铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药机制研究——非碳青霉烯酶型

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1、分类号UDC罾级公珏@江菇大擎硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目塑堡堡望照萱过毯壹重缢耋荭塑盟垫扭剑硒窒二韭毯壹霉缢酶型学科专业临床检验诊断学作者姓名曾童丝指导教师璺塑拯熬握答辩日期!Q!三生§旦9日分类号墼4§：§UDC§!§@硕士学位论文密级坌珏编号!Q121Z!Q!!QQ呈IVIASTER’SDISSERTATIoN铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药机制研究一非碳青霉烯酶型MECHANISMSOFCARBAPENEMSRESISTANCEINPSEUDOMONASAERUGI

2、NOSA—NOCARBAPENEMASES作者姓名：曾章锐指导教师：邵海枫教授小组成员：王卫萍副教授申请学位：临床医学硕士学科专业：临床检验诊断学论文答辩日期：2013年6月9日学位授I；单位：江苏大学学位授予口期：20I3年6，J17日答辩委员会主席：{{

3、{启祥教授评阅人：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使

4、用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曾毒乞乙弘I5’年6月7日5学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国

5、学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入<中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生院办理。本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名：曾番勿乙矽I’年占月7日指⋯躲瑚龇纠；年‘月9日江苏大学硕士学位论文目的摘要近年来，我院临床感染的铜绿假单胞菌中出现一种新的耐药表型，对碳青霉烯类抗生素耐药，却对头孢他啶敏感，对头孢吡肟敏感或中介。本研究旨在探讨介导此型耐药的机制，为临床治疗、预防和感控提供理论基础。方法1．收集确认表型：临床分离经法国生物梅里埃Vitek2

6、．compact全自动微生物分析仪鉴定的该型铜绿假单胞菌，用琼脂稀释法复查药物敏感性，确认为此耐药新表型。2．B一内酰胺酶分析：用反复冻融方法提取细菌耐药酶，通过改良三维试验检测该型菌是否产能分解碳青霉烯类和头孢他啶、头孢吡肟等药物的B一内酰胺酶。3．影响碳青霉烯类药物进入细菌的外膜蛋白通道及编码通道蛋白的基因分析：运用超声破碎法提取细菌外膜蛋白，十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺电泳(SDS．PAGE)分析耐药株是否发生外膜蛋白的改变。在此基础上，提取细菌DNA，扩增编码外膜蛋白的oprD基因，进行测序分析，寻

7、找引起外膜蛋白改变的基因基础。同时用实时定量RT—PCR检测oprD基因表达量是否存在变化。4．可能导致碳青霉烯类药物外排的因素分析：运用实时定量RT．PCR检测编码铜绿假单胞菌外排泵系统的mexA，mexC，mexE初mexY是否存在过度表达，其调控基因是否存在改变。5．体外模拟试验：用亚胺培南和美罗培南对敏感的铜绿假单胞菌进行体外诱导试验，观察是否能诱导出相同的耐药表型，并按上述研究方法检测I铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药机制研究一非碳青霉烯酶型结果诱导株是否存在相同的基因型变化，证实对临床分离株的

8、研究结果。1．共收集了29株该类型的铜绿假单胞菌，最低抑菌浓度(MIC)结果为对亚胺培南和美罗培南轻度或中度耐药，对头孢他啶和头孢吡肟为敏感或者中介。2．全部29株菌均不产生碳青霉烯酶，和能分解头孢他啶和头孢吡肟的B一内酰胺酶。3．与铜绿假单胞菌ATCC27853和临床分离的碳青霉烯类敏感株相比，29株菌中，7株外膜蛋白整体缺失或减少，18株在Mr43000,---66000之间可见Mr46000外膜蛋白明显缺失或者减少，4株外膜蛋白无明显改变。对oprD基因测序发现在外膜蛋白改变的菌株中存在多点突变、少

9、量缺失，新碱基插入，以及提前出现终止密码子。结果导致外膜蛋白的改变和丢失。4．外排系统调控基因发生点突变，导致外排系统基因的过度表达，产生过多的外排泵蛋白质。其中以mexXY-OprM和mexAB．OprM过度表达为主，其他外排系统有个别表达增加。5．采用亚胺培南和美罗培南诱导后，第5天出现对2种药物的耐药，且美罗培南诱导株对2种药物敏感性降低速度明显快于亚胺培南诱导株；三维试验诱导株未检出相应的耐药酶；SDS—PAGE电泳显