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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10基因的克隆及序列分析10HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine№102009猪繁殖与呼吸综合征病毒Nspl0基因的克隆及序列分析周思旋,周碧君一,隆华.,朱时杰,文明,王开功'(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;2.贵州大学动物疫病研究所,贵州贵阳550025;3.贵州省畜牧兽医局,贵州贵阳550001)中图分类号:$852.659.6文献标识码:A文章编号:1004—7034(2009)10—0010—04关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;Nspl0基因;克隆;序列分析摘要:根据猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ一4序列,选择NsplO基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT—PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nspl0基因片段,克隆到pMD18一T载体并测序,应用DNASTAR,Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较.结果表明:贵州儿株Nspl0基因的cDNA长699bp,可编码233个氨基酸;贵州JL株Nspl0基因与早期分离毒株MLV株,BJ一4株,VR一2332株,CH一1a株,CH2002株和GS2004株相应序列的核苷酸同源性为91.7%～94.0%,氨基酸同源性为97.4%～98.7%;而与最近分离毒株HN2007株,SX2007株,GD2007株,YN2008株,GS2008株,XL2008株,TJ株和JXA1株的核苷酸同源性为98.3%～ 98.6%,氨基酸同源性为99.6%～100%.CloningandsequenceanalysisofNspl0geneofPRRSVstrainZHOUSi—xuan,ZHOUBi—iun.L0NGHua,etal(1.CollegeofAnimalScience,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;2.InstituteofAnimalDisease,GuizhouUniversity,Guiyang550025,China;3.HusbandryandVeterinaryMedicineBureau,Guiyang550001,China)Keywords:Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus;NsplOgene;clone;sequenceanalysisAbstract:ApairofspecificprimersofNspl0genewasdesignedaccordingtothegenesequenceofPRRSVBJ一4ofAmericanstandardstrain.ThespecificfragmentofGuizhouisolatewasbeensuccessfullyamplifiedbyRT—PCRandsequencedafterbeingcloneddirectlyintothepMDl8一T.ThehomologyofNspl0nucleotideanddeducedaminoacidwerecomparedwithdifferentstrainswhichshownonGenBankbythesoft—waresofDNASTAR,Clustal一1.81andMega.ItWasshowedthatthecDNAofNsplOwas699bpanditshared91.7%～94.0%ofnucleotidehomologyand97.4～98.7%ofaminoacidhomo-logywiththatofpristinestains(MLV,BJ一4,VR一2332,CH一1a,CH2002andGS2004),respectively.Anditshowed98.3%～98.6%ofnueleotideidentityand99.6%～100%ofaminoacididentitywiththatofrecentstrainsc(HN2007,SX2007,YN2~8,GD2007,TJandJXA1),respectively.猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcinereproductiveandrespiratorysyndromeVirus,PRRSV)引起猪的一种严重传染病,其临床特征为母猪流产,早产,产弱(死)胎等繁殖障碍,仔猪 呈现呼吸困难,高死亡率和育肥猪呼吸道症状.该病收稿日期:2009一Ol一04;修回日期:2009—09—16基金项目:贵州省"十一五"农业科技攻关项目(黔科合NZ字[2005]3002);贵州省农业厅兽医科技计划项目(200806);贵阳市农业局科技计划项目([2008]动防一O3号);贵州大学研究生创新基金项目(校研农200902)作者简介:周思旋(1984一),女,硕士研究生.通讯作者:周碧君(1958一),女,教授,本科.于1987年首先发现于美国¨,随后在全世界养猪国家蔓延流行.1996年,郭宝清等从疑似猪繁殖与呼吸综合征流产胎儿中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒,首次证实猪繁殖与呼吸综合征在我国大陆的存在.自2005年以来,我国很多省市发生了由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给我国养猪业造成了巨大的经济损失一.有研究表明,猪繁殖与呼吸综合征病毒的变异主要发生在Nsp2,ORF3和ORF5基因,但有关猪繁殖与呼吸综合征病毒Nspl0基因变异的研究资料不多.试验在分离,鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州流行毒株的基础上,进一步对贵州株的Nspl0基因进行了克隆与序列分析,以期阐明猪繁殖与呼吸综合《黑龙江畜牧兽医》科技版2009年10月(上)11征病毒的变异趋势,为猪繁殖与呼吸综合征的免疫防控奠定理论基础.1材料与方法1.1毒株猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株(儿株),贵州大学动物科学学院预防兽医硕士点分离,鉴定并保 存.1.2菌株,质粒及试剂大肠杆菌DH5c~,贵州大学动物科学学院预防兽医硕士点保存;pMD18一T载体,DL一2OOOMarker,RNAisoReagentKit,GelExtractionKit和T4DNA连接酶等,购自宝生物工程(大连)有限公司;酚/氯仿/异戊醇,dNTPs,TaqDNA聚合酶,RNasin,AMV酶,5×RTBuffer,5×PCRBuffer等,购自上海生工生物工程技术服务有限公司.其他化学试剂均为分析纯.1.3引物设计根据GenBank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ一4株全基因序列(No.AF331831),参照参考文献[10]合成1对Nsp10基因特异性引物,其序列为Nspl0～15一TAA垒!AGGT'FCATCATCGGC—CCACC一3(下划线部分为BamHI酶切位点),Nspl0—25一ATT垒垒CAGCTGCCTGTGTGGGT-CAT一3(下划线部分为HindllI酶切位点),预期扩增片段为717bp.引物由宝生物工程(大连)有限公司合成.1.4RNA的提取按照传统Trizol法提取病毒RNA,用DEPC—H,O溶解RNA沉淀,一80qC冻存,备用.1.5RT—PCR扩增RT反应体系(20IXL):RNA模板1OL,5×RTBuffer4IXL,dNTP2IxL,Nspl0—21IXL,RNasin1txL,AMV酶1IXL和DEPC—H2O1IXL.RT反应参数:37℃5rain,42℃1h.PCR反应体系(50IXL):10×PCRBuffer3IXL,MgC1,(25mmolfL)2.5IxL, dNTP(10mmolfL)1IxL,Nspl0—1,Nspl0—2弓f物各2.5I,Taq1IxL,cDNA适量,用DEPC—H2O补足至5OIxL.PCR反应参数:94℃3min;94℃1min,56℃30S,72qc50S,共30个循环;72oC5min.PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定.1.6目的基因的克隆与鉴定按照GelExtractionKit说明书从琼脂糖凝胶中回收目的基因片段,连接pMD18一T载体(连接体系为pMD18一T载体itxL,目的片段4IxL和SolutionI5L);4o【=连接过夜,转化感受态大肠杆菌DH5a,涂布于含氨苄西林(50mg/L)的LB琼脂平板上,37qC恒温培养12～16h;挑取单个阳性菌落接种于含氨苄西林(50mg/L)的LB液体培养基中,37qC,180r/min振荡培养;小量提取质粒,经PCR和Hindm/BamHI双酶切鉴定后,将阳性克隆菌液送宝生物工程(大连)有限公司测序.1.7Nspl0基因的序列分析应用DNASTAR,Clustalj.81及Mega分析软件将猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株Nspl0基因与GenBank公布的部分毒株相应序列进行同源性比较,并绘制系统发生树.猪繁殖与呼吸综合征病毒参考株的GenBank登录号见表1.表1不同来源的猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株及其GenBank登录号TablelPRRSVstrainsofdifferentsourcesandtheirGenBankaecessioils毒株GenBank序列号毒株GenBank序列号毒株GenBank序列号JLEU8863228J～4AF331831CH—IaAY032626VR2332EF536o03HN2册7EU88o437YN2008EU880435S)(2007E碾8o434Gs2004EU880443TJEU86o24JXA1EFl12445MLVAF159149@2007EU880433 GS20o8EU88o431X0o8EU88o436Cmoo2EU88O4382结果与分析2.1RT—PCR扩增结果采用Nspl0—1/NsplO一2引物对贵州株及MLV株RNA样本进行RT—PCR扩增,结果均可见1条717bp的目的片段(见图1),与预期片段相符.1.MLV株;2.贵州株;M.DL一2000Marker.图1猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株Nspl0基因的RT—PCR扩增结果Fig1RT—PCRresultsofNspl0geneofPRRSVGuizhoustrain2.2目的基因的克隆与鉴定结果将目的基因回收,连接与转化后,提取重组质粒进行PCR和Hind111/BamHI双酶切鉴定,结果均得到相应的目的条带(见图2),表明目的DNA片段连接转化正确.2.3序列测定结果与分析经测序,猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株Nspl0基因的cDNA长699bp,可编码233个氨基酸;经生物信息学软件分析比较发现,猪繁殖与呼吸综合征病12Heilon~iangAnimalScienceandVeterinaryMedicineNo1020091.重组质粒的PCR扩增产物;M.DL一2000Marker;2.MLV株对照;3.扩增产物的Hindm/BamHI双酶切产物.图2重组质粒PCR及酶切鉴定Fig2IdentificationofrecombinantplasmidbyPCRandrestrictionenzymes毒贵州株Nspl0基因与猪繁殖与呼吸综合征病毒早 期分离株MLV株,BJ一4株,VR一2332株,CH一1a株,CH2002株和GS2004株的核苷酸同源性为91.7%～94.0%,氨基酸同源性为97.4%一98.7%;与猪繁殖与呼吸综合征病毒最近流行毒株HN2007株,GD2007株,SX2007株,YN2008株,GS2008株,XL2008株,rrJ株和JXA1株的核苷酸同源性为98.3%～98.6%,氨基酸同源性为99.6%一100%.见表2.2.4系统发生树为进一步分析贵州省流行毒株与其他毒株在遗传进化上的关系,以NsplO基因的cDNA序列及其推导氨基酸序列为基元,利用DNASTAR,Clustal一1.81表2贵州株与猪繁殖与呼吸综合征病毒参考株的同源性比较Table2HomologycomparisonamongPRRSVstrainsinNspl0genessequencesandthededucedaminoacidsequences注:右上部分为核苷酸序列同源性比较结果,左下部分为氨基酸序列同源性比较结果.及Mega软件建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒系统发生树,见图3和图4.结果表明:猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株与最近流行株HN2007株,GD2007株,SX2007株,TJ株,JXAt株,YN2008株,GS2008株和XL2008株的亲缘关系较近,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒早期分离株MLV株,BJ一4株,VR一2332株,CH一1a株,CH2002株和GS2004株的亲缘关系相对较远.3讨论猪繁殖与呼吸综合征病毒为动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员,其基因组为单股正链RNA,大小约为15kb,含有8个开放阅读框(ORF),其中ORF2～7 编码病毒的结构蛋白,而ORF1(包括ORFla和ORFlb)为病毒的非结构蛋白编码区,编码病毒RNA的复制酶和聚合酶垃J.近年来,由于猪繁殖与呼吸综合征病毒基因发生变异,导致猪繁殖与呼吸综合0.020O.0150.0100.0050.000图3基于Nspl0核苷酸序列的系统发生树Fig3PhyiogenetictreesbasedonNspl0nucleotidesequencesofPRRSV征病毒的致病力增强,感染范围增大,给我国养猪业造成了巨大的经济损失.研究表明,猪繁殖与呼吸综合征病毒变异的主要表现是位于ORF1a的Nsp2基因部分核苷酸缺失及位于ORF3和ORF5的基因突《黑龙江畜牧兽医》科技版2009年l0月(上)13图4基于Nspl0氨基酸序列的系统发生树Fig4PhylogenetictreesbasedonNsp10deducedaminoacidsequencesofPRRSV变.研究在RT—PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株(JL株)Nspl0基因并克隆测序后,经DNASTAR及MEGA软件分析发现,猪繁殖与呼吸综合征病毒Nspl0基因也有变异现象(主要是核苷酸的替换)并具有一定的规律性,即A—G或T—C的转变,很少有T—G及A—T的变化,但未发现核苷酸的缺失或插入现象.猪繁殖与呼吸综合征病毒Nspl0基因的这种变异存在一定的时问差异,如贵州株与最近流行毒株(HN2007株,GD2007株,SX2007株,TJ株,JXAI株,YN2008株,GS2008株和XL2008株)的核苷酸同源性达到98.3%以上,而与早期分离株(MLV株,BJ一4株,VR一2332株和GS2004株)的 核苷酸同源性呈降低趋势,只有91.7%～94.0%.尽管核苷酸同源性存在一定的差异,但氨基酸同源性都在97.4%以上,说明Nspl0蛋白在猪繁殖与呼吸综合征病毒中的保守性较高,蛋白功能并没有发生很大改变.目前,人们投入了大量的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗进行免疫注射,但仍不能完全控制猪繁殖与呼吸综合征的发生和流行.由于猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖性增强现象,若在免疫注射后不能达到有效的抗体水平,反而促进猪机体内潜伏或隐性感染的猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速增殖,导致猪繁殖与呼吸综合征病情的加重.序列分析结果表明,Nspl0蛋白具有较好的保守性和良好的免疫原性,能刺激猪机体产生抗体.若以Nspl0蛋白作为包被抗原而建立ELISA方法,可检测出隐性感染猪群,从而减少免疫注射的盲目性.研究克隆出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株Nspl0基因并进行了分析,为下一步Nspl0基因的表达和ELISA检测方法的建立奠定了基础.参考文献:[1]KEFFABERKK.Reproductivefailureofunknownetiology[J].AmAssocSwinePractNews,1989,1(1):1～9.[2]郭宝清,陈章水,刘文兴,等.从疑似PRRS流产胎儿中分离PRRSV的研究[J].中国畜禽传染病,1996,17(2):1—4.[3]刘金霞,周艳君,安同庆,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因的表达及其单克隆抗体的制备[J].中国兽医,2007,27(5):609—612.[4]史开志,周碧君,杨鹤峰,等.猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查与RT—PCR鉴定[J].山地农业生物,2007,5(26):403 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