蜜蜂残翼病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

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分类号：S895.9单位代码：10193密级：公开学号：2012642硕士学位论文蜜蜂残翼病毒的分离鉴定及全基因组序列分析IsolationandGenomicSequenceAnalysisofDeformedWingVirus作者姓名：郑言学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：畜产品检验与食品安全指导教师：王振国研究员所在学院：动物科学技术学院2015年5月 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日 摘要蜜蜂残翼病病毒（Deformedwingvirus,DWV）是引起蜜蜂残翼病的病原体，可侵染各发育阶段的蜜蜂，在蛹期危害不明显，但羽化后出现翅膀残缺并迅速死亡；成年蜜蜂发病后翅膀畸形、腹部萎缩和褪色。呈隐性感染的蜜蜂虽然无明显临床症状但其寿命也会缩短。由于DWV与传播媒介瓦螨密切相关而被大量研究。近年来的研究表明DWV是引发“蜂群崩溃失调症”（Colonycollapsedisorder,CCD）的主要病毒之一，DWV在全球范围的流行已成为蜜蜂蜂群非正常消失的一个重要原因。DWV属于传染性软化病毒科（Iflaviridae）、传染性软腐病病毒属（Iflavirus），为单股、正链RNA病毒，基因组为单顺反子，病毒直径约为30nm，形状为二十面体。本研究对获得到的疑似DWV病料处理后，在健康的蜜蜂幼虫体内进行分离培养，由于DWV隐形传播的特性，在分离培养过程中未发现翅膀畸形等典型症状，但通过透射电子显微镜观察，发现了DWV的病毒粒子。根据GenBank上公布的蜜蜂残翼病（DWV）的基因组序列（GenBank:NC004830andAY292384）,在其保守区设计一对特异性的扩增引物，利用RT-PCR检测方法鉴定后，初步判断获得到了一株DWV。对获得到的基因进行克隆测序后，通过GenBank上的Blast程序进行比对，发现与GenBank上公布的美国株蜜蜂残翼病毒序列高度同源，同源性为96%。进一步证明了本研究成功分离到了一株蜜蜂残翼病毒。本研究根据GenBank上公布的蜜蜂残翼病（DWV）的基因组序列（GenBank:NC004830andAY292384）,采用TaqMan荧光标记探针技术原理，针对蜜蜂残翼病毒的保守序列，设计出一对特异性引物和一条探针，建立了一种快速检测蜜蜂残翼病毒的荧光PCR方法。该方法能够特异性的检测蜜蜂急性麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒和黑蜂王台病毒且无交叉反应，同时本方法能够检测1.0×102拷贝/µL的阳性质粒，对低病毒含量的样品检测灵敏度较高，且本方法的重复性和稳定性较好，变异系数小于1.6%。该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点，适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂残翼病毒的快速检疫。为了对蜜蜂残翼病毒的分子结构及分子生物学特性更深入的了解，我们对该病毒进行了基因组序列测定。根据GenBank上公布的蜜蜂残翼病毒基因组序列（GenBank:NC004830andAY292384）设计出11对扩增引物，利用引物步移方法策略，以病料中提取的病毒总RNA为模板，扩增得到了11段覆盖基因组的互相重叠片段，经过克隆、测序及软件拼接，最终得到基因组序列。测序结果表明，所测的蜜蜂残翼病毒基因组有9826个核苷酸序列组成，编码2375个氨基酸。通过相关分子生物学软件对所测序列进行分析，分析发现其I 与GenBank公布的USA1（AY292384）有很高的同源性，达到96.6%。通过系统进化树比较分析发现该病毒与Korea1（JX878304）和Korea2（JX878305）的遗传关系最近。关键词：蜜蜂残翼病毒（DWV），RT-PCR，克隆，基因组序列分析II AbstractDeformedwingvirus(DWV)isapathogenofcausingresidualwingbeedisease,caninfectvariousdevelopmentalstagesofthebees,thehazardinthepupastageisnotobvious,buttherewillbeincompletewingsafteremergenceandrapiddeath;whentheadultbeeswereinfected,thesymptomswerewingsmalformations,abdominalshrinkingandfading.Althoughthelatentinfectionbeeswerenoobviousclinicalsymptomsbutitslifewillbeshortened.BecauseDWViscloselyrelatedtoVarroamite,so,thereisalotofresearchaboutthem.RecentstudiesshowthatDWVisoneofthemainvirusthattriggered"colonycollapsedisorder"(Colonycollapsedisorder,CCD).DWVhasbecomeanimportantreasonfortheabnormaldisappearanceofhoneybeecoloniesinpopularityworldwide.DWVproducesa30nmicosahedralparticleconsistingofasingle,positivestrandRNAgenomeandbelongtotheiflaviruses.InordertoobtainDWV,wehaveisolatedandculturedthesuspectedDWVsamplesinhealthybeelarvae,duetopropagationcharacteristicsDWVinvisible,wedonotfounddeformitiesandothertypicalsymptoms,butbytransmissionelectronmicroscopy,wefoundtheDWVvirusparticle.AccordingtotheGenBankpublishedbeesresidualwingdisease(DWV)genomicsequence(GenBank:NC004830andAY292384),inwhichtheconservativedistrictdesignedapairofspecificprimersbyRT-PCRdetectionmethodsidentifiedaftertheinitialjudgegettoaDWV.AfterobtainingthegeneswereclonedandsequencedbyBlastprogramonGenBankforcomparison,theUnitedStatesfoundthattheresidualstrainofbeesonthewingvirussequenceshighlyhomologousinGenBank,thehomologyof96%.Thisstudyisfurtherevidenceofthesuccessofabeeisolatedremnantwingvirus.Accordingtothebeedeformedwingdisease(DWV)genomicsequence(GenBank:NC004830andAY292384)publishedinGenBank,usingTaqManfluorescentprobetechniqueprinciple,forresiduesconservedsequenceofDWVdesignedapairofspecificprimersandaprobetoestablisharapiddetectionmethod,afluorescentPCRmethoddetectDWV.Themethodcandetectacutebeeparalysisvirus,chronicbeeparalysisvirus,SacbroodVirusandblackqueenresidualvirusandnocross-reactionunits,meanwhile,thismethodcandetectlowlevelsofvirusofpositiveplasmidsabout1.0×102copies/μL.Themethodhashighsensitivity,reproducibilityandstability.Thecoefficientofvariationlessthan1.6%.Themethodisrapid,sensitive,specificandreproducible,suitableforrapidquarantineDWVofbeesandbeeproducts.InordertoknowthemolecularstructureandmolecularbiologicalcharacteristicsofDWV,III wehadsequencedthevirusgenome.AccordingtodeformedwingvirusgenomesequencespublishedonGenBank(GenBank:NC004830andAY292384),wehaddesigned11pairsofprimers,utilizingprimerwalkingmethod,takevirustotalRNAextractedfromsamplesastemplate,wehadachieved11fragments,aftercloning,sequencingandsoftwarestitching,ultimatelygetthegenomesequence.Sequenceanalysisshowedthatthedeformedwingvirusgenomesequencewasconsistof9826nucleotides,andencoding2375aminoacids.ThroughtheanalysisofrelevantmolecularbiologysoftwareforthemeasuredsequencesfoundthatithasahighhomologywithKorea-1(JX878304)publishedonGenBankabout96.6%.ThroughcomparativeanalysisoftheevolutionarytreewefoundthatthevirusisrelatedtoKorea1（JX878304）andKorea2（JX878305）ongeneticrelationship.Keywords:DWV,RT-PCR,Cloning,TaqmanPCR,GenomicsequenceanalysisIV 目录摘要......................................................................IAbstract..................................................................III前言......................................................................1第一篇文献综述.............................................................2第一章蜜蜂残翼病毒概述.....................................................21.1病原学特性............................................................21.2流行病学..............................................................31.3临床症状..............................................................61.4检测方法..............................................................71.5DWV的防治............................................................8第二篇研究内容.............................................................9第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定.............................................91.1材料..................................................................91.2方法..................................................................91.3结果.................................................................141.4讨论.................................................................171.5小结.................................................................17第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用..........182.1材料.................................................................182.2方法.................................................................182.3结果.................................................................202.4讨论.................................................................232.5小结.................................................................24第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列测定与分析.......................253.1材料.................................................................253.2方法.................................................................253.3结果.................................................................273.4讨论.................................................................313.5小结.................................................................31结论.....................................................................33 参考文献...................................................................33 吉林农业大学硕士学位论文前言前言蜜蜂是重要的授粉昆虫，其农业生态贡献巨大。但近10年来，全球蜜蜂种群数量急速下降，由此引发了世界范围内的授粉危机。在众多蜜蜂病害中，蜜蜂病毒病尤其特殊。自从2006年北美及欧洲爆发CCD后，蜜蜂病毒病更加引起人们的重视。有研究表明，蜜蜂残翼病病毒（Deformedwingvirus,DWV）是引发CCD的主要病毒之一，DWV是引起蜜蜂残翼病的病原体，可侵染各发育阶段的蜜蜂，在蛹期危害不明显，但羽化后出现翅膀残缺并迅速死亡；成年蜜蜂发病后翅膀畸形、腹部萎缩和褪色。DWV最初于20世纪80年代从日本分离得到，现已分布广泛，在欧洲、北美、南美、非洲、亚洲和中东均有发现。DWV能够以低浓度隐性感染方式长期传播于蜂群中，被瓦螨激活后，在宿主体内迅速复制，表现出较强的感染性，最终导致蜂群衰落。DWV在全球范围的流行已成为蜜蜂蜂群非正常消失的一个重要原因。在没有瓦螨寄生的蜂群中，DWV通常以低水平存在，并对蜂群无害。在高密度瓦螨寄生的情况下，往往出现翅膀畸形等典型症状，由于狄斯瓦螨的寄生性活动使DWV成为与蜂群衰落相关的主要病毒之一。1 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述第一篇文献综述第一章蜜蜂残翼病毒概述蜜蜂是重要的授粉昆虫，很久之前就发现蜜蜂翅膀畸形现象与一种病毒相关，因此给这个病毒定义了一个形象的名字：蜜蜂残翼病毒（DWV，DeformedWingvirus）。这种病毒能够通过外表寄生螨虫（瓦螨）传播。当瓦螨大量侵袭蜂群的时候，这种翅膀畸形的现象就会明显的显现，通常在种群衰落的后期，这种正症状就更为明显。在瓦螨大量爆发的蜂群中的，DWV成为与蜜蜂种群衰落相关的主要病毒之一[1-2]。调查最初的翅膀畸形的蜜蜂样本是在20世纪80年代初，最终结果显示出DWV基因组为相当不稳定的二十面体的单链RNA基因组病毒。随后大量研究也表明，在同一个蜜蜂种群中，DWV的滴度越高，翅膀畸形现象就越明显，滴度降低，蜜蜂的翅膀畸形现象趋于正常[3]。在没有被瓦螨感染的情况下，DWV在蜜蜂种群中是呈低水平存在的，并且没有有害的影响，在所有存活的阶段都存在，从卵开始到成蜂，到腺体分泌物中饲喂幼虫和蜂王。DWV既可以水平传播又能垂直传播。然而，由于蜜蜂疾病众多，很难将其它能够导致蜜蜂翅膀畸形现象的原因排除在外，因此，DWV与该症状直接的关系很难建立。在本综述中，我们将简要首先描述关于DWV的病原学特性。其次，我们将讨论DWV的发展历史及分布，DWV的传播途径，第三，我们将讨论DWV与瓦螨之间的关系，传播与毒力之间的关系，以便于我们更好的理解DWV。最后，我们将描述在蜜蜂不同生长发育阶段DWV的滴度变化，以及针对DWV的检测方法和防治办法。1.1病原学特性DWV属于传染性软化病毒科（Iflaviridae）、传染性软腐病病毒属（Iflavirus），为单股、正链RNA病毒，基因组为单顺反子，病毒直径约为30nm，形状为二十面体[4-6]。基因组结构包括一个大的、连续的开放阅读框（Openreadingframe，ORF），5’端有一个长的非翻译区域（5’UTR），3’端有一个短的、高度保守的非翻译区域(3’UTR)，3’端以多聚A尾巴结尾。5’UTR和3’UTR对基因组翻译和复制调节非常重要[7-9]。多聚蛋白的氨基末端从前导肽（Leaderpolypeptide，LP）开始，LP后面为结构蛋白VP3、假设的VP4、VP1和VP2。多聚蛋白的羧端含有非结构蛋白、解旋酶的保守基序、假设基因组连接蛋白（Putativegenome-linkedviralprotein，VPg）、3C-蛋白酶和依赖于RNA的RNA聚合酶[10-11]。DWV基因组编码三个主要的结构蛋白，与许多类小核糖核酸类昆虫病毒的特性相似。DWV和瓦螨病毒1（Varroadestructorvirus-1，VaDV-1）的基因组结构均为典型的传染性软腐病病毒属（Iflavirus）[12]。5’UTR有一个内部核糖体进入位点（IternalRibosomeEntry2 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述Site，IRES），活跃在一些昆虫细胞株或哺乳动物、昆虫和植物无细胞的翻译系统中。尽管IRES的结构仍未阐明，但其基本组成已经被认定，并位于ORF开端之前的300个核苷酸。IRES也被证实存在于其他传染性软腐病病毒属、微小核糖核酸病毒(Picornaviruses)和双顺反子病毒（Dicistroviruses）的5’UTR[13-14]。通过类比相关病毒[15-16]，ORF最可能以甲硫氨酸开始，尽管这并不是IRES介导翻译的必要条件[17]。传染性软腐病病毒属中多聚蛋白的病毒蛋白顺序非常典型，其多聚蛋白中氨基端的结构蛋白和羧基端的非结构蛋白与哺乳动物小核糖酸病毒类似，都是结构蛋白位于氨基端且非结构蛋白位于羧基端[18]。DWV解旋酶区域A、B、C分别为GxxGxGKS、Qx5DD、KKx4Px5NTN，C区域与已知序列KGx4Sx5STN稍微不同[19-20]。3C样蛋白域包括半胱氨酸蛋白酶GxCG和公认的的底物连接残留物的酶作用物GxHxxG。同样发现了全部的8个公认的RdRp域，包括核心域IV、V、和VI也参与到催化作用和NTP连接,有一个附加的，高保守区域(TSxGxP)位于RdRp域I之前。DWV基因组包含多个功能结构域，如一个解旋酶、一个3C蛋白酶、一个依赖于RNA的RNA聚合酶和两个病毒壳体蛋白结构域，还有一个VPg和一个位于结构蛋白前面的LP。VPg是大多数正链RNA病毒中常见的一种小蛋白，它共价结合在基因组的5’末端，并与RNA稳定性、基因组复制、翻译和转运有关[21]。在微小核糖核酸病毒中，VPg大约由23个氨基酸残基组成，含有一个能物理连接到RNA的早期酪氨酸残基，位于3C蛋白酶结构域之前。在许多微小核糖核酸病毒中，大多数的VPg序列位于解旋酶和3C蛋白酶之间[22]。相对DWV而言，只有一个较弱的VPg结构域位于2093和2118氨基酸之间，并且在2097氨基酸位点上包含一个酪氨酸残基。LP位于VP3之前，像VPg一样，LP可能有多重功能，常见的特性为具有蛋白酶活性。在DWV的LP序列中也有几个蛋白酶结构域。LP在氨基酸水平通常高度可变，DWV的LP也是如此，并且能抑制依赖于帽子结构的信使RNA的翻译和刺激病毒IRES的活性[23-24]。1.2流行病学1.2.1DWV的历史和分布DWV最初是1977年从无症状的埃及成年蜜蜂病毒（Egyptbeevirus，EBV）体内分离得到的[25]。随后，在1982年通过血清学实验从日本畸形的成蜂内分离得到一株与EBV亲缘关系较远的病毒，由于分离病毒的成峰翅膀畸形明显，因此称之为蜜蜂残翼病毒。二十世纪70-80年代，随着瓦螨的出现，DWV已经遍布全球[26]。然而，在瓦螨出现前，人们对DWV几乎未知。这使人们不禁产生疑问，DWV是否和瓦螨一样起源于东南亚，或者来自亚洲的中华蜜蜂（Apis.Cerana,瓦螨的原始宿主），还是来自意大利蜜蜂（A.mellifera）的原始病毒。二十世纪80年代中期的英国试验记录显示，在DWV发病率较低的斯堪的纳维亚半岛北部，DWV在瓦螨爆发前就已经被记载，说明DWV与瓦螨具有一定的关联性，但是DWV也可能通过进口来自感染区的蜂产品或蜂王而传入，因此这些来3 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述自养蜂业管理控制区的记录具有一定的局限性。瓦螨在DWV流行病学中的主导性作用，也使DWV随着瓦螨的季节性活动而呈季节性分布。现在已经在野生的和商品化的熊蜂中检测到DWV，通过血清学实验在中华蜜蜂（Apis.cerana）和矮小蜜蜂（A.florea）也证明了DWV的存在[27]。根据瓦螨的寄生方式和在病毒传播中的关键作用，在狄斯瓦螨（V.destructor）和梅氏热厉螨（Tropilaelapsmercedesae）[28-29]中也发现了DWV。梅氏热厉螨是一种小的吸食血淋巴的外寄生虫。同时在一些小蜂窝甲虫（Aethinatumida）[30]中也检测到了，它是一种食腐动物而不是蜜蜂寄生虫[31-32]。在蜜蜂、害虫、寄生虫中都检测到了DWV，证明了该病毒能通过不同宿主传播，且被动获得。同时瓦螨中的病毒滴度比其寄生的宿主的病毒滴度高也证明了这一点。大量研究证明DWV在一些瓦螨中复制，大多数螨虫被动获得并机械传播这种病毒，并激活病毒的感染性，类似情况也可能存在于梅氏热厉螨和小蜂窝甲虫中[33]。1.2.2传播途径DWV通过瓦螨采食蜜蜂血淋巴或蜜蜂交哺而水平传播。FievetJ等人通过原位杂交在成蜂中肠上皮细胞中检测到且肠内容物充满了成熟的病毒颗粒，这些结果和ChenYP等人在粪便中通过RT-PCR方法检测到的结果一致，表明DWV在中肠中复制并通过内腔排出，这一过程的发生并不引起大量的肠细胞破坏或影响到消化系统，因为未出现腹泻或便秘等症状。然而，由于在喂食感染DWV的蔗糖溶液的蜜蜂中未检测到DWV[34]，因此，在DWV整体流行病学中，粪-口传播的传播效率及地位还有待进一步确认。DWV能感染蜂王的卵巢和雄蜂的储精囊。蜂王产下带病毒的卵，将病毒从亲代传给子代，这种传播方式即为垂直传播。ChenYP等人2006年通过人工授精方式，将DWV阳性精虫和DWV阴性卵结合，产生了100%阳性的授精卵，DWV阳性未受精卵发育为感染DWV的雄蜂，DWV阳性授精卵发育为感染DWV的工蜂，直接证明了存在DWV通过雄蜂和蜂王垂直传播的路径[35]。1.2.3DWV与瓦螨之间的关系蜜蜂、DWV和瓦螨间的关系非常复杂。瓦螨通过不同途径携带DWV后，病毒在瓦螨体内完成复制增殖，最终将高浓度的病毒传播给蜂卵。这也是为什么随着瓦螨数量增加，蜜蜂发生残翼现象也会增加。蜂群中瓦螨数量与蜜蜂感染DWV之间具有相关性。当两个或更多的雌性螨虫进入蜂巢时，只要有一个携带DWV就会导致交叉感染，并且后代会寄生在食物或发育中的蜜蜂上。最终，蜜蜂数量将衰落，成蜂和卵也会减少，整个蜂群可能面临崩溃[36]。在DWV的传播过程中，瓦螨不仅仅是机械性的传播媒介，还扮演者生物学传播媒介。DWV在螨虫体内的复制和残翅的发育之间的关系表明，尽管DWV通过螨传播到蛹是出现残翅症状的先决条件，但是一个决定性的因素是DWV在螨中的复制发生在4 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述传播前。DWV的感染是蜜蜂出现残翅症状重要原因。当大量感染DWV的蜂卵被产下后，培育这些蜜蜂消耗的能量，以及早期工蜂的丢失都将对蜂群产生明显的负面影响。此外，由于DWV感染引起导致蜜蜂的学习行为减弱也将影响到蜂群。因此，瓦螨诱在诱导蜂群衰落的扮演着一个非常重要的角色。当蜂卵培育变慢且螨虫水平达到高峰，DWV的流行将加速工蜂过度消失而引起蜂群数量迅速减少，这样的群体衰落通常伴随着大量死亡的蜜蜂在蜂巢的周围，许多蜜蜂出现干翅膀瘪，缺少工蜂培育的蛹和卵将散落下来。1.2.4传播与毒力的关系病原体的毒力受限于传播方式，如果病原体需要通过宿主繁殖和传播，那么一个健康的宿主对于病原体的长期存在是有益的。病原体的毒力过低时，对宿主的影响不大，但会抑制病原体的传播。高毒力的病原体虽能够提高病原体传播效率，但会因此导致宿主平均寿命太短而抑制病原体的传播。因此，毒力能够影响病毒的传播，同时传播也同样影响着毒力。病原体毒力越小，对宿主的健康和寿命的影响就越小，依赖宿主生存和生殖的垂直传播方式就更容易建立。相反，能够迅速杀死宿主的强毒力病原体喜欢水平传播路线，提供直接的病原体传播方式。从相反的角度分析，水平传播对宿主有很大的负面影响，而依赖于弱毒力病原体的垂直传播方式则更易于下一代宿主的繁殖。鉴于毒力进化是围绕一个传播和毒力相互权衡的进化方式发展的，由此可能推断出DWV毒力的强弱源于病毒的传播路线。DWV在个体水平通过雄峰和蜂王垂直传播，在群体水平通过被感染群体的生殖群游也是垂直传播。在个体和群体水平，垂直传播路线不会引起任何的临床症状或对宿主健康有任何负面影响，证实了弱毒性病原体通过垂直路线传播，而不能依赖于直接的水平传播方式。DWV通常在无瓦螨存在的情况下毒力较弱，能使被感染的卵从蜂蛹发育到成蜂。正因为它的弱毒性才使DWV成为与瓦螨密切相关的主要病毒，因为更多高毒力的病毒如CBPV、ABPV、BQCV、SBV、和SPV能迅速杀死蜂卵而使瓦螨不能在蜂蛹阶段完成发育，并将病毒传播给新宿主。DWV通过瓦螨注入到蜜蜂血淋巴的这种传播方式则会导致明显的急性和致命性的感染。因此，根据毒力进化权衡模型可知，DWV有向更强毒力进化的可能性很小。1.2.5不同发育阶段蜜蜂体内的DWV滴度ChenYP等通过实验发现不同生长阶段的蜜蜂，其DWV的含量有很大差别。蜂蛹中DWV的含量最高，而成年雄蜂体内的病毒含量最低，工蜂的病毒含量是成年雄蜂的10倍。DWV滴度在蜂群中从高到低的顺序为：蛹>残翼成年蜂>幼虫>明显健康的蜜蜂>成年雄蜂。病毒滴度的不同可能反映出不同发育阶段蜜蜂抵抗DWV的感染能力不同。雄蜂感染率最低，表明成年雄蜂比成年工蜂及卵具有更强的抵抗能力，但尚无关于蜜蜂免疫防疫5 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述系统的相关研究，特别是详细比较不同发育阶段蜜蜂免疫防疫能力差异方面的研究。与其它发育阶段的蜂相比，DWV在蜂蛹中的增殖效率最高，说明蜂蛹是DWV复制的最好载体。此外，蜂卵也能够携带高滴度的病毒，并且在卵发育到成蜂后表现出残翼症状，表明蜂卵对一定滴度的DWV具有抵抗力。BaileyL和GibbsAJ报道了在没有麻痹症状和死亡现象的蜂群中可能含有106敏感蜜蜂麻痹病毒颗粒。引起这种隐性感染的原因可能是病毒复制受到抑制，因为试验表明当102的敏感蜜蜂麻痹病毒被注入血液就能引起麻痹症状。一少部分的蜜蜂出现残翼可能是由DWV和其他因素共同引起的，例如狄斯瓦螨感染，营养不良，和不良天气等都能触发血液中的DWV的发病，导致卵的早死或者少量成年蜂出现残翼症状。健康蜂和残翼蜂之间不同的病毒浓度表明病毒滴度是成年工蜂中出现残翼现象的一个关键因素[37]。1.3临床症状DWV能够感染所有发育阶段的蜜蜂，包括卵、幼虫、蛹和成蜂。在自然条件下，大多数病毒通常呈隐性感染而没有明显的症状出现。当蜂群中存在大量携带DWV的瓦螨时，DWV致病性非常高，进而引起蜂蛹死亡、成年蜜蜂翅膀畸形、胀气、腹部萎缩和褪色等明显症状，导致整个蜂群的平均寿命缩短。自从2006年北美及欧洲爆发CCD后，CCD已经导致美国35个州，加拿大的5个省和欧洲一些国家超过1/3的蜜蜂灾难性地消失和死亡。CCD爆发后工蜂数量迅速减少，留下不能自理的蜂王和蜂蛹，由于少量的工蜂不能供给足够的食物最终导致蜂群崩溃[38]。农业受CCD影响最为严重，CCD现象使农作物授粉几率减少，因而降低农业生产量，并可引起大规模的食物短缺；其次是畜牧业，由于草料缺少传播花粉的媒介，以草料为食的家畜受到不利影响；此外，直接受影响的是蜂产品，尤其是蜂蜜产量，导致蜂产品价格上涨，进而影响其下游产业，如食品、医药和化工等领域。有研究表明，DWV是引发CCD的主要病毒之一。虽然引起CCD的病原仍未明确，但众多研究表明CCD症状并非单个因素引起的，可能由多个因素共同作用而引发综合病症，其中瓦螨与病毒的协调作用更是引发CCD的主要原因，瓦螨是传播DWV的重要机械载体和生物载体，因此，DWV已经成为研究CCD的一个重要指标。1.3.1致病过程在蜜蜂蛹化变成工蜂或雄蜂，蛹巢被封闭之前约20-40h，雌性瓦螨进入蛹巢并产卵。螨虫以蜂蛹、即将发育成的蜂蛹和成峰的血淋巴为食。大约60h后，成年雌性瓦螨产下第一颗卵，最多能产出超过10个卵。成年雌性瓦螨和其后代同样以蛹的血淋巴为食。瓦螨的所有生殖行为都发生在蛹巢内，并且只有成年雌性瓦螨在蜜蜂羽化后存活。一些未成熟的雌性、卵和雄性瓦螨被留在蛹巢，之后被工蜂运走。瓦螨吸食成峰和发育中的蛹的血淋巴，会造成蜜蜂虚弱且平均寿命缩短[39]。瓦螨在蜂群中的迅速传播有几个因素，包括分群、被寄生蜜蜂的漂移和衰落蜂群的侵袭。除此之外，养蜂者的迁徙行为和进口携带病原的货6 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述物都是瓦螨在大范围地理区域迅速传播的诱因。病毒在宿主细胞的细胞质中复制。病毒粒子依附在细胞表面并干扰细胞膜上的感受器，将病毒注入宿主细胞。病毒进入细胞后RNA基因组被翻译成独立多聚蛋白，接着裂解为结构蛋白和功能蛋白，完成RNA复制。在依赖于RNA的RNA聚合酶的帮助下，正股RNA基因组被复制为负股中间体，作为新的基因组复制模板装入到子代病毒颗粒[40]。1.4检测方法DWV能够感染所有发育阶段的蜜蜂，包括卵、幼虫、蛹和成蜂。在自然条件下，大多数病毒通常呈阴性感染而没有明显的症状出现。另外，蜜蜂群体往往能同时感染多种病毒，这就给诊断带来了挑战。传统的诊断方法包括血清学方法，如乌赫特朗尼氏凝胶双向扩散试验、间接荧光抗体实验或酶联免疫吸附测定实验，由于特异性较低不能区分不同病毒，因此诊断效果不理想。近几年，分子生物学方法由于其高特异性和敏感性强而被大量应用，如PCR检测方法被大量研究和应用，近年来建立的DWVPCR检测方法见表1-1所示。表1-1PCR检测方法Tab.1-1ThedetectionmethodsofPCR时间方法引物5’-3’产物长度/bp文献TimemethodPrimersequenceProductlengthReference2005年F1:CCTGATAATCAACAAGGACCTGGRT-PCR355B1:CAGAACCAATGTCTAACGCTAACCC2005年F2:ATCGTAGACTGGAAGGATGGTCC568RT-PCRB3:GAGAAGACATTTGCTTGAACCTCC2005年F4:GCAAATGTCTTCTCACTGGTGTCTC516RT-PCRB5:TGCTTTCAAAATCTCAGGCTCG2005年F6:TTTCCAGGTCCATTCCCCTATC393[41]RT-PCRElkeGenerschB8:TCATTCGCCTTACGACGGTTAG2005年F7:TCATCTTCAACTCGGCTTTCTACG479RT-PCRB11:CGAATCATTTTCACGGGACG2005年F10:TGCCAGTTACTACTAAGCCTCAGGG596RT-PCRB16:CGAACCACAAACACCATCGC2005年F15:TCCATCAGGTTCTCCAATAACGG451RT-PCRB23:CCACCCAAATGCTAACTCTAACGC2006年DWVF:CCTGCTAATCAACAAGGACCTGG355RT-PCRConstanzeYue等[42]DWVR:CAGAACCAATGTCTAACGCTAACCC2008年DWVF:GTAAGCGTCGTGAACATACTG1129RT-PCRD.C.deGraaf等[43]DWVR:GACTCTCTCCCGCGAGA2008年SYBRGreenⅠDWVF:CTGTATGTGGTGTGCCTGGT226DeborahKukielka荧光定量DWVR:TTCAAACAATCCGTGAATATAGTGT等[44]RT-PCR2009年VP1a-F:TGCAAAGATGCTGTCAAACC424GeoffreyR.RT-PCRVP1a-R:TGACCCGATGCTGTCAACCWilliams等[45]2009年Actin-F:ATGAAGATCCTTACAGAAG514GeoffreyR.RT-PCRActin-R:TCTTGTTTAGAGATCCACATWilliams等[45]2010年DWV-F:ATATTCACGGATTGTTTGAAAGA610多重RT-PCRIvan.Meeus等[46]DWV-R:CRCTAACATTCATGATAAGATCGTC2011年DWV-F:ATCAGCGCTTAGTGGAGGAA702RT-PCR薛力刚等[47]DWV-R:TCGACAATTTTCGGACATCA7 吉林农业大学硕士学位论文第一篇蜜蜂残翼病毒概述时间方法引物5’-3’产物长度/bp文献TimemethodPrimersequenceProductlengthReference2012年SYBRGreenⅠDWV-F:TCCATCAGGTTCTCCGATAAC290荧光定量DWV-R:GCCACAGGTCTAGTTGGATG王蕾等[48]RT-PCR2013年DWV-F:TGGTCAATTACAAGCTACTTGG269GuillermoHernán多重RT-PCRDWV-R:TAGTTGGACCAGTAGCATCATSguazzaa等[49]1.5DWV的防治蜜蜂病毒已经对全球的养蜂业造成极大的威胁，同时，近年来的越来越多的研究表明瓦螨等媒介生物在蜜蜂病毒性疾病的传播和发病中有重要作用，由于尚无有效的治疗蜜蜂病毒性疾病的药物，因此，防治DWV应该从杀灭或控制瓦螨、选择对瓦螨更加耐受的蜜蜂种属和研发治疗DWV的有效药品等方面入手。在生产实践中，第一要选用无病害、抵抗力强的种群。第二要加强日常饲养管理，保持蜂群数量与蜂脾相当，做好保温工作，给蜂群提供充足的食物，必要时辅以维生素等提高免疫力，同时要提高蜂场的卫生条件，及时清扫蜂箱内外的死蜂及蜂蛹，每年秋末冬初要对蜂箱及蜂具消毒，减少传染源。由于蜂螨均已成年蜜蜂及幼虫的体液为食，受蜂螨危害的蜂群数量快速减少，因此一定要在螨虫高峰期来临之前加强观察，做到早发现早治疗，避免蜂螨大量爆发。防重于治，一些传播媒介如瓦螨不可能完全根除，这就要求养蜂者在日常管理中要加强防控，注重卫生，提高饲养水平。8 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定第二篇研究内容第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定DWV是许多蜜蜂病毒中的一种，由于能够被瓦螨诱发，致使DWV与蜜蜂群体衰落密切相关。在无瓦螨的情况下，DWV的感染并无可见的症状也没有对宿主健康起到任何负面影响。然而，当蜂群中瓦螨的数量大量增多的时候，DWV的滴度也随之增高，蜜蜂表现出典型的临床症状，包括蛹的死亡、成蜂出现翅膀畸形及腹部褪色等。DWV可侵染各个发育阶段的蜜蜂个体，在蛹期危害不明显，而羽化时出现翅膀残缺，失去飞行能力，无明显临床症状的蜜蜂个体的平均寿命也会大大缩短。本试验从吉林地区蜂场中分离到了DWV，为后续的试验提供了研究基础。1.1材料1.1.1主要试剂及病料TaqDNA聚合酶（TaqDNAPolymerase），dNTPs，10×buffer缓冲液，2000bpDNALadderMarker，pMD18-T载体，大肠埃希菌DH5α，cDNASythesisKit，宝生物工程（大连）有限公司产品；PCR引物，生工生物工程（上海）有限公司合成；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒，AxyPrep质粒DNA小量试剂盒，康宁生命科学（吴江）有限公司；胰蛋白胨，酵母浸出物，OXOID公司产品。健康蜂群中的巢脾，购自长春某蜂场。吉林地区部分蜂场高度疑似患有蜜蜂残翼病的蜜蜂病料。1.1.2仪器高速冷冻离心机（SIGMA3K30，德国西格马公司），核酸蛋白分析（GeneSpecV,HitachiNaKainstrumentsCo.,Ltd.日本），PCR扩增仪(BiometraTgradient-96,德国Biometra公司)，电泳仪（SACANTPS500A美国），生化恒温培养箱，微量移液器（0.1-1000µLBIOHIT芬兰）、恒温水浴锅、超低温冰箱（合肥美菱股份有限公司）、恒温恒湿培养箱（德国BINDER公司）。1.2方法1.2.1样品采集与病理观察对吉林地区5个蜂场进行样品采集，采集过程中重点采取蜂箱内外失去飞行能力、翅膀残缺的蜜蜂个体，将采集到的蜜蜂加入保存液（PBS：20%-50%甘油，2000U/mL青霉素，200µg/mL链霉素），带回实验室置于-70℃条件下保存备用。通过对疑似感染蜜蜂残9 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定翼病毒的蜜蜂个体的病料变化观察，主要表现为翅膀褶皱或残缺、爬行等临床症状，同时，在样品采集的过程中，我们还发现了被认为和蜜蜂残翼病密切相关的螨虫，我们一并进行了照相取证。1.2.2病毒扩增与电镜鉴定在无菌条件下将获得到的样品加入PBS溶液充分研磨，研磨后反复冻融3次，2000r离心30min，吸取上清，用0.22µm滤膜过滤，用1mL注射器吸取过滤后的液体接种到健康蜂脾上的蜂巢中，每个蜂巢大约接种40µL，接种过程中注意不要扎到蜜蜂幼虫，接种后将蜂脾放入培养箱（温度：35℃，湿度：50%）中培养，在培养过程中及时清理掉散落掉的蜜蜂幼虫，培养5d后，收集发育成熟的工蜂及蜂巢中未腐烂的幼虫，置于-70℃冰箱中保存。对扩增病毒后的蜜蜂病料充分研磨，研磨后反复冻融3次，2000r离心30min，吸取上清，用0.22µm滤膜过滤，将滤液送至长春应用化学研究所，进行透射电镜鉴定。1.2.1引物设计与合成根据Genbank公布的蜜蜂残翼病病毒全基因组核苷酸序列（GenbankAY292384），根据其保守序列设计一对特异性引物，理论扩增片段大小为702bp，引物由生工生物工程有限公司合成。引物见表1-2表1-2引物序列Table.1-2sequenceofprimer基因中的位置引物名称序列FATCAGCGCTTAGTGGAGGAA6250-6960RTCGACAATTTTCGGACATCA1.2.2病毒总RNA的提取用病毒RNA提取试剂盒（TIANampVirusRNAKit）提取病毒总RNA，步骤如下：用移液器将560µLCarrierRNA工作液（为裂解液RL与CarrierRNA溶液的混合液，配置方法按照公式计算）加入一个干净的1.5ml离心管中。向离心管中加入140µL的血浆/血清/淋巴液（样品需平衡至室温）。涡旋震荡15s混匀。（1）在室温下孵育10分钟。（2）瞬离收集附着在管壁及管盖的液体。（3）加入560µL无水乙醇，盖上管盖并涡旋震荡15s。（4）瞬离收集附着在管壁及管盖的液体。（5）仔细将离心管中的630µL液体转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，6000g离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中。（6）重复步骤（7）（7）小心打开吸附柱盖子，加入GD(使用前检查是否加入无水乙醇)，盖上管盖，600010 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定g离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。（8）小心打开吸附柱盖子，加入500µL容易RW(使用前检查是否加入无水乙醇)，盖上管盖，6000g离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管。将吸附柱放回收集管中，13400g离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液。（9）可选步骤：将吸附柱放回2ml收集管中，打开吸附柱的盖子，室温放置3分钟，使吸附膜完全变干。（10）将吸附柱放入一个RNase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入60µLRNase-freeddH2O，盖上盖子，室温放置5分钟。6000g离心1分钟。1.2.3反转录合成cDNA以提取的RNA为模板，按照TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver3.0试剂盒进行反转录反应，反应体系为2µLMgcl2，1µL10×RTBuffer，3.75µLRNase-freeddH2O，1µLdNTPMixture，0.25µLRNaseInhibitor，0.5µLAMV，0.5µLrandom9mers，1µLRNA，共10µL。反应条件为：3010min℃，4230min℃，995min℃，55min℃。1.2.4特异性引物PCR鉴定以RT产物为模板，用特异性引物F、R进行PCR扩增鉴定。反应体系条件为10µL5×PCRBuffer，28.75µLRNase-freeddH2O，0.25µLTaKaRaExTaqHS，0.5µLF，0.5µLR，共50µL。反应条件为94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸10min。1.2.5琼脂糖凝胶电泳以DL2000DNAMarker为标准分子量，采用1g/L琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物加样量为5µL，条件为：100V45min，在凝胶成像系统下进行拍照。1.2.6目的片段的回收纯化用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0试剂盒对PCR扩增产物进行回收纯化，具体步骤如下：（1）使用TEB缓冲液配置1%的琼脂糖凝胶，对目的片段进行琼脂糖凝胶电泳。（2）电泳结束后将凝胶表面的液体尽量吸干，尽量切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，没有条带的地方尽量切除，以提高回收效率，本步骤应在暗室的紫外灯下进行。（3）用刀片尽量将胶切成碎块，利于胶块的融合，减少DNA的降解。（4）称量胶块重量，计算胶块体积，以1mg=1µL进行计算。11 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定（5）向胶块中加入3倍凝胶体积的DR-IBuffer。（6）均匀混合后置于75℃水浴中融化，胶块一定要充分融化，否则将影响DNA的回收率。（7）向上述胶块融化也中加入DR-IBuffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer，混合均匀。当分离片段小于400bp时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。（8）将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。（9）将上述操作的步骤7的溶液转移到SpinColumn中，12000rpm离心1min，弃滤液。（10）将500µL的RinseA加入SpinColumn中，12000rpm离心30s，弃滤液。（11）将700µL的RinseB加入SpinColumn中，2000rpm离心30s，弃滤液。（12）重复步骤11。（13）将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25µL的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1min。（14）12000rpm离心1min洗脱DNA。经琼脂糖凝胶电泳验证后保存于-70℃备用。1.2.7目的基因的连接、转化及克隆1.2.7.1感受态制备（1）将存于-70℃D大肠杆菌取出，在无菌环境下，用一次性无菌接种环蘸取少量接种于无Amp的LB固体平板培养基上，室温放置，待均匀完全吸收后，将平板培养基倒置放置与37℃恒温培养箱中过夜。（2）在无菌环境下挑取培养过夜的平板上的单个菌落，置于含有约3ml不含抗生素的液体LB培养基中，置于37℃摇床过夜培养。将培养过夜的菌液导入100mlLB液体培养基中，继续振荡培养约3h，OD600值为0.4至0.6为宜。（3）在无菌条件下将50mlPE管置于-20℃冰箱预冷，然后将菌液转移到PE管中放置于冰上，使培养物冷却至0℃，大约10min。（4）冷却后将PE管离心，4000rpm，10min，4℃。（5）将液体倒净，用事先冰上预冷好的0.1MCaCl210ml将沉淀充分重悬，冰浴20min。（6）4℃下4000rpm离心10min。（7）离心后，将液体倒掉，将管倒置1min，使液体流尽，再用2ml预冷好的0.1MCaCl212 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定重悬。然后加入终浓度为15%的甘油混匀。（8）将上述制备好的感受态细胞分装，保存于-70℃备用。1.2.7.2连接载体PMD18-T按照说明书上的步骤进行连接反应。次步骤在冰上进行，具体反应体系为：1µLPMD18-TVector，3µLDEPC水，1µLDNA纯化样品，5µLSolutionI，共10µL。反应条件：混匀后16℃连接过夜。连接产物置于4℃保存。1.2.7.3转化及阳性克隆的筛选（1）取连接产物10µL加入到200µL的感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。（2）将其放入42℃的水浴锅中，热激90s（避免剧烈摇动）（3）热激后立即冰浴2min。（4）加入800µL事先预热好的LB液体培养基，放到恒温水浴振荡器中，37150rpm℃振荡2h-4h。（5）将离心管从振荡器中取出，12000rpm离心2min。吸出400µL上清液，弃之，用移液器吹散沉淀。（6）将上述液体取100µL均匀涂布于含有Amp、X-Gal、IPTG的LB琼脂平板上，室温静置到液体完全被吸收，倒置放入37℃恒温培养箱12-16h。（7）将平板放于4℃，使蓝色充分显色。便于挑选白色菌落。1.2.8重组质粒的鉴定1.2.8.1重组质粒的提取质粒的提取用TaKaRaMiniBESTPlsmidPurificationKitVer.2.0进行提取，具体步骤按试剂盒说明书进行。（1）挑取单个菌落接种到5ml的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中（Amp：LB=1：1000），37℃水浴振荡培养过夜。（2）取1-4ml的菌液，12000rpm离心2min，弃去上清液。（3）用250µL的SolutionI（含RNaseA1）充分悬浮细菌沉淀。（4）加入250µL的SolutionII轻轻上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。13 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定（5）加入400µL的4℃预冷的SolutionIII，轻轻的上下翻转混合5-6次，直至形成紧实的凝集块，然后室温静置2min。（6）室温12000rpm离心10min，取上清。（7）把吸附柱安置于收集管上。（8）将上述操作6的上清液转移到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。（9）将500µL的RinseA加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。（10）将700µL的RinseB加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃滤液。（11）重复操作步骤10。（12）将吸附柱安置于收集管上，12000rpm离心1min。（13）将吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在吸附柱膜的中央加入60µL的灭菌蒸馏水ElutionBuffer，室温静置1min。（14）12000rpm离心1min，洗脱DNA。所提取的治疗置于-70℃保存备用。1.2.8.2重组质粒PCR鉴定利用PCR鉴定重组质粒，以重组质粒为模板，以F、R为引物，进行PCR反应，反应体系为：10µL2×PCRMixture，1µLF，1µLR，1µL重组质粒，7µL灭菌蒸馏水。反应条件：942min℃；9430s℃，5530s℃，7245s℃反应35个循环；72℃延伸10min。1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.2.8.3重组质粒的双酶切鉴定在PMD18-T载体上选择两个限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切反应。反应体系为：0.5µLEcoRⅠ，0.5µLSalⅠ，1µL10×Taqbuffer，5µL重组质粒，3µL灭菌蒸馏水。反应条件：37℃恒温水浴3h，1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.2.8.4测序及序列分析挑选阳性菌落，摇菌制成甘油菌，送上海生物公司进行测序。1.3结果1.3.1病理变化在采样的过程中，我们发现有的蜂场中蜜蜂翅膀出现萎缩，失去飞行能力，疑似蜜蜂残翼病的发病症状，同时我们还在出现疑似症状的蜂箱中发现了蜜蜂残翼病毒的重要传播14 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定媒介螨虫。如图1.1、1.2。图1.1疑似感染蜜蜂残翼病毒蜜蜂图1.2蜂箱中的螨虫Fig1.1suspectedbeeinfectedbyDWVFig1.2themiteofbeehive1.3.2病毒分离结果由于蜜蜂残翼病毒的隐性遗传特点，致使在分离培养过程中未发现翅膀畸形等特异性症状。将病毒扩增后的蜂料加入PBS溶液充分研磨，研磨后反复冻融3次，2000r离心30min，吸取上清，用0.22µm滤膜过滤处理后，通过透射电子显微镜发现了病毒粒子，如图1.3。图1.3DWV透射电镜图片Fig1.3TransmissionElectronMicroscopepictureofDWV1.3.2RT-PCR检测结果利用设计的特异性引物，对5个蜂场分离培养后的蜂料提取病毒总RNA后，通过RT-PCR方法扩增了一段长约702bp的片段（图1.4），其大小与预期扩增片段基本一致，可初步判断分离到的病毒为蜜蜂残翼病毒。15 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定M1234562000bp1000750702bp500250100图1.4RT-PCR检测结果M.DL2000Marker；1-5.PCR扩增产物；6.阳性对照Fig1.4DetectionresultsofRT-PCRM.DL2000Marker；1-5.PCRproductofsamples；7.positivecontrol1.3.3克隆质粒酶切鉴定结果经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，重组质粒的连接片段与设计扩增长度相一致，证实重组克隆质粒构建成功，结果见图1.5。M122000bp1000750500250100图1.5DWV基因克隆质粒双酶切鉴定结果M.DL2000Marker;1.质粒扩增产物;2.双酶切产物Fig1.5IdentificationresultsofcloningplasmidbyenzymedigestionM.DL2000Marker；1.Plasmidamplification;2.DoubleenzymedigestionproductsofDWV1.3.4RT-PCR扩增产物测序及同源性比较将重组质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序，结果显示该片段大小为711bp，将测序结果利用NCBI上BLAST功能进行同源性比较，结果表明，该核苷酸序列与Genbank上公布的DWV同源性在93%-96%之间。目的基因序列如下所示。ATCAGCGCTTAGTGGAGGAAATGAAGGCATTTAAGGAACGTACACTATGGTCAGATTTACATCGTGTAGGTGCGGAAATTAGTGCGTCAGTTAAGAAAGCTTTACCAACCATTTCCATATCCGAAAAACTACCACATTGGACTGTTCAATGTGGTATTGCTAAACCTGAGATGGATCATGCTTATGAGGTTATGAGTTCGTATGCAGCTGGAATGAATGCAGAGATCGAAGCGCATGAACAAGTTCGGCGTTCATCAGTAGAATGTCAATATGCAGAGCCTCAAGGTCTAAGAAGGCTTGATGATGAAGGACCAACTATAGATGAAGAACTTATGGGCGACACTGAATTTACATCACTGGCTCTAGAACGTCTTGTGGATGAAGGTTATATAACCGGAGAACAGAAGAAATATATAGCTACGTGGTGTAGTAAGCGCCGTGAACATACTGCTGACTTTGATCTTGTGTGGACTGATACTTTGCGTGTGTTAAGTGCGTATGTGCATGAACGTTCATCTTCAACTCGGCTTTCAACAGATGACGTCAAATTATATAAAACAATTAGTATGTTACATCAAAAGTACGATACCACAGAGTGTGCTAAATGTCAACATTG16 吉林农业大学硕士学位论文第一章蜜蜂残翼病毒的分离及鉴定GTATGCTCCGTTGACTGATATTTATGTTGATGACAAGAAATTGTTTTGGTGTCAGAAAGAGACAAAGACACTGATTGATGTCCGAAAATTGTCGA1.4讨论DWV可侵染各发育阶段的蜜蜂，在蛹期危害不明显，羽化后出现翅膀残缺并迅速死亡；成年蜜蜂发病后翅膀畸形、腹部萎缩和褪色。呈隐性感染的蜜蜂虽然无明显临床症状但其寿命也会缩短。临床发现在瓦螨爆发的蜂群中DWV的滴度最高，而在无瓦螨或少量瓦螨存在的蜂群中DWV的滴度较低，因此DWV与传播媒介瓦螨间密切的关系备受关注。近年来的研究表明DWV是引发“蜂群崩溃失调症”（Colonycollapsedisorder,CCD）的主要病毒之一，DWV在全球范围的流行已成为蜜蜂蜂群非正常消失的一个重要原因。在样品采集的过程中，虽然蜂箱外散落很多失去飞行能力的蜜蜂，但有些蜜蜂的翅膀完好，能够爬行且翅膀高速震颤，区别于蜜蜂残翼病的临床发病症状。同时，瓦螨的发现更能引起我们对出现翅膀残缺蜜蜂的怀疑，大量报道表明，蜜蜂残翼病的发生和瓦螨的活动密切相关，瓦螨是蜜蜂残翼病毒传播的重要媒介，蜜蜂残翼病毒能够在瓦螨体内快速增殖，瓦螨通过寄生在成蜂体表及在蜂巢中产卵将病毒传播给蜂群，这就导致当蜂场中瓦螨大量爆发的时候，蜜蜂残翼病也随之爆发，出现大量的蜂蛹死亡及成蜂翅膀残缺、腹部萎缩和褪色，最终死亡。因此疑似感染蜜蜂残翼病毒的病料的获得对我们的病毒鉴定工作有很大的帮助。另外，由于蜜蜂病毒没有相应的传代或原代细胞进行培养，因此本试验通过易感宿主（健康的蜜蜂幼虫）对DWV进行分离培养，由于DWV的隐性传播特性，因此，在初步的分离培养过程中未发现典型的临床症状，但通过透射电子显微镜的观察，发现了疑似DWV的粒子，又根据Genbank公布的蜜蜂残翼病毒全基因组序列，选择保守区域设计了一对特异性扩增引物，对分离培养后的蜂料提取总RNA，并以此为模板进行RT-PCR鉴定，结果成功扩增出目的片段，初步判断分离到了DWV，通过GenBank上的Blast程序进行比对，发现与GenBank上公布的美国株蜜蜂残翼病毒序列高度同源，同源性为96%。进一步证明了本研究成功分离到了一株蜜蜂残翼病毒。1.5小结1.5.1本试验通过RT-PCR方法对疑似病料进行检测，成功扩增出了目的片段，片段大小为711bp。1.5.2经过克隆测序，并利用DNAstar软件进行比对，表明该核苷酸序列与Genbank上公布的DWV同源性在93%-96%之间，证明了该病料感染了DWV。17 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用为能够更加有效快速的检测蜜蜂残翼病毒，本试验依据TaqMan荧光标记探针技术原理，选取蜜蜂残翼病毒的保守序列，设计了一对特异性引物和一条探针，建立了一种快速检测蜜蜂残翼病毒的荧光PCR方法。该方法能够特异性的检测蜜蜂残翼病毒，与蜜蜂急性麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、蜜蜂囊转幼虫病毒和黑蜂王台病毒之间均无交叉反应。能够检测1.0×102拷贝/µL的阳性质粒，检测灵敏度极高。通过稳定性和重复性试验可知，变异系数为1.6%，证明该方法的稳定性和重复性较高。本试验方法快速、灵敏、特异、充分性好的优点适用于蜜蜂及其产品中的蜜蜂残翼病毒的快速检疫。2.1材料2.1.1病料蜜蜂囊状幼虫病病料、蜜蜂急性麻痹病病料、蜜蜂慢性麻痹病病料、蜜蜂残翼病病料、黑蜂王台病病料来自吉林省和辽宁省不同地区40个蜂场。蜜蜂、花粉颗粒、蜂胶和蜂王浆等蜂产品购自长春市某蜂产品专卖店。2.1.2仪器和试剂高速冷冻离心机（SIGMA3K30，德国西格马公司），PCR扩增仪（BiometraTgradient-96，德国Biometra公司），荧光定量PCR扩增仪（ABISequenceDetectionsystem7000）。RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、TaqHSDNA聚合酶、dNTP、pMD18-T、大肠杆菌DH5α、凝胶回收试剂盒等购自大连TaKaRa宝生物工程有限公司。2.2方法2.2.1引物设计与合成根据GenBank网站公布的蜜蜂残翼病毒全基因组核苷酸序列（GenBankNC004830和AY292384），用Primerexpress2.0软件设计出上游引物：5’-GCCGACAATTTCAGTACCAAGAG-3’和下游引物：5’-ACCATGACCAGAAGGCCAAAC-3’，探针：5’-FAM-ACGCCAAGGTTGAGTTCCTACAGCAGC-3’。探针的荧光标记选择FAM作为报告发光基团，TAMRA为淬灭基团，上述引物和探针由大连TaKaRa宝生物工程有限公司合成。2.2.2病毒RNA的提取18 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用病毒RNA在QIAampViralRNAMiniKit在Qiagen核酸提取工作站中提取RNA，具体操作按照第一章说明书进行。2.2.3标准阳性克隆质粒的制备2.2.3.1RT-PCR扩增首先使用PrimeScriptⅡ1stStrandcDNASynthasisKit（TaKaRa）试剂盒合成cDNA，操作按第一章说明书进行。合成后以cDNA为模板进行PCR反应，反应条件为：首先65℃反应10min，42℃反应90min，最后99℃反应5min，完成反转录过程，然后开始PCR扩增，条件为94℃变性2min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸40s，共计35个循环，最后72℃延伸10min，结束后置于4℃保存。PCR仪为BiometraTgradient-96（德国Biometra公司）。扩增产物取5µL经1%琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像系统（KodakEDAS290，美国柯达公司）成像。2.2.3.2目的基因的纯化回收用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0试剂盒分别对扩增出的目的片段进行胶回收纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。同第一章。2.2.3.3目的基因连接按照说明书上的操作步骤，对目的片段进行连接反应。具体条件及反应体系参照第一章。2.2.3.4连接产物的转化及阳性克隆的筛选参照第一章操作步骤对连接产物进行转化及克隆。2.2.3.5重组质粒的提取用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0进行质粒提取，具体操作步骤参照第一章。2.2.4实时荧光PCR检测体系的建立和优化为获得最低的CT值和较高的荧光强度增加值(ΔRn)，以质粒pMD-dwv作为检测模板，进行PCR反应体系及反应条件优化，以获得最佳的引物和探针浓度。反应体系：上下游引物和标记探针各1µL，1µL10×缓冲液2.5µL，1µLTaqHSDNA聚合酶2U，µLdNTP2，3µLcDNA，以RNAfree水补足25µL。在ABI7000型荧光定量扩增仪上进行扩增。反应条件：94℃5min，93℃40s，55℃40s，72℃40s，共40个循环。选用0.4μmol/L,0.6μmol/L的探针终浓度和0.4μmol/L,0.6μmol/L,0.8μmol/L,1.0μmol/L的引物终浓度，采用矩阵法19 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用优化出最佳的引物和探针浓度。2.2.5敏感性、特异性试验将阳性质粒pMD-dwv进行10倍系列梯度稀释，通过检测找出荧光定量PCR所能检出的最低模板拷贝数。分别以常规方法提取的各病原核酸（蜜蜂急性麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、蜜蜂残翼病毒、黑蜂王台病毒）为模板进行荧光定量PCR检测，验证本检测方法的特异性，2.2.6重复性和稳定性试验为了验证本方法的重复性和稳定性，选用1.0×105拷贝/µL、1.0×106拷贝/µL、1.0×107拷贝/µL3个浓度的pMD-dwv质粒进行试验。2.2.7蜂产品检测结果依据本试验所建立的荧光PCR方法，将匀浆后阳性病料以不同稀释倍数分别添加到蜜蜂、蜂王浆、蜂胶和花粉颗粒中作为模拟样品进行检测。2.3结果2.3.1荧光PCR反应条件优化结果通过对引物、探针比例的矩阵优化，可知当用55℃退火，探针终浓度为0.6μmol/L，上下游引物终浓度均为0.8μmol/L时，CT值最小且ΔRn最大，扩增曲线明显，具有良好的扩增效果。结果如图2.1。Cyclenumber图2.1引物和探针的不同配比终浓度时的扩增曲线1:引物浓度0.8μmol/L,探针浓度0.6μmol/L;2:引物浓度1.0μmol/L,探针浓度0.6μmol/L;3:引物浓度1.0μmol/L,探针浓度0.4μmol/L;4:引物浓度0.8μmol/L,探针浓度0.4μmol/L;5:引物浓度0.6μmol/L,探针浓度0.6μmol/L;6:引物浓度0.6μmol/L,探针浓度0.4μmol/L;7:引物浓度0.4μmol/L,探针浓度0.6μmol/L8:引物浓度0.4μmol/L,探针浓度0.4μmol/L.20 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用Fig2.1Amplificationcureofdifferentmixingconcentrationofprimerandprobe1:Primerconcentration0.8μmol/L,Probeconcentration0.6μmol/L;2:Primerconcentration1.0μmol/L,Probeconcentration0.6μmol/L;3:Primerconcentration1.0μmol/L,Probeconcentration0.4μmol/L;4:Primerconcentration0.8μmol/L,Probeconcentration0.4μmol/L;5:Primerconcentration0.6μmol/L,Probeconcentration0.6μmol/L;6:Primerconcentration0.6μmol/L,Probeconcentration0.4μmol/L;7:Primerconcentration0.4μmol/L,Probeconcentration0.6μmol/L;8:Primerconcentration0.4μmol/L,Probeconcentration:0.4μmol/L.2.3.2特异性试验结果用优化的反应体系和反应条件进行荧光实时PCR检测，结果表明所建立的方法可以很好地扩增蜜蜂残翼病毒，而对提取的各病原体（蜜蜂囊状幼虫病毒、蜜蜂急性麻痹病毒、蜜蜂慢性麻痹病毒、黑蜂王台病毒）的核酸的检测结果为阴性，如图2.2所示，因此，可以证明所建立的荧光定量PCR方法的特异性较高。Cyclenumber图2.2特异性试验结果1:蜜蜂残翼病毒2:蜜蜂急性麻痹病毒3:蜜蜂慢性麻痹病毒4:蜜蜂囊状幼虫病毒5:黑蜂王台病毒Fig2.2Thecurveofspecificitytest1:Deformedwingvirus;2:Acutebeeparalysisvirus;3:Chronicbeeparalysisvirus;4:Sacbroodvirus;5:Blackqueencellvirus.2.3.3敏感性试验结果将标准阳性克隆质粒pMD-dwv进行10倍系列稀释后，用优化好的反应体系和反应条件进行荧光PCR检测，结果显示所建立的荧光PCR方法能检出的最低拷贝数为1.0×102拷贝/µL，如图2.3所示。21 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用Cyclenumber图2.3荧光PCR敏感性试验结果1:1.0×108拷贝/µL;2:1.0×1010拷贝/µL;3:1.0×109拷贝/µL;4:1.0×107拷贝/µL;5:1.0×104拷贝/µL;6:1.0×106拷贝/µL;7:1.0×105拷贝/µL;8:1.0×103拷贝/µL;9:1.0×102拷贝/µL;10:1.0×101拷贝/µL;11:1.0×100拷贝/µLFig2.3Thecurveofsensibilitytest1:1.0×108copies/µL;2:1.0×1010copies/µL;3:1.0×109copies/µL;4:1.0×107copies/µL;5:1.0×104copies/µL;6:1.0×106copies/µL;7:1.0×105copies/µL;8:1.0×103copies/µL;9:1.0×102copies/µL;10:1.0×101copies/µL;11:1.0×100copies/µL.2.3.4重复性和稳定性试验结果选取1.0×105拷贝/µL、1.0×106拷贝/µL、1.0×107拷贝/µL3个浓度的pMD-dwv质粒，进行荧光PCR检测，每个浓度的质粒重复3次试验，结果显示本方法的变异系数小于1.6%，说明该方法具有较好的重复性和稳定性，结果见表2-1。表2-1不同浓度梯度时CT值结果Tab.2-1CTvalueindifferentconcentration浓度Concentration(拷贝/µLcopies/µL)1.0×1051.0×1061.0×10733.2630.1626.48CT值33.4030.4725.73CTvalue34.4430.3826.32变异系数(%)0.51.11.6CVvalue(%)2.3.5蜂产品检测结果应用本试验所建立的荧光PCR检测方法对阳性蜜蜂残翼病样品检测，同时，将匀浆后的阳性患病幼虫虫体加入到蜜蜂、蜂王浆、蜂胶和花粉颗粒中，进行模拟样品检测，结果显示均能检出阳性，说明本方法能够检测蜜蜂样品及蜜蜂相关制品中蜜蜂残翼病毒，结果如图2.4所示。22 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用Cyclenumber图2.4样品检测结果1,3,6,13:蜜蜂样品;2,7,11,14:花粉样品;5,8,10,15:蜂胶样品;4,9,12:蜂王浆样品;16:空白对照Fig2.4Samplediagnosticresults1,3,6,13:honeybeesamples;2,7,11,14:pollensamples;5,8,10,15:propolissamples;4,9,12:royaljellysamples;16:controlgroup.2.4讨论蜜蜂是世界上最大的一类授粉昆虫，全世界1/3的食物产量受益于蜜蜂的授粉。然而，蜜蜂疾病一直影响着蜂产品的产量和质量，制约着养蜂业的大力发展。其中，蜜蜂病毒病被认为是导致蜂群消失的重要原因[50-52]。自从首个蜜蜂病毒（蜜蜂囊状幼虫病，Sacbroodvirus,简称SBV）于1913年被报道后，目前已经有20种蜜蜂病毒被发现[53-55]。蜜蜂残翼病毒可侵染各发育阶段的蜜蜂，在蛹期危害不明显，羽化后出现翅膀残缺并迅速死亡；成年蜜蜂发病后翅膀畸形、腹部萎缩和褪色。呈隐性感染的蜜蜂虽然无明显临床症状但其寿命也会缩短[56-59]。在众多疾病中蜜蜂残翼病毒正成为全球范围的蜜蜂蜂群非正常消失的一个重要原因。DWV能够感染所有发育阶段的蜜蜂，包括卵、幼虫、蛹和成蜂[60]。在自然条件下，大多数病毒通常呈隐性感染而没有明显的症状出现。另外，蜜蜂群体往往能同时感染多种病毒，这就给诊断带来了挑战。最初的实验室检测方法就是基于蜜蜂病毒形态的显微镜检测方法，大多数蜜蜂病毒都是30nm左右的二十面体颗粒，这种检测方法虽然能够判断病毒的形态、大小及感染部位，但相似的外形致使这种方法不能进一步的确定病毒的种类。传统的诊断方法包括血清学方法，如乌赫特朗尼氏凝胶双向扩散试验、间接荧光抗体实验或酶联免疫吸附测定实验，由于特异性较低不能区分不同病毒，因此诊断效果不理想。近几年，分子生物学方法由于其高特异性和敏感性强而被大量应用，如定量逆转录PCR（quantitativereversetranscriptionPCR,简称qPCR）能够精准的对样品中RNA病毒浓度进行定量，多重PCR（MultiplexPCR）能够在一个反应体系中同时检测多种病毒检测方法被大量研究和应用，因此，分子生物学技术为蜜蜂病毒学的研究提供了有力的技术保障。23 吉林农业大学硕士学位论文第二章基于TaqMan探针的蜜蜂残翼病毒荧光PCR检测方法的建立和应用目前，蜜蜂病毒处于全球范围内的流行，且蜜蜂病毒种类繁多，现已有20种蜜蜂病毒被报道，蜜蜂病毒的多样性致使蜜蜂病毒病成为危害蜜蜂种群的重要原因，因此，非常有必要建立一种高效的检测方法，对蜜蜂病毒能够精确的定量定性检测，只有这样才能用有效的对蜜蜂病毒病进行防治。通过对该方法的特异性、敏感性、稳定性等指标的试验表明本研究成功建立DWV的荧光PCR检测方法。本方法对蜜蜂急性麻痹病毒、黑蜂王台病毒、蜜蜂囊状幼虫病毒、的检测结果呈阴性且无交叉反应。与常规的PCR方法相比，本方法大大提高了检测效率，同时，该方法既适用于感染蜜蜂残翼病毒的蜂样检测，也适用于蜜蜂制品中的蜜蜂残翼病毒检测，扩大了检测范围。本方法检测试剂仅需2h，能够在1个工作日内完成包括样品处理的整个检测过程，提高了临床诊断速度。利用本研究建立的荧光PCR快速检测方法对模拟样品的检测结果显示，该方法同样适用于蜂胶、花粉、蜂王浆等蜂制品中的蜜蜂残翼病检测，为相关检验检疫部门提供了快速检测的依据，同时为养蜂业提供了快速检测蜜蜂残翼病的方法，有利于临床上的对症治疗，避免了盲目治疗给养蜂业带来的损失。2.5小结2.5.1本试验成功建立了DWV的荧光PCR检测方法。2.5.2经过试验表明，该方法能够特异性检测蜜蜂残翼病毒，且敏感性较高，具有良好的重复性和稳定性，同时能够快速检测蜜蜂及其制品中的蜜蜂残翼病毒。24 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析在第一章中我们利用RT-PCR检测方法，成功检测到了蜜蜂残翼病毒，经过克隆测序表明该病毒与Genbank上公布的其他DWV基因组具有较高的同源性，但也存在一定的差异，在本实验中，我们对检测到的蜜蜂残翼病毒进行了全基因组序列测定，为进一步了解其基因组结构和阐明该病的致病机理提供有力的根据。本试验依据Genbank公布的蜜蜂残翼病毒的全基因组序列（登录号：NC004830andAY292384）的保守区域设计引物，用PrimerPremier软件设计11对引物，所扩增处的片段连接起来能够将全基因组覆盖。3.1材料3.1.1试剂与仪器100bpDNALadderMarker、TaqHSDNA聚合酶、10×buffer缓冲液、dNTP等购自宝生物工程（大连）有限公司。核酸蛋白分析仪（GeneSpecV,HitachiNaKainstrumentsCo.,Ltd.日本），PCR扩增仪(BiometraTgradient-96,德国Biometra公司)，电泳仪（SACANTPS500A美国），生化恒温培养箱，高速冷冻离心机（SIGMA3K30，德国西格马公司），微量移液器（0.1-1000微升BIOHIT芬兰）、恒温水浴锅，PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。3.2方法3.2.1引物设计依据GenBank上公布的DWV基因序列（登录号：NC004830；AY292384）的全基因组核苷酸序列，用PrimerPremier软件设计11对能够扩增出全长的引物，所扩增出的目的片段之间有相互重叠部分，引物通过上海生工生物科技有限公司合成。引物信息见下表3-1。表3-1DWV-JL1病毒全基因组扩增引物Tab.3-1TheoligoprimerpairsdesignedforoverlappingsequencestoensurethecompletesequenceoftheselectedDWVgenotypes.PrimernameSequence(5’-3’)NucleotideAmplicon(bp)DWV1-FTAGTAGCTCACTACGTATTGATC1-14641464DWV1-RTTAGGTTTCTTAAATATACATTCDWV2-FTGGTCAAGAAGCAGGCGAA1420-2189764DWV2-RTTTGTGAAAATCCATAAACGCT25 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析PrimernameSequence(5’-3’)NucleotideAmplicon(bp)DWV3-FATTTTGCCTCGTGCTTTGTTATCTA1958-2820863DWV3-RGTGCCTTCAATCCTTTGCTCCDWV4-FGGAATTCATGGCGTGGTTCATTAGAATATA2880-3792913DWV4-RCGGGATCCGACTCCTCTCCTTCTGGAATAGCDWV5-FGGAATTCCACGTTTACCCATTTTTACCGAC2252-3112861DWV5-RCGGGATCCACCACCATATTTACGCACCCADWV6-FCAGTATGGGAAGTTATGCGT3694-51101412DWV6-RGAATACCTGGTTACTACCTCTACAADWV7-FTAATATGCTTAATGTGGCTGCTCA5004-70842080DWV7-RCACACAATTCATAAAATACTCGGGCDWV8-FAAATTGTTTTGGTGTCAGAAAGAGA6842-7794953DWV8-RTCAGGAATACGATTAGGCATAGTCADWV9-FGTCTGGTGATATTTCTGGTATTG7666-8658993DWV9-RTAGATAACATCCCGAGTCTTGTADWV10-FCCTGGTTTAGATGGGTTTGATTC8524-9304781DWV10-RCAACATTTTGAGAGAACTCGGATDWV11-FTGAAGCGAGTAATGTGGACC9100-9826726DWV11-RTTTCCCTCAATTCCAATAACC3.2.2病毒总RNA的提取取蜜蜂病料放置于10mL灭菌PE管中，加入5mL无菌PBS充分研磨。将研磨后的匀浆液14000rpm，4℃离心30min，取上清液用QIAampViralRNAMiniKit在Qiagen核酸提取工作站中提取RNA，具体操作按照第一章说明书进行。3.2.3RT-PCR扩增首先使用PrimeScriptⅡ1stStrandcDNASynthasisKit（TaKaRa）试剂盒合成cDNA，操作按第一章说明书进行。合成后以cDNA为模板进行PCR反应，具体反应条件：首先95℃5min，预变性一个循环；然后95℃条件下变性1min，55℃条件下退火1min，72℃条件下延伸1min，共30个循环；最后72℃，10min循环一次。取5µLPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像系统上进行照相。3.2.4目的基因的纯化回收用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0试剂盒分别对11个扩增出的目的片段进行胶回收纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明书。同第一章。3.2.5目的基因的克隆3.2.5.1目的基因连接26 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析按照说明书上的操作步骤，对各片段进行连接反应。具体条件及反应体系参照第一章。3.2.5.2连接产物的转化及阳性克隆的筛选参照第一章操作步骤对各连接产物进行转化及克隆。3.2.6重组质粒的鉴定3.2.6.1质粒的提取用TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0进行质粒提取，具体操作步骤参照第一章。3.2.6.2重组质粒PCR鉴定用各引物分别对相应的重组质粒进行PCR扩增鉴定。反应体系及条件参照第一章。由于不同引物的Tm值及片段大小不同，其退火温度及延伸时间不同。3.2.6.3酶切鉴定反应采用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切鉴定反应，反应体系及条件参照第一章。3.2.7测序及序列分析分别吸取10µL质粒送上海捷瑞生物工程有限公司测序。用DNASTAR和CodonCodeAligner软件对11个片段的核苷酸序列进行编辑处理后，拼接形成一个连续的完整序列。序列在NationalCentreforBiotechnologyInformation（NCBI）的GenBank上用BasicLocalAlignmentSearchTool（BLAST）进行鉴定及比对。3.3结果3.3.1RT-PCR扩增以蜜蜂残翼病毒cDNA为模板，用11对引物进行PCR扩增，经过1g/L的琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的目的基因大小与预期的大小一致。11个片段如下图3.1所示。M12345678910112000bp100075050025010027 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析图3.1蜜蜂残翼病毒基因组分段PCR扩增结果Fig3.1DWVgenomePCRamplificationM为DL2000DNAMarker；1-11分别为DWV1-DWV11的扩增产物MDL2000DNAMarker；DWV1-DWV11PCRamplificationofDWV1-DWV113.3.2重组质粒酶切鉴定结果按照试剂盒操作对所扩增出的PCR产物进行胶回收纯化，并将所纯化的产物连接转化克隆，对所获得的克隆产物进行酶切鉴定。鉴定结果如图3.2。M12345678910112000bp1000750500250100图3.2重组质粒酶切鉴定结果M:DL2000DNAMarker；1-11:DWV1-DWV11的酶切产物Fig3.2TheresultsofdigestionofrecombinantplasmidM:DL2000DNAMarker；1-11:DigestionproductsofDWV1-DWV113.3.3对基因组序列进行拼接应用生物学软件DNAstar7.0对测序后的核苷酸序列进行拼接、整理、组装，最终得到了9826bp的核苷酸序列，命名为DWV-JL1。3.3.4同源性比较应用生物学软件DNAstar7.0对测序后的核苷酸序列与Genbank公布的其它9个蜜蜂残翼病基因组序列比较。结果表明与本试验所得到的DWV核苷酸序列同源性在89%-96%之间，与USA1(AY292384)同源性最高，可达96.6%，与UK3(HM067438)同源性最低，为89.5%，如图3.3。9个已经公布的蜜蜂残翼病毒分别为：UK1(GU109335)、USA1(AY292384)、Korea1（JX878304）、Korea2（JX878305）、Chile(JQ413340）、UK2(HM067437)、UK3(HM067438)、USA2(KJ434447)、USA3(NC-004830)。28 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析图3.3DWV核苷酸同源性比较Fig3.3ThecomparimentofhomologyofDWVinnucleotide3.3.5DWV系统进化树的构建及分析用Mega5[61]分析软件中的ClustalW程序进行多重序列对齐分析，使用邻接法（Neighbor-joiningmethod）的Kimura's2-parametermodel方法重复1000次对DWV-JL1株与GenBank上公布的9株DWV毒株UK1(GU109335)、USA1(AY292384)、Korea1（JX878304）、Korea2（JX878305）、Chile(JQ413340）、UK2(HM067437)、UK3(HM067438)、USA2(KJ434447)及USA3(NC-004830)构建进化树，如图3.4。并以黑蜂王台病毒（Blackqueencellvirus，BQCV）（AF183905）全基因组序列作为外群。图3.4DWV全基因组序列进化树分析结果Fig3.4DWVcompletegenomesequencephylogenetictreeanalysisresults通过NCBI上的BLAST功能对比结果表明：中国DWV-JL1株与USA1(AY292384)的同源性最高可达97%，与瓦螨分离(HM067437)株的同源性较低为90%。经过全基因组序列进化树分析结果表明，选取作为外群比对的BQCV基因型区别于DWV的全基因组序列。通过系统进化树可知，DWV基因型被分成两个大分枝，其中第一个分枝中包括中国29 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析DWV-JL1、Korea1（JX878304）和Korea2（JX878305）三个DWV毒株，另外一个分枝包括Chile(JQ413340）、USA3(NC-004830)、USA1(AY292384)和UK1(GU109335)四个毒株。中国DWV-JL1株与Korea1（JX878304）和Korea2（JX878305）起源相同，亲缘关系较近。3.3.6核苷酸序列分析获得DWV-JL1的全基因组核苷酸序列长度为9826bp，其中A占29.16%,G占22.73%，C占15.87%，T占32.22%，腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸丰富（Ａ＋Ｔ＝61.32%）病毒基因组结构5’端非编码区长1078bp，包含一个7125bp长的开放阅读框，翻译一个含2375个氨基酸残基的多聚蛋白体；3’端非编码区约长1624bp。DWV-JL1基因组结构包括两个大的开放阅读框（Openreadingframe，ORF），ORF1长6582bp，编码2193个氨基酸的多聚蛋白，ORF2长1434bp，编码477个氨基酸的多聚蛋白，ORF1与ORE2之间间隔122bp核苷酸，5’端有一个长的非翻译区域（5’UTR），3’端有一个短的、高度保守的非翻译区域(3’UTR)，3’端以多聚A尾巴结尾。5’UTR和3’UTR对基因组翻译和复制调节非常重要。多聚蛋白的氨基末端从前导肽（Leaderpolypeptide，LP）开始，LP后面为结构蛋白VP3、假设的VP4、VP1和VP2。多聚蛋白的羧基端含有非结构蛋白、解旋酶的保守基序、假设基因组连接蛋白（Putativegenome-linkedviralprotein，VPg）、3C-蛋白酶和依赖于RNA的RNA聚合酶。基因组结果示意图如图3.5。图3.5DWV基因组示意图Fig3.5schematicdiagramofthe3.3.7氨基酸序列分析通过氨基酸序列比对，结果显示DWV-JL株基因组的结构蛋白位于5’端，非结构蛋白位于3’端，A、B、C解旋酶结构域位于1353-1489，其中A区（GxxGxGKS）和B区（Qx5DD）氨基酸序列高度保守，这种现象同样发生在双顺反子病毒科（ABPV,AF150629；BQCV,AF183905；DCV,AF014388；KBV,AY275710；PSIV,AB006531；RhPV,AF022937）和传染性软腐病病毒科（VDV1,AY251269）。3.3.8解旋酶区域解旋酶是一类解开氢键的酶，而不是一种酶，由水解ATP供给能量来解开DNA的酶。30 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。一般在DNA或RNA复制过程中起到催化双链DNA或RNA解旋的作用。在USA1(AY292384)上位于6073-6690nt（618nt）这段区域是编码解旋酶区域，通过DNASTAR软件分析显示，与中国DWV-JL1株上6012-6629nt（618nt）这段连续的序列同源性较高，达96%。在中国DWV-JL1株上截取该段序列，通过GenBank上的BLAST功能进行对比，发现共有22株对比结果，同源性为（86%-94%）。3.4讨论3.4.1病毒全基因组序列的克隆病毒基因组测定的方法有鸟枪法、分段克隆法和长距离RT-PCR（LongRT-PCR）法，其中鸟枪法被认为是工作量最繁重、具有较高的拼接难度而常被用于未知的或较大的病毒基因组测序。长距离RT-PCR法由于技术要求高，且经常容易出现错配现象而应用的较少。由于本试验中明确目的病毒的种属来源，能够设计出相应的引物，因此采用了分段克隆法。本试验通过分段克隆方法，依据Genbank上公布的蜜蜂残翼病毒基因组序列，在引物步移的方法指导性，设计了能够覆盖基因组全长的引物，通过对基因组的分段克隆测序，我们成功的克隆出了9826bp长的病毒全基因组序列。本试验通过Mega5和DNAstar分析软件对所测得的序列与UK1(GU109335)、USA1(AY292384)、Korea1（JX878304）、Korea2（JX878305）、Chile(JQ413340）、UK2(HM067437)、UK3(HM067438)、USA2(KJ434447)和USA3(NC-004830)Geneban公布的DWV株进行比对分析，结果表明我们分离到的毒株与USA1(AY292384)同源性最高，可达96.6%。建立的系统进化树表明本试验所测得的毒株与Korea1（JX878304）和Korea2（JX878305）亲缘关系较近。本研究所获得的蜜蜂残翼病毒株是利用RT-PCR方法对保守序列进行扩增，通过进一步的克隆测序表明，与已经公布的蜜蜂残翼病毒的核苷酸序列同源性较高，可以初步认定所获得毒株的正确性，对全基因组的分段克隆测序结果表明，所获得的全基因组核苷酸序列同样与已公布的蜜蜂残翼病毒全基因组高度相似，进一步证明了所获毒株的可靠性。由于蜜蜂病毒的细胞培养体系的建立仍不完善，一定程度上阻碍着对蜜蜂病毒学的研究，因此，有必要尽快建立起成熟的蜜蜂细胞培养体系，这将有利于蜜蜂病毒的增殖，为试验提供充足的病原，同时，为研究蜜蜂病毒的致病机制提供依据。3.5小结3.5.1本试验通过分段克隆方法经对全基因组各片段进行PCR扩增、测序、序列拼接和分析最终成功克隆出长为9826bp，编码2375个氨基酸的蜜蜂残翼病毒。3.5.2经过所测得到的毒株与Genbank上公布的9个蜜蜂残翼病毒株比对分析，结果表明31 吉林农业大学硕士学位论文第三章蜜蜂残翼病毒全基因组分段克隆及序列分析与USA1(AY292384)同源性可达96%。系统进化树结果表明与Korea1（JX878304）和Korea2（JX878305）亲缘关系较近。经过氨基酸序列分析，结果表明结构蛋白区域位于氨基端，非结构蛋白区域位于羧基端。32 吉林农业大学硕士学位论文结论结论1.通过对蜜蜂残翼病毒分离鉴定后表明，成功分离到一株蜜蜂残翼病毒株。2.运用TaqMan荧光标记探针技术原理，经过对试验特异性、敏感性、重复性及稳定性等指标的评估，成功建立了TaqMan荧光RT-PCR检测蜜蜂病料及蜜蜂相关制品中蜜蜂残翼病毒的方法。3.基于全基因组序列分段克隆方法，在引物步移法的指引下，采用RT-PCR方法对全基因组进行分段克隆测序，通过生物学分析软件进行拼接和组装，最终获得全长为9826bp的全基因组序列，推导编码2375个氨基酸。33 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吉林农业大学硕士学位论文作者简介作者简介姓名郑言性别男民族汉入籍贯吉林四平政治面貌团员2012.09学时授予申请学位类别农学硕士论文答辩日期2015年5月30日农学硕士学位就业信息联系方式（个人/就业单位就业单位性质就业单位地址办公）吉林省产品质量监督检事业单位验院学习（工作）经历2008.09-2012.07吉林农业科技学院2012.09-2015.06吉林农业大学攻读学位期间发表与学位论文的科研成果信息刊物名称（级署名发表情况题目署名单位别）次序(刊出时间/录用)蜜蜂残翼病研究进展动物医学进展1吉林农业大学2015年3月蜜蜂残翼病毒PCR检测及动物医学进展1吉林农业大学2015年5月5’UTR基因序列分型分析发表学术论文TaqMan探针实时荧光黑龙江畜牧兽PCR方法检测黑蜂王台病4吉林农业大学拟录用医毒的方法建立和应用黑蜂王台病毒基因组结构中国预防兽医9吉林农业大学拟录用及其编码蛋白研究进展学报基于核酸适配体技术在食品安全分析中对重金属离食品科学4吉林农业大学拟录用子含量检测的研究进展38 吉林农业大学硕士学位论文致谢致谢在本论文完成之际，我的硕士学习生涯即将宣告结束。在此我要衷心的感谢我的导师王振国研究员，王老师无论是在学术上还是在生活中都给了我很大的帮助，感谢王老师在毕业论文及课题研究上给以我的指导，使我能够顺利完成。三年时间和王老师学到的知识将是我一生最大的财富。导师严谨治学的态度、勇于创新的精神和乐观的生活态度更是我以后学习和生活中的标杆。由衷的感谢吉林出入境检验检疫局技术中心的宋战昀老师和甘肃农业大学的李敏思师姐在课题设计、试验过程及生活中给予的热心关怀、指导和帮助。感谢吉林农业大学动物科学技术学院的领导和各位老师的谆谆教诲。特别感谢吉林出入境检验检疫局技术中心的王伟利老师、魏春艳老师、孟庆峰老师、刘金华老师在学习和生活中给予我的帮助。在此我还要非常感谢我的家人，他们的鼓励与支持是我能够完成学业的强大的精神动力！39