＶ－ＨＮ两株重组病毒对基因Ｗ型ＮＤＶ强毒株ＤＴ－２０１４和ＭＤＶ超强毒株ＲＫＢ的免疫保护效力。在重组病毒对ＮＤＶ的免疫保护试验中，５－Ｆ－１００只１日龄ＳＰＦ鸡随机分成组，依次为ｒＭＤＶ免疫组、ｒＭＤＶＨＮ免疫姐、弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组Ｗ及空白对照姐。前２组分别于１日龄颈部皮下接种５０００随斑形成单位－Ｆ或ｒＭＤＶ－ＨＮ重组（ＰＦＵ）的ｒＭＤＶ病毒；弱毒疫苗

8、组参照疫苗推荐剂量在７曰２扬州大学硕±学位论文５龄滴鼻点眼免疫ＬａＳｏ化弱毒疫苗，２１日龄时对除空白对照组外的其余４组用１０ＥＩＤ５０的ＤＴ－２０１４毒株攻毒，攻毒后连续观察７天，结果显示攻毒对照组的死ｔ率为１００％，同各免疫组之间的差异极显著。重组病毒和弱毒疫苗均能在面临ＮＤＶ攻击时对鸡群提供有效ｒＭＤＶ－Ｆ免疫组的保