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《猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株orf5基因的克隆与变异分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
810中国兽医学报2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vol.27No.6猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的克隆与变异分析*周海范,夏平安,崔保安,柴春霞,张红英,杨霞(河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002)摘要:从河南郑州、新乡、周口不同地区猪场的急性病猪中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproduc-tiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV),分别命名为PRRSVHn-1/06、PRRSVHn-2/06和PRRSVHn-3/06,细胞中和试验证实其血清型与美洲型一致。利用RT-PCR方法克隆了它们的ORF5基因,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与7个不同来源的PRRSV毒株进行了同源性和亲缘关系比较分析,结果表明,3个分离株之间的ORF5基因及其推导的氨基酸均同源性均大于95.5%;与VR-2332标准北美洲株和疫苗株RespPRRSMLV间的同源性均低于与中国CH-1a毒株,而与流行的欧洲株间的同源性均低于54.5%。同时对推导氨基酸序列与6个北美洲型PRRSV株进行变异分析比较,证实其推导氨基酸序列发生了变异,特别是中和位点处第39位明显不同,表明河南省流行的PRRSV为北美洲型的变异株。关键词:PRRSV;河南分离株;ORF5基因;变异分析中图分类号:S852.65;Q78文献标识码:A文章编号:1005-4545(2007)06-0810-04VariationanalysisoftheORF5geneofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)ofHenanisolates*ZHOUHai-fan,XIAPing-an,CUIBao-an,CHAIChun-xia,ZHANGHong-ying,YANGXia(CollegeofAnimalHusbandryAndVeterinary,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)Abstract:Threeporcinereproductiverespiratorysyndrome(PRRSV)isolates(Hn-1/06Hn-2/06andHn-3/06)wereobtainedfromHenanprovince′spigfarms.TheircompleteORF5geneswereamplifiedbyRT-OCR.AlloftheORF5genesofthesePRRSVisolateswereprovedtobe603bp.IdentityandvariationanalysisofORF5geneandthededucedaminoacidoftheseisolateswiththeothersevenpublishedPRRSVisolatesfromdifferentsourceshowedthattheORF5geneandaminoacidoftheseHenanisolatessharemorethan95.5%identity.BetweentheseHenanisolatesandtheotherAmericaisolates,theidentityrangedfrom86.1%to98.0%and86.0%to98.5%re-spectively,buttheHenanisolatesandLVmerelysharelessthan54.5%identity.Furthercomparisionofthede-ducedaminoacidsequenceofHenanisolateswithotherAmericaisolatesindicatedthatsomesitesofGP5havetak-enintomutation.especially,the39thdeducedaminoacidwhichlocatesattheneutralizatingsiteofHenanisolatesdifferfromotherAmericaisolates,indicatingthatthePRRSVisolatesfromherdsexperiencingacutePRRSout-breakinHenanwouldbethemutantisolatesofAmericagenotype.Keywords:PRRSV;Henanisolates;ORF5gene;variationanalysis*Correspondingauthor[1]猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive亡率为特征。该病在河南省也非常严重,已给养猪andrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼业造成了巨大的经济损失,但目前还没有流行毒株吸综合征病毒引起的一种高度传染性疾病,临床上的分离报道。根据病毒血清交叉中和试验和病毒基以母猪发热、厌食、早产、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔因序列分析,PRRSV分为欧洲型和北美洲型,而北等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸困难和仔猪的高死美洲型又可分为多个基因亚型。病毒基因组为单股正链RNA,约15kb,含有8个开放阅读框(ORF),收稿日期:2006-11-13其中ORF1(包括ORF1a和ORF1b)编码病毒基金项目:国家“十五”食品安全重大攻关专项(2001BA804A30-11);河南省重大科技攻关项目(0223013800)RNA复制酶;ORF2～7分别编码病毒结构蛋白:作者简介:周海范(1972-),女,助理工程师,硕士研究生。GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。由ORF5编码*通讯作者的糖基化膜蛋白GP5,又称E蛋白,是病毒的结构 中国兽医学报2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vol.27No.6811蛋白之一,针对GP5的单克隆抗体对PRRSV有中1.5.2RT-PCRPRRS病毒RNA的提取方法按和作用,据报道,用大肠埃希氏菌表达GST-GP5融RNA提取Trizol试剂盒说明书进行,以分离株病合蛋白免疫猪后,不仅能检测出针对GP5的中和抗毒RNA为模板进行RT-PCR。RT-PCR反应条件体,而且还可以产生针对GP5的特异性细胞免为:42℃反转录1.5h,94℃灭活5min后进入[2]疫,另外,还可有效地阻止肺泡巨噬细胞的损PCR;PCR反应参数为:94℃预变性5min,PCR循伤[3]。而探讨不同地区PRRSV分离株基因之间的环为94℃45S,56℃30S,72℃1min,30个循环相互关系及变异规律,尤其对ORF5基因的研究成后,72℃延伸10min。反应结束后,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将3个目的基因片段分别亚为研制有效的PRRS疫苗的关键。克隆到pGEM-T载体中,进行酶切鉴定和测序。本试验拟通过对河南省不同地区的3个1.6序列分析将3个分离株的ORF5基因序列PRRSV分离株的ORF5基因进行克隆和测序,并和推导的核苷酸序列与7个不同来源PRRSV毒株与GenBank已发表的部分PRRSVORF5基因序列进行了同源性和变异分析比较。及其所编码的氨基酸序列进行变异分析,探求河南省发生强致病性毒株的可能原因,弄清流行于河南2结果省PRRSV毒株类型及变易情况,为科学预防该病提供参考依据。2.1病毒分离与鉴定用Marc-145细胞从急性病猪病料中分离到3株病毒,RT-PCR检测为1材料与方法PRRSV阳性;中和试验测得其中和指数均大于100(大于50判为阳性),证明分离到的病毒为PRRSV,1.1毒株和血清PRRSVATCCVR-2332标准并且血清型与美洲型一致。株和PRRSV阳性血清由河南农业大学兽医微生物2.2ORF5基因的克隆与序列测定用RT-PCR研究室保存。扩增出包括ORF5全基因DNA片段(图1),序列测1.2载体、菌株和细胞pGEM-T载体购自定其大小均为718bp,与预期结果一致;酶切鉴定Promega公司;E.coliJM109菌株和Marc-145细结果正确(图2)。胞由河南农业大学兽医微生物学研究室保存。2.3序列分析1.3试剂RNA提取Trizol试剂盒、RT试剂盒2.3.1同源性分析序列分析表明,扩增得到3个购自Promega公司;RNA酶抑制剂、rTaq酶、质粒分离株的基因片段大小均为718bp,其ORF5基因快速提取试剂盒、DNA纯化试剂盒等购自大连宝编码序列均为603bp,由其推导的氨基酸数均为生物工程有限公司;1640干粉购自GIBCO公司;小200个。将3个分离株的ORF5基因序列和推导的牛血清购自中美合资兰州生物工程有限公司。氨基酸序列与7个不同来源的PRRSV毒株的1.4病毒分离鉴定ORF5基因序列及氨基酸序列进行同源性(表1、2)1.4.1病料处理无菌采集河南省郑州、周口和新和ORF5基因亲缘关系(图3)比较分析。结果表明,乡3个地区送检的急性流产、死产胎儿和发病仔猪本试验中3个PRRSV分离株之间的ORF5基因及的肺、淋巴结、脾等病料,用灭菌PBS制成20%的悬其推导的氨基酸同源性均大于95.5%;它们与VR-液,3000r/min离心15min,取上清备用。2332标准北美洲株和疫苗株RespPRRSMLV之1.4.2病毒分离将病料上清过滤后接种于间的同源性低于与中国CH-1a毒株之间的同源性。Marc-145细胞,盲传3～5代,待出现病变后,用而与流行的欧洲株之间的同源性仅为53.1%～[4]PRRSVRT-PCR和细胞中和试验测定。收集细胞53.7%和54.0%～54.5%;由此可知3个分离株的培养病毒液,置-70℃保存备用。基因型均属于北美洲型,并且与CH-1a株接近。1.5ORF5基因的克隆2.3.2变异分析将推导的氨基酸序列与6个北美1.5.1引物设计根据PRRSV美洲型标准株洲型PRRSV毒株的GP5氨基酸序列进行比较(图ATCCVR-2332设计了扩增包括ORF5全基因片4)表明,3个分离株在GP5的多个位点发生变异。段的1对特异引物:P1:5′-AGCCT-氨基酸置换主要发生在第24～39位氨基酸高变区GTCTTTTTGCCATTCT-3′,P2:5′-CACTG-内,并且在第90～106位氨基酸跨膜功能区。另外,GCGTGTAGGTAATAG-3′。该扩增片段预期大小3个分离株的变异程度也存在着差异;来自未免疫为718bp。引物由TaKaRa生物工程公司合成。猪群的Hn-1和Hn-2分离株变异大,而来自免疫猪 812中国兽医学报2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vol.27No.6群的Hn-3变异相对较小。与6个北美州型PRRSVVR-2332和taiwan-f株均为R(精氨酸),而其他3毒株的GP5氨基酸序列比较,Hn-1和Hn-2分离株个弱毒株分别为Q(谷氨酰胺)和G(甘氨酸)。3个在第25、39、58、94、101、158位氨基酸发生了不同于分离株与CH-1a、taiwan-f株的第34、137位氨基酸6个北美洲型PRRSV毒株的相同变异,分别由F分虽为N(天冬酰胺)和S(丝氨酸)、其他5个美洲(苯丙氨酸)、L(亮氨酸)、N(天冬酰胺)、V(缬氨相应2个位点处则分别为D(天冬氨酸)和A(丙氨酸)、F(苯丙氨酸)和P(脯氨酸)变异为L(亮氨酸)、酸)。T(苏氨酸)、Q(谷氨酰胺)、A(丙氨酸)、Y(酪氨酸)和S(丝氨酸);而Hn-3分离株仅在第39、58、158位氨基酸处发生了变异,分别为F(苯丙氨酸)、H(组氨酸)和S(丝氨酸)。并且,Hn-1分离株在第24、35位氨基酸处分别为F(苯丙氨酸)和R(精氨酸),不同于其他各毒株;Hn-2分离株在第24、28和32位氨基酸上分别为Y(酪氨酸)、H(组氨酸)和G(甘氨酸),也与其他各毒株不同。3个分离株ORF5推导氨基酸中,第3、29、66、92、102、121、127、161、164、189、200位氨基酸与CH-1a株相应位点处的氨基酸完全一致,而与其他5个毒株不同。与毒力相关的图2酶切鉴定结果M1.-EcoT14Idigest;1.重组质第13和151位氨基酸,3个分离株与强毒CH-1a、粒双酶切产物;2.pGEM-T载体连接产物单酶切产物;3.pGEM-T空载体;4.分离株PRRSVRT-PCR扩增产物;M2.DL2000Marker图1PRRSVRT-PCR扩增结果M.DL2000Marker;图3不同来源PRRSV分离株ORF5基因亲缘关系图1.分离株PRRSVRT-PCR扩增产物;2.阳性对谱照PRRSVRT-PCR扩增产物表1Hn-1、Hn-2、Hn-3与7个来源不同PRRSV毒株ORF5基因核苷酸同源性比较%毒株BJ-4CH-1aVR-2332RespPRRSMLVtaiwan-fS1LVHn-1Hn-2Hn-3Hn-186.695.487.487.186.687.153.1—98.896.8Hn-286.195.086.986.686.686.653.298.8—96.5Hn-388.798.789.689.289.189.253.796.896.5—表2Hn-1、Hn-2、Hn-3与7个来源不同PRRSV毒株ORF5基因的推导氨基酸同源性比较%毒株BJ-4CH-1aVR-2332RespPRRSMLVtaiwan-fS1LVHn-1Hn-2Hn-3Hn-187.095.089.088.087.088.054.0—97.596.0Hn-286.094.588.087.087.087.054.597.5—95.5Hn-389.098.591.090.090.090.054.596.095.5— 中国兽医学报2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vol.27No.6813本研究分离到的河南PRRSV株为强毒野毒株。3讨论Hn-1和Hn-22个分离株来自没有免疫猪群,Hn-3则来自免疫猪群,由ORF5推导氨基酸变异情自从猪繁殖与呼吸综合征于20世纪80年代末况表明,在发生突变的58位氨基酸和抗原位点处的发生以来,该病已成为危害世界养猪业的主要疫病39位氨基酸比对证实,Hn-3分离株所发生的变异之一,造成了严重的经济损失,其中PRRSV的变异[5-6]既与发生相同变异的Hn-1和Hn-2分离株不同,也是造成本病难以控制的重要原因之一。据资料表[7][8]不同于其他各美洲型毒株,而在第2跨膜区的94、明,PRRSV可通过碱基突变、缺失和基因重组101位氨基酸处,Hn-1和Hn-2分离株发生了不同等方式发生变异,其中,碱基发生突变更为多见。本于其他各美洲型毒株的相同的变异,而Hn-3分离试验结果表明,3个河南分离株的ORF5基因变异株在这2个位点的氨基酸与CH-1a株一致。这些分均出现碱基突变情况,并且它们编码的氨基酸发生析表明,Hn-1和Hn-2分离株与Hn-3分离株的来相应变化,使其抗原特性发生了改变。有关研究提源上可能存在差异。来自免疫猪群的Hn-3分离株,出:PRRSV在猪群间传播的过程中,可在GP5的多[9-11]是否存在由疫苗株返强的情况,需要进一步的研究。个位点发生变异。本试验也进一步证实了该观PRRSV的免疫学研究表明,GP5不仅可诱导点。在PRRSV中,ORF5基因最容易发生变异,而产生与病毒的中和反应呈显著相关的中和抗体;而由其编码的GP5蛋白,在PRRSV的所有结构蛋白[12]且GP5在特异性细胞免疫、有效地阻止肺泡巨噬细中,具有较强的抗原性。本试验对分离到的3个[14]胞损伤和诱导细胞凋亡等方面也发挥着不同的PRRSV河南分离株ORF5基因序列测定、分析表作用。所以,ORF5基因变异引起其编码的GP5的明,3个毒株的基因型与北美洲型相近,与国内CH-变化,必然使相关特性发生改变。本试验通过对1a属于同一亚型。将它们推导的氨基酸序列与不同PRRSVORF5基因及其推导氨基酸的变异分析研来源北美洲型毒株的相应氨基酸序列进一步比较、究,初步证实:造成该病在河南省爆发和流行的原因分析表明:3个毒株ORF5基因的推导氨基酸中,之一是出现了北美洲型变异毒株,并且与国内流行Hn-1和Hn-2分离株的第39、58、158位完全一致;的CH-1a株既有一定程度相关性,又存在一定差异Hn-1和Hn-2分离株与Hn-3在158位氨基酸相的强毒野毒株。以上结果为进一步研究PRRSV的同,但在39、58位氨基酸不同,而这3个分离株与其致病原因和为河南省PRRS的预防工作奠定了初他6个发表的北美洲型都不同。在目前发表的6个[13]步理论基础。抗原位点中,其中已经确定的37～45位氨基酸[2]为中和表位,所以,位于该表位的第39位氨基酸参考文献:的变异引起抗原性变化,可能是免疫猪群不能抵抗[1]HallWV.Porcinereproductiveandrespiratorysyn-变异强毒的攻击,使免疫或具有一定抗体水平的猪drome(PRRS)virusasignificantdiseaseofpigs[J].群也无法控制该病不断发生的原因之一。相关研究AustVetJ,2005,83(5):260-261.有待进一步深入探索。[2]刘光清,蔡雪晖,仇华吉,等.猪繁殖与呼吸道综合征在3个分离株的ORF5基因的推导氨基酸中,的研究进展[J].中国预防兽医学报,2001,23(1):72-与毒力相关的第13位和第151位氨基酸均为R(精76.氨酸),与CH-1a、VR2332和taiwan-f1病毒株相[3]GoninP,PirzadehB,GagnonCA.Monoclonalanti-同,而与疫苗株RespPRRSMLV、BJ-4和S1各病bodiestotheGP5ofporcinereproductiveandrespira-毒株不同,后者分别为Q(谷氨酰胺)和G(甘氨酸);torysyndromevirusaremoreeffectiveinvirusneu-在区分疫苗株和野毒株的137位氨基酸和决定病毒tralizationthanmonoclonalantibodiestotheGP4[J].JVetDiagnInvest,2001(11):20-26.是不是准种的34位氨基酸处,3个分离株与CH-1a[4]周海范,夏平安,崔保安,等.猪繁殖与呼吸道综合征、和taiwan-f1病毒株均分别是S(丝氨酸)和N(天冬猪圆环病复合PCR诊断方法的建立及应用[J].河南酰胺),而其他5个美洲株则分别为A(丙氨酸)和农业科学,2007,384(1):106-109.D(天冬氨酸);在我们进行的另一个课题研究中,用[5]GoldbergTL,HahnEC,WeigelRM,etal.Genetic,分离到的Hn-1毒株对40日龄仔猪攻毒(另文发geographicalandtemporalvariationofporcinerepro-表)结果显示,该分离毒在第3天引起试验猪出现ductiveandrespiratorysyndromevirusinIllinois[J].PRRS临床症状,第18天急性死亡。上述分析表明,JGenVirol,2000,81:171-179.(下转817页) 中国兽医学报2007年11月第27卷第6期ChinJVetSciNov.2007Vol.27No.6817作在5h即可完成。试验表明,基于TaqManMGB[5]肖国生,曹三杰,文心田,等.荧光定量PCR技术及探针的实时荧光定量RT-PCR方法的特异性和敏其在动物传染病定量检测中的应用[J].动物医学进展,2005,26(2):13-17.感性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中[6]梅英,刘长安,龚建平,等.定量PCR的研究进展的兔病毒性出血症病毒。[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册,2004,25参考文献:(1):23-27.[7]ClarkeIN,LambdenPR.Themoleclarbiologyof[1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,caliciviruses[J].JGenVirol,1998,79:961-979.1997:525-530.[8]CapucciL,FusiP,LavazzaA,etal.Detectionand[2]PattersonIAP,HowieFE.Rabbithaemorrhagicdis-preliminarycharacterizationofanewrabbitcali-easeinScotland[J].VetRec,1995,137:523.civirusrelatedtorabbithemorrhagicdiseasevirusbut[3]BouslamaA,DeMiaGM,HammamiS,etal.Iden-nonpathogenic[J].JVirol,1996,70:8614-8623.tificationofthevirusofrabbithaemorrhagicin[9]罗勇军,刘昕.实时荧光定量PCR标准品的制备及Tunisia[J].VetRes,1996,138:108-110.应用[J].重庆医学,2005,34(3):414-415.[4]LiuSJ,XueHP,PuBQ,etal.Anewviraldiseaseofrabbit[J].AnimhusbVetMed,1984,16:423-434.(上接813页)[6]MengXJ.Heterogeneityofporcinereproductiveandtionofgeneticallydiversesequences(ORF5)ofrespiratorysyndromevirus:implicationsforcurrent-porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusvaccineefficacyandfuturevaccinedevelopment[J].inaswineherd[J].CanJVetRes,2001,65(4):254-VetMicrobiol,2000,74(4):309-329.260.[7]高志强,郭鑫,杨汉春,等.猪繁殖与呼吸综合征病[11][J]ChangCC,YoonKJ,ZimmermanJJ,etal.Evo-毒缺失变异株的基因组特征[J].畜牧兽医学报,lutionofporcinereproductiveandrespiratorysyn-2005,36(6),578-584.dromevirusduringsequentialpassagesinpigs[J].J[8]StadejekT,StankeviciusA,StorgaardT,etVirol,2002,76(10):4750-4763.al.Identificationofradicallydifferentvariantsof[12]王玉娥,杨汉春,郭鑫,等.猪繁殖与呼吸综合征病porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus毒GP5羧基端抗原表位的鉴定[J].畜牧兽医学报,inEasternEurope:towardsacommonancestorfor2004,35(4):439-442.EuropeanandAmericanviruses[J].JGenVirol,[13]方六荣,牛传双,肖少波,等.猪繁殖与呼吸综合征病2002,83:1861-1873.毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析[J].华中农[9]IndikS,ValicekL,KleinD,etal.Variationsinthema-业大学学报,2002,21(6):501-505.jorenvelopeglycoproteinGP5ofCzechstrainsof-[14]刘芳,汪铭书,程安春.猪繁殖与呼吸综合征病毒porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus诱导细胞凋亡的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,[J].JGenVirol,2000,81:2497-2502.2005(10):82-83.[10]DeeSA,TorremorellM,RossowK,etal.Identifica-
