猪fcγri的可变剪接及其对prrsvade效应的调控作用

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1、猪FcγRI的可变剪接及其对PRRSVADE效应的调控作用TheeffectsofalternativelysplicedporcineFcγRIonAntibody-dependentEnhancementofPRRSVinfection一级学科：生物学学科专业：生物学作者姓名：李艺指导教师：黄金海教授天津大学生命科学学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其

2、他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据中文摘要猪繁殖与呼

3、吸综合征俗称“蓝耳病”，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的高度接触性传染病，严重威胁全球养猪业发展。PRRSV具有抗体依赖性增强（Antibody-dependentenhancement,ADE）效应，是造成持续性感染、免疫失败及疫苗效果不佳的重要原因。FcγR是PRRSV靶细胞——猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM）上高表达的膜受体，通过结合病毒-抗体免疫复合物（Immuneco

4、mplex,IC），介导病毒ADE效应，并参与免疫细胞内信号的调节及机体炎症反应。FcγR存在多种亚型，研究发现人和小鼠FcγR基因存在选择性剪接，关于猪FcγRI的可变剪接及其参与PRRSVADE的机理尚不清楚。为了进一步明确FcγRI在PRRSVADE效应中的作用，本文通过体外细胞感染模型，研究了FcγRI的可变剪接特征，膜型及可溶型FcγRI在介导细胞内吞、抗原递呈、致炎性作用中的功能，以及ADE特异性细胞应答。这为理解FcγRI在PRRSVADE效应中调控作用的分子机制和免疫应答特征，认识PRRSV独特的致病及免疫机制提供了

5、证据。主要结果如下：（1）猪FcγRI存在多种转录剪接体：从3头猪PAM细胞中克隆到多种FcγRI转录剪接体，与猪基因组的GenomeScan分析表明，猪FcγRI基因通过3'端可变剪接产生至少6种剪接体，包括2种膜型和4种缺失跨膜区、潜在分泌型的可溶型FcγRI。对3头猪个体的原代PAM细胞及传代细胞3D4/21中FcγRI的125个克隆分析表明，不同FcγRI转录剪接体普遍表达于多种体内原代细胞及3D4/21体外培养细胞系。单基因测序分析表明，PAM细胞上的FcγRI主要以膜型为主，约占转录本的74%~91%，为优势转录本。（2

6、）猪膜型FcγRI参与PRRSV-IC的内化，介导PRRSVADE作用：将构建的膜型、可溶型FcγRI真核表达载体，分别转染PRRSV敏感细胞3D4/21及非敏感细胞293T，通过FcγRI抗体阻断实验、病毒载量测定、confocal观察网格蛋白变化等，比较了PRRSVADE效应下的细胞应答，研究了膜型、可溶型FcγRI在PRRSVADE中的作用。利用相对荧光定量PCR、confocal方法发现，过表达膜型FcγRI（pcDNA3.1-T1）可增强PRRSV-IC对3D4/21和293T细胞的感染，而可溶型FcγRI（pcDNA3.

7、1-T3）不具备介导PRRSVADE的能力。Confocal结果表明，膜型FcγRI通过增强网格蛋白的表达及募集，促进成熟溶酶体的形成及转运，介导病毒内化。Real-timePCR结果表明，高丰度的可溶型FcγRI转录表I万方数据达，可上调PRRSVADE感染中IFN-β、TNF-α、IL-1β炎性因子及抗原递呈分子MHC-I、II表达，促进细胞的炎性反应，负向调控PRRSVADE效应。而膜型FcγRI的高表达，抑制了TLR7，下调了干扰素的产生。（3）PRRSV上调细胞中可溶型FcγRI比率，ADE作用抑制机体抗病毒反应，影响靶细

8、胞应答，增强FcγR介导的内吞，抑制炎性因子转录，诱导特异性TCRVβ细胞亚群增殖。研究了有、无PRRSV特异性抗体下PRRSV感染3D4/21细胞，几种FcγR的转录变化，Real-timePCR显示PRRSV仅上调了FcγRI的转