马氏珠母贝外套膜不同区域差异矿化基因的克隆及功能研究

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1、、-1—----^_-V.*,r^V',.分类号tP735密级：公开.■UDC：639.4学号：21112011167糸海洋太考硕士学位论文、、、■*、、••5»-*''马氏珠母贝外套膜不同区域差异矿化基因的克隆及功能研究\刘晓丽'-''•-*"、'’、、，.Vw),^Z-•■■.*.*、、.、.，〇、.•■、■.,s^.、..••*'.''-W、••...、v；l"、.、"指导教师：杜晓东教授串请学位类别：理学硕士专业名称：海洋生物学"‘二方向：海洋经济动物发育生物学研究学院名称：水产学院中国•

2、湛江2015年6月✓摩像铪弍答辨奏炅会祖成主席委员导师时间：广东海洋大学学位论文原创性声明本人郑ffi声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品.对本文的研究做出里要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：女2〇

3、$年i月；1日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机

4、构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文.本学位论文属于1、保密□.在______年解密后适用本授权书。2、不保密<(请在以上相应方框内打“食)作者签名：士加5年S月34曰马氏珠母贝外套膜不同区域差异矿化基因的克隆及功能研究摘要本文以马氏珠母贝全基因组测序和外套膜转录组数据库为基础，从外套膜的边缘膜（MO）区和中央膜（MC）区分别筛选出差异高表达的特异性功能基因，利

5、用RACE技术克隆其序列全长，同时对候选基因进行氨基酸序列分析和结构特征性分析来确定是否具有矿化相关功能。然后通过荧光定量分析基因表达的组织差异，RNAi诱导基因沉默以探索其在贝壳矿化中的作用。结果如下：1.筛选MC特异性表达基因：MC的主要功能是形成贝壳珍珠层。从马氏珠母贝外套膜转录组文库中，筛选出MC显著高表达的基因共有2298个，MC特异性表达的基因共228个，获得NR注释的基因197个。其中包括酪氨酸酶、钙结合蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂TIMP、硫脂蛋白、MRNP等，还包括一些预测蛋白，如pre

6、stin-like、酪氨酸蛋白激酶、溶质载体家族等。本研究对其中MC特异性表达的基因进行序列特征性分析，同时由注释信息得到并分析基因的功能结构域，最终选出4个基因进行深入研究，它们是几丁质结合蛋白、类-α-2巨球蛋白、MRNP(methionine-richnacreprotein)和未注释基因5915。2.采用RACE技术获得几丁质结合蛋白基因的cDNA序列，其全长为2126bp，5'UTR为143bp，3'UTR为492bp，开放阅读框为1491bp，编码496个氨基酸。由注释信息及SMART预测出

7、其具有Chitin-bind-3结构域，说明其能够结合几丁质。荧光定量PCR结果显示在马氏珠母贝的珍珠囊、外套膜的套膜区（MP）和MC中显著高表达（p<0.05）。RNAi结果显示，注射几丁质结合蛋白-dsRNA能够显著地抑制外套膜中几丁质结合蛋白mRNA的表达；同时导致贝壳内表面的珍珠层结晶形态不完整，片层状板块细碎，晶体排列间隙大，局部有洞穴存在的现象，而正常的珍珠层晶体则是规则排列，各板块晶体排列紧密且界限清晰，因此推断几丁质和几丁质结合蛋白是贝壳珍珠层有机质不可或缺的组分。3.类-α-2巨球蛋白

8、（α2M-like）基因cDNA序列全长为3127bp，5'UTR为390bp，3'UTR为322bp，开放阅读框为2415bp，编码804个氨基酸。SMART预测其C端含有典型的α-2巨球蛋白较保守的三个结构区，即内部硫酯区、受体结合区和诱饵区，以及98-GCGEQNM-304硫酯键结构，故名。但是与典型的α-2巨球蛋白相比，α2M-likeN端部分缺失，该现象也出现在太平洋牡蛎贝壳蛋白中，表明α2M-like基因可能在双壳类动物中具有不同的功能并可能与矿化作用相关。荧光定量结果显示α2M-like基

9、因在外套膜中显著高表达于其他组织（p<0.05）。在RANi实验中，与对照组相比，I注射α2M-like-dsRNA能够显著地抑制外套膜MC和MO的α2M-likemRNA表达水平，而在MP的表达量并没有明显下降。扫描电镜结果显示：α2M-like基因沉默，导致贝壳珍珠层和棱柱层超微结构发生变化，结晶体均形状不规则，排列疏松，甚至有溶解消失的情况出现。因此，可初步确认α2M-like参与了贝壳棱柱层和珍珠层的生物矿化过程。4.克隆获得马氏珠