猪FcγRI的可变剪接及其对PRRSV ADE效应的调控作用

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1、⑩《次＃ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中国第－所现代大学ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博士学位论文一生物学级学科：生物学：学科专业李艺：作者姓名指导教师：黄金海教授天津大学研究生院２０１７年５月猪FcγRI的可变剪接及其对PRRSVADE效应的调控作用TheeffectsofalternativelysplicedporcineFcγRIonAntibody-dependentEnhancementofPRRSVinfection一级学科：生物学学科专业：生物学作者姓名：李艺指导教师：

2、黄金海教授天津大学生命科学学院二零一七年五月中文摘要猪繁殖与呼吸综合征俗称“蓝耳病”，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的高度接触性传染病，严重威胁全球养猪业发展。PRRSV具有抗体依赖性增强（Antibody-dependentenhancement,ADE）效应，是造成持续性感染、免疫失败及疫苗效果不佳的重要原因。FcγR是PRRSV靶细胞——猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM）上高表达的

3、膜受体，通过结合病毒-抗体免疫复合物（Immunecomplex,IC），介导病毒ADE效应，并参与免疫细胞内信号的调节及机体炎症反应。FcγR存在多种亚型，研究发现人和小鼠FcγR基因存在选择性剪接，关于猪FcγRI的可变剪接及其参与PRRSVADE的机理尚不清楚。为了进一步明确FcγRI在PRRSVADE效应中的作用，本文通过体外细胞感染模型，研究了FcγRI的可变剪接特征，膜型及可溶型FcγRI在介导细胞内吞、抗原递呈、致炎性作用中的功能，以及ADE特异性细胞应答。这为理解FcγRI在PRRSVADE效应中调控作用的分子机制和免疫应答

4、特征，认识PRRSV独特的致病及免疫机制提供了证据。主要结果如下：（1）猪FcγRI存在多种转录剪接体：从3头猪PAM细胞中克隆到多种FcγRI转录剪接体，与猪基因组的GenomeScan分析表明，猪FcγRI基因通过3'端可变剪接产生至少6种剪接体，包括2种膜型和4种缺失跨膜区、潜在分泌型的可溶型FcγRI。对3头猪个体的原代PAM细胞及传代细胞3D4/21中FcγRI的125个克隆分析表明，不同FcγRI转录剪接体普遍表达于多种体内原代细胞及3D4/21体外培养细胞系。单基因测序分析表明，PAM细胞上的FcγRI主要以膜型为主，约占转录

5、本的74%~91%，为优势转录本。（2）猪膜型FcγRI参与PRRSV-IC的内化，介导PRRSVADE作用：将构建的膜型、可溶型FcγRI真核表达载体，分别转染PRRSV敏感细胞3D4/21及非敏感细胞293T，通过FcγRI抗体阻断实验、病毒载量测定、confocal观察网格蛋白变化等，比较了PRRSVADE效应下的细胞应答，研究了膜型、可溶型FcγRI在PRRSVADE中的作用。利用相对荧光定量PCR、confocal方法发现，过表达膜型FcγRI（pcDNA3.1-T1）可增强PRRSV-IC对3D4/21和293T细胞的感染，而可

6、溶型FcγRI（pcDNA3.1-T3）不具备介导PRRSVADE的能力。Confocal结果表明，膜型FcγRI通过增强网格蛋白的表达及募集，促进成熟溶酶体的形成及转运，介导病毒内化。Real-timePCR结果表明，高丰度的可溶型FcγRI转录表I达，可上调PRRSVADE感染中IFN-β、TNF-α、IL-1β炎性因子及抗原递呈分子MHC-I、II表达，促进细胞的炎性反应，负向调控PRRSVADE效应。而膜型FcγRI的高表达，抑制了TLR7，下调了干扰素的产生。（3）PRRSV上调细胞中可溶型FcγRI比率，ADE作用抑制机体抗病毒

7、反应，影响靶细胞应答，增强FcγR介导的内吞，抑制炎性因子转录，诱导特异性TCRVβ细胞亚群增殖。研究了有、无PRRSV特异性抗体下PRRSV感染3D4/21细胞，几种FcγR的转录变化，Real-timePCR显示PRRSV仅上调了FcγRI的转录，而PRRSV通过特异性抗体介导的ADE感染时，FcγRIIB转录提高4倍且FcγRI被抑制。利用单基因-高分辨率熔解曲线（SGA-HRM）发现，受PRRSV影响显著上调的FcγRI主要为可溶型FcγRI，比例由19.5%（感染前）升至33.3%（感染后）。转录组分析数据也表明，ADE显著提高了

8、FcγR介导的内吞，增强FcγRIIB的转录，影响细胞表面FcγR的平衡，抑制抗病毒免疫应答。经转录组分析及RT-PCR验证，ADE作用抑制TLR7、RIG-I/MDA5，降低I