猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株nsp2基因的克隆及序列分析

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·48·生物技术中国畜牧兽医2O1O年第37卷第9期猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析闫东明，卢士英，任洪林，周玉，宫彬彬，郑鑫，杜运升。，王光明，柳增善(1．人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林大学人兽共患病研究所，畜牧兽医学院，长春130062；2．吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118；3．长春康发动物药品研究所，长春130062)摘要：采用RT-PCR方法，从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序。应用DNAStar7．0、ClustalX1．83、MEGA4．0软件对测序结果进行分析，并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的N声2基因进行序列比对，结果显示，得到的Nsp2基因与VR一2332、CH—la等代表毒株的一致性为62．0～87．5，与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97．8～98．9；氨基酸序列比对结果显示与VR一2332、CH一1a等代表毒株的一致性为34．4～59．0，与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95．1～98．4。因此，引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；Nsp2基冈；序列分析中图分类号：$852．659．6文献标识码：A文章编号：1671-7236(201O)09—004804猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductiveand2009)，测序分析其核苷酸和氨基酸序列的一致性与respiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综变异性，进而讨论该地区猪繁殖与呼吸综合征的发合征病毒(porcinereproductiveandrespiratory病原因及流行趋势。syndromevirus，PRRSV)引起的一种传染病，以引l材料与方法起母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔1．1材料猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的1．1．1主要试剂和仪器SimplyP总RNA提取试疫病(张青娴等，2008)。PRRSV属于动脉炎病毒剂盒购自BioFlux公司；AxyPrepDNA凝胶回收试科动脉炎病毒属，为不分节段有囊膜的单股正链剂盒购自AXYGEN公司；反转录酶(AMV)、RNA病毒。根据病毒基因组核苷酸序列的不同可RnaseInhibitorrTaqpMD18-TVectordNTPs、将PRRSV分为2个基因型，即北美洲型(VR一DGL2000、BamHI及HindⅢ限制性内切酶等购2332)和欧洲型(LV)(Allende等，1999)。PRRSV自TaKaRa。的基因组全长约15kb，含有9个开放阅读框1．1．2病料猪肾脏、肺脏、肝脏、脾脏、血液等采(ORFs)，顺序依次为5ORFla—ORFlbORF2a—集自吉林省农安、怀德、梨树等地猪场。ORF2b—ORF(3-7)一3(冉智光等，2006)。Nsp2基1．1．3引物引物由哈尔滨兽医研究所提供。上因位于ORF1区，全长约2．9kb，主要编码非结构游引物序列为：5一CGGAAGAAACTGTCGGTG一蛋白，具有种特异性(张林吉等，2007；Shen等，3，下游引物序列为：5，_GGCTCATCCTGGT—2000)。不同毒株基因序列因缺失而长度不一，其编GCGT一3。码氨基酸长度也不同，并且存在较高的变异。1．2方法本研究通过采集吉林省部分地区猪场病料，1．2．1总RNA的提取取病猪的肾脏、肺脏、肝RTPCR扩增PRRSV的Nsp2基因(李金栋等，脏等组织各100mg，剪碎后分别置于不同的无菌研磨器中研磨，然后将组织匀浆移到不同的无RNA收稿日期：201003—22酶的1．5mL离心管中。按照SimplyP总RNA提作者简介：闫东明(1983一)，男，河北人，硕士，研究方向：兽医公取试剂盒的说明书提取总RNA。共卫生。1．2．2病毒cDNA的合成将提取的总RNA反通信作者：柳增善(1959一)，博导，教授。E—mail：zsliul959@转录成cDNA，总反应体系为2OL，具体的反应体163．corn系如下：无RNA酶水10L，10×RTBuffer2L，王光明(1969)，讲师。Email：gmwang@jlu．edu．cn基金项且：吉林省科技发展计划重点项目(20070209)。2．5mmol／L的dNTPs2L，1ug／／~L的OligdT 中国畜牧兽医2Ol0年第37卷第9期生物技术·49·1肚L，AMVReversetranscripatase1L，Ribonu—McleaseInhibitor1／,I，总RNA3“I。1．2．3PCR扩增目的片段以合成的eDNA为模板，用上游引物和下游引物扩增目的片段，反应总体系为25L：10×PCRBuffer2．5L，2．5mmol／I的dNTPs2L，上、下游引物各0．5L(浓度为10mol／L)，cDNA为0．5I，rTaq0．5L，最后力口ddHO补足至25“L。混匀后置于PCR仪中，PCR反应参数设置为：94℃预变性3min；94℃变性1min，59℃退火45S，72℃延伸lmin，共3O个循环；72。C最后延伸10min。反应结束后，取5肚LPCR产物在1琼脂糖中进行电泳，在凝胶成像仪图1PCR扩增产物Nsp2的琼脂糖凝胶电泳结果中观察结果。注：M为DG12000DNAMarker；1～3分别为扩增产物儿HI>1．2．4目的基因的克隆及测序使用DNA凝胶Nsp2、jlIs—Nsp2和jINA—Nsp2。回收试剂盒回收目的基因，然后与pMD18一T载体16。C连接过夜，将连接产物转化至E．coliDH5a感受态细胞中，涂布于氨苄抗性LB平板37℃培养18～20h，挑取单克隆菌落于LB液体培养基中，37℃水平摇床培养12h。采用碱裂解法提取质粒，并用2690bpHindIll和BamHI进行双酶切，鉴定目的片段是否成功与载体连接。将阳性克隆菌送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1．2．5序列分析在NCBI(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST)网站上，利用BLASTN和BLASTP在线工具进行序列相似性搜索，并利用DNAStar7．0、ClustalX1．83、MEGA4等软件分析测序结果，比较核苷酸和氨基酸序列的一致性和变图2重组质粒的酶切鉴定结果异性，并绘制系统进化树。注：M为DCI2000DNAMarker；1～3分别为jiHD-Nsp2、JIIS—Nsp2和JINANsp2重组质粒的酶切结果。2结果2．1RT—PCR扩增结果从怀德(JLHD)、农安林省(JLHD、JLIS和JLNA)来源的Nsp2部分基(JLNA)和梨树(JLLS)采集的病料中提取RNA，应因序列，用ClustalX1．83和DNAStar7．0软件与用上述引物采用RT—PCR(Deng等，2004；胡鸿惠已发表的1O株国内外毒株Nsp2序列进行多重序等，2009)方法进行扩增，分别获得了与预期大小一列比对(图3)。结果表明，这3个Nsp2部分基因序致的特异性目的条带，片段大小为187bp(图1)。列与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、pJX143、2．2重组质粒酶切鉴定结果阳性重组质粒用SHH、HN2007、HUB2的Nsp2一致性达97．8～HindⅢ、BamHI进行双酶切鉴定，得到约187bp98．9。而与国内外代表毒株的变异度相对较大，目的基因片段和2690bp的载体基因片段(图2)，与一致性为62．0～87．5。推导的氨基酸序列的预期结果一致。一致性分析结果表明，与国内高致病性PRRSV毒2．3DNA序列测定将测序结果与GenBank中株JXA1、pJX143、SHH、HN2007和HUB2Nsp2已登录的序列进行BIAST分析，结果表明，从吉林蛋白的一致性达95．19／6～98．4，而与国内外代表省3个地区病料中扩增得到的基因序列与国内毒株的一致性仅为34．4～59．0V0(图4)。PRRSV毒株Nsp2基因序列一致性为98，均为2．5系统进化树根据Nsp2基因编码的氨基酸PRRSVNsp2的部分基因序列。序列绘制系统进化树。吉林省来源的JLHD、JLLS2．4核苷酸和推导氨基酸序列分析将得到的吉和JLNA3个Nsp2基因编码蛋白与VR一2332、CH— 生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第9期CH一1a避业一雌一雌避。x。÷。+AA．A。CAAA，。C+．．，CCTT。．C．CCC，G．．CC．．．TTTl】一_—T●十TT●一一～。．A^，．．，．‘GlGG：：l】*G。GRGG_：一CCCTT．，GTG．G。一。一．：^n．●●■*●■‘C．．，，．A，+．。．，G，，C。TGY．十．。。1^n●●，‘．AA．．+TT．．TT十TT一一一TTTTT【}一T．TGG，。GT}GGTGGT一．_：I．l，_．A●■●●x●-x●G+GGG．．+．．。CC．。G*一一*“”^A．+．+．，，．●‘●C，，，r'-●●●‘●●‘，1●●●‘●●_●‘一一一●．+．．．，．-．，．．．．．T’‘TCT’GAAAC．C—G，T．‘C．T。TGT’GCTGCC一6CT’G‘T—CCC’G—CTA’TCCTT‘T’T’G．‘‘．t4+I_'。-．C．．．．．．．．r．+。．TT++．CTT．_：AA：：．CTJ．一．．．v+．，}G．．．．。。+CC+，T●CCC￡CgC。．AAY』_4GGG．．．、．．，，，G。。．CC．。TA．A。G+，．CC，C．．．^t★．t+^．々^T．．+．C．，‘，。‘，+CTT。．．C^．t^．t‘．．TI2AA^．GT，。T。GTGT：：．：+：：．：AC：：：：：：：：：：：：：：G：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：GGTCGGC^CCA。GTTTTC+CTGCACCGCGTAGAhCTGTGACA^CAACGCTGACGCACCAGGATG^GCCTT}T．．xPLt^A，^C．C_．．n‘．。+．‘-。．．CCr×CCCT．。．．，．T1，．．CC．．．，．．TA．．AA．．．十．。．．1图3扩增得到的3个NCspGG2G与G代．表：毒株Nsp2的核苷酸一致性比对结果．CC：：．TTT。．。T。，。+CTTT。。CCCCC．注：①tVR^一2332÷为美洲型-PRRS．V代表毒株；BJ4、CH一1a为国内PRRSV代表毒株；HB一1、HB-2为国内高致病性PRRSV河北地区的两株CTT。．+，^．．TT．G，．．，．．，．．．AiGG，．，病毒流行株；JXA1、^pnJX143为国内高致病性PRRSV江西地区的两株病毒流行株；SHH、HN2007、HUB2分别为国内高致病性÷．，，^．G．GGG：C．CC：：。A．．-．．。．PRRSV流行株上海株、河南株-，、湖+北。株．；+JIHD、JINA、JILS为吉林省地区的病毒流行株。②“．”代表与JIHD株核苷酸序列一致；“”C．．．。T．CGAC+。．ACGCG．CG，．．．：．．．．AA．+，表．示_核．．苷t酸‘．序t列^．缺．失‘^n。．。．CC．：．，．T^．。T‘．^．．，CCCCC：C，ATT．．．．．Ct．‘．‘‘．GiG★GG蠢GlGlGl8套G★誊★。●-}。lll●★1．★●}●★●●番#1●。●。TT}T．．．．G．．．_t．●●●●k●■Sl珏l^n61．，．．．．。．，t．‘蹴．0．0，7．G■●■●^●●■■■1GAGiGGA^G．+．．C．TT，p0~1。43．CH●●●^●61，。+．．。，。，CC，。．．G蓐．GGG．I艘：A：．五l强●■■●●^●童CC．．，．TAA．．。。．G辩∞2．61．^．t．．．。^nG．．，．t，‘．，．g0立塞CA．-’．．-_-．，。．dX盏1^n《1．．．^H．t^。-CB—l64C嚣一l童64嚣B·264髂∞∞翦V巍一2盯3盯3盯2w计44嚣一《44图4扩增得到的3个Nsp2与代表毒株Nsp2推导氨基酸的一致性比对结果注：“：”，“．”，“★”代表氨基酸序列的保守性依次增强。la、HB-1、HB一2、BJ一4等代表毒株不在同一个分支，HUB2(EF112446)儿NA而与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、pJX143、JLLSJLHDSHH、HN2007、HUB2等在同一个分支，亲缘关系SHH(EU106888)PJX143(EF488048)较近(图5)。HN2007(EU880437)JXA1(EF112445)3讨论HB-I(^Y150312)1987年在美国首先报道了猪繁殖与呼吸综合BJ一4(^F331831)YR-2332(A~150564)征的发生，1990年底在荷兰的Lelystad首次分离到HB-2(^Y262352)OH-1a(AY032626)病原，1996年郭宝清在国内首次报道分离到7PRRSV，证实中国大陆也存在此病。2006年夏季6420Aminoacidsubstitutions(×100)中国南方省份暴发了以高热和急性发病死亡为主要临床特征的猪高热综合征，即高致病性PRRS(王仕图5JLHD、JLLS和JLNA来源的Nsp2荣等，2009；童光志等，2007)，给养猪业造成了巨大基因编码蛋白系统进化树的损失。 中国畜牧兽医2O1O年第37卷第9期生物技术·51·国内外研究结果表明，Nsp2基因是PRRSV全株亲缘关系相对较远。基因组中变异最大的一个区域，Nsp2可以作为监测由序列分析发现，吉林省怀德、农安、梨树分离PRRSV遗传变异和研究特定诊断方法的一个理想株的Nsp2之间的一致性达98以上，病毒的来源靶基因。ORF1a中推测的非保守氨基酸的改变主可能相同。由于猪繁殖与呼吸综合征病因十分复要集中在Nspl8和Nsp2，其中尤以Nsp2的变异性杂，作用方式与致病趋势如何演化，有待今后进一较大(Masaaki等，2008)，但都不在特定的催化或切步深入研究。割位点处。用复制中的错配与免疫选择压力都难以参考文献解释不同的PRRSV分离株之间Nsp2存在显著差1王仕荣，向晖，等．广西“猪高热综合征”主要病原调查及PRRSV异的现象，故有学者认为Nsp2可能具有种特异性，Nsp2基因变异分析EJ]．中国兽医学报，2009，29(3)：249～253．与病毒的细胞或组织嗜性有关。Nsp2中第668位2冉智光，杨汉春．猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J]．猪业科学，氨基酸及952位氨基酸很可能和该病毒的毒力相2006，5：2l～22．关。Nsp2的N端较保守，含有推测的催化残基3张林吉，李明义，杜元钊，等．猪繁殖与呼吸综合征病毒分子结构与功能研究进展EJ]．上海畜牧兽医通讯，2007(2)：8～10．Cys和His，中间及C端有3个高变区。SP4张青娴，王克领，张立宪，等．高致病性蓝耳病的研究进展EJ]．中疫苗株(来源于VR-2332)同VR_2332及16244B相国畜牧兽医，2008，35(9)：105～107．比，其Nsp2靠近C末端的高变区有36个氨基酸的插5李金栋，张茂林，周玉，等．猪无名高热综合征『临床病例研究[J]．入，此外还有158个氨基酸的置换(高志强等，2002)。中国畜牧兽医，2009，35(7)：115～119．从吉林省怀德、农安、梨树采集的病料中均检测6胡鸿惠，曹振，赵铁柱，等．高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1株Nsp2基因分段克隆表达及其单克隆抗体的制备[J]．中出PRRSV阳性，经核苷酸和氨基酸序列比对分析国畜牧兽医，2009，36(10)：39～44．表明，分离得到的3个Nsp2部分基因序列与20067高志强，郭鑫，杨汉春．猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传变异年国内暴发的高致病性PRRSV毒株JXA1、研究进展EJ]．中国农业科技导报，2002，4(6)：64～67．pJXl43、SHH、HN2007、HUB2等的一致性达到8童光志，周艳君，都晓芳，等．高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒97．8～98．9，与VR2332、CH一1a、HB一1、HB一2、的分离鉴定及其分子流行病学分析[J]．中国预防兽医学报，2007，9(5)：323～326．BJ一4等国内外美洲型代表毒株一致性为62．0～9AllendeR，LewisTI，LuZ，eta1．NorthAmericanandEuro87．5，其编码氨基酸序列与VR一2332、CH1a、peanporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusesdifferHB一1、HB一2、BJ4等代表毒株的一致性为34．4～innonstructuralproteincodingregions[J]，JournalofGeneral59．0V0，与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、Virology，1999，80：307～315．10DengYu，JiangP，LiY，eta1．AnalysisofporcinereproductivepJX143、SHH、HN2007、HUB2等的一致性为andrespiratorysyndromevirusisolatesfromeasternChinawith95．1～98．4V0。与国内高致病性PRRsV毒株相RTPCRRFIPEJ]．VirologicaSinica，2004，19(4)：398～400．比，JIHD来源的Nsp2仅有2个碱基发生突变，JI一11MasaakiY，TatsuyukiO，AyakoM，eta1．Geneticpolymor—NA来源的Nsp2有3个碱基发生突变，JILS来源phismoftheNsp2geneinNorthAmericantype’porcinerepro—的Nsp2除了有2个碱基发生突变外，还存在3个ductiveandrespiratorysyndromevirus[J]．ArchVirol，2008，l53：1323～1334．碱基的缺失。由系统进化树可知，吉林省怀德、农12ShenS，KwangJ，IiuW，eta1．Determinationofthecomplete安、梨树分离株的Nsp2与高致病性PRRSV毒株nucleotidesequenceofavaccinestrainofporcinereproductiveJXA1、pJX143、SHH、HN2007、HUB2等毒株的andrespiratorysyndromevirusandidentificationoftheNsp2Nsp2亲缘关系较近，属于同一亚群，与VR一2332、genewithauniqueinsertion[J]．ArchivesofVirology，2000，CH一1a、HB一1、HB2、BJ一4等国内外美洲型代表毒145．87】～883．CloningandSequenceAnalysisofNsp2GenesofPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirusPrevalenceStrainsYANDong—ming，LUShi—ying，RENHong—lin，ZHOUYu，GONGBin—bin，ZHENGXin，DUYun—sheng。，WANGGuang—ming。LIUZeng—shan(1．Key1．aboratoryofZoonosisResearch，MinistryofEducation，InstituteofZoonosis．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun130062，China；2．CollegeofAnimalScienceandTechnology，JinlinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China：3．KangfaInstituteofAnimalDrug，Changchun130062．China) ·52·生物技术中国畜牧兽医2010年第37卷第9期猪伪狂犬病病毒受体nectin一2基因的克隆与分子特征杜伟国，耿玉静。，苏惠龙，胡京京，刘宇，张桂红(1．华南农业大学兽医学院，广州510642；2．福建农林大学动物科学学院，福州350002)摘要：为了进一步了解猪nectin一2基因的结构与功能，本研究采用生物信息学结合RPCR的方法从猪脑组织中克隆到了猪nectin一2基因，并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪nectin2基因的编码区含有1440个核苷酸，编码479个氨基酸，其中信号肽南32个氨基酸组成，胞外域由330个氨基酸组成，含有2个潜在的N一糖基化位点和6个半胱氨酸残基，跨膜区由23个氨基酸组成，胞浆区由94个氨基酸组成，猪nectin2基因与犬、马、家鼠、人、恒河猴、牛、黑猩猩的nectin2基核苷酸序列同源性分别为85．4、85．7、78．6、82．1、82．1、81．9和82．1；推导氨基酸序列的同源性分别为84．5、83．0、74．7、75．7、76．4、78．4和75．5。本试验为进一步深人研究猪伪狂犬病病毒与宿主之间的关系奠定了基础。关键词：伪狂犬病病毒；受体；猪nectin一2基因；分子特征中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：16717236(2010)09—0052-05猪伪狂犬病(porcinepseudorabies)是由伪狂互作用穿人宿主细胞(Lopez等，2000；Spear等，犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)引起的以仔猪2000)。nectin一2属于免疫球蛋白超家族(immuno—的急性脑炎、成年猪的呼吸道综合征、母猪的不孕和globulinsuperfamily)成员，胞外区由两个稳定区流产为特征的一种急性传染病(Nauwyncb等，(constantregion)和一个可变区(variableregion)构1997)。PRV属于疱疹病毒科(Herpesviride)，甲型成(Warner等，l998)，可以介导不同的甲型疱疹病疱疹病毒亚科(Alphaherpesv|rinae)，基因组为线状毒穿人细胞，nectin一2的揭示对病毒侵入机制的理双链DNA，大小约180kb，可编码7O种蛋白质，目解具有重要意义，因此，从基因的角度去研究nee—前已发现和命名的有11种糖蛋白，糖蛋白在病毒粒tin一2受体显得尤为重要。本试验从猪脑组织中克子与细胞表面受体结合通过膜融合侵入宿主细胞、隆到nectin一2基因并对其核苷酸和推导氨基酸序列穿膜释放、膜融合细胞扩散、神经入侵能力和毒力等进行了比较分析，这将为进一步揭示猪nectin一2蛋方面发挥重要的生物学作用。Warner等(1998)证白受体在PRV感染过程中的作用机制奠定基础。明nectin一2可以介导PRV穿人细胞。随后的研究1材料与方法结果发现PRV是通过糖蛋白gD与nectin一2的相1．1材料ExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、pMD18TVector、DNAMarkerDI2000均购自收稿日期：20100325大连宝生物工程有限公司；TrizolReagent为In—作者简介：杜伟圈(1985)，男，河南人，硕士生，主要从事分子vitrogen公司产品；反转录酶M—MIV为Promega病毒学研究。公司产品；E．coliDH5a由华南农业大学兽医学院通信作者：张桂红，教授。Email：guihongzh@scat1．edu．cn基金项目：国家生猪现代农业产业技术体系科学家岗位传染病实验室保存；DNA片段快速纯化／回收试剂(nycytx009)盒购自上海华舜生物工程有限公司；其它试剂均为Abstract：Thenonstructuralprotein2(Nsp2)genesofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)wereclonedusingRT—PCRfromporcinetissuesamplesinsomepigfarmsinJilinprovince．ThesequencesofNsp2werese—quencedandanalyzedusingDNAStar7．0。ClustalX1．83andMEGA4．HomologysearcheswereperformedbymeansofBIASTprogramsbyNCBI．IdentitiesofnuclearacidsequencesandaminoacidsequencesdeducedfromNsp2genesclonedwere62．0tO87．5and34．4tO59．0withPRRSVstandardstrainsVR一2332andCH一1aandSOon，were97．8tO98．9and95．1tO98．4withChinesehighlypathogenicPRRSVstrainsJXA1andHUB2andSOon．Therefore，PRRSVsleadingtOthein{ectiousdiseaseinsomepigfarmsinJilinprovincewerehighhomologywithhighlypathogenicPRRSVstrains．Keywords：porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus；nonstructuralprotein2gene；sequenceanalysis