基于rna-seq技术分析小麦矮缩病毒侵染后小麦的基因表达差异

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密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文基于RNA-Seq技术分析小麦矮缩病毒侵染后小麦的基因表达差异AnalysisofGeneExpressionChangesinWheatLeavesinResponsetoWDVInfectionUsingRNA-Seq硕士研究生：王亮指导教师：刘艳副研宄员申清学位类别：农学硕士专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学培养单位：植物保护研究所研究生院2015年5月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：1I时间：2〇冰年太月>7曰关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名时间：>丨夕年女月曰 中国农业科学院硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目基于RNA-Seq技术分析小麦矮缩病毒侵染后小麦的基因表达差异论文作者王亮专业植物病理学|研究方向分子植物病理学指导教师刘艳培养单位（研究所）植物保护研究所硕（博）姓名职称单位专业签名导师评阅人答辩主席硕导口盲评博导口硕导口博导口研究员硕导口中国科学院微生物研方荣祥微生物学院士博导V究所硕导口生物化学与李毅教授北京大学博导V分子生物学硕导口中国农业科学院植物周雪平教授植物病理学博导V保护研究所答硕导口范在丰教授中国农业大学植物病理学博导V辩硕导口韩成贵教授中国农业大学植物病理学博导V委硕导口博导口员硕导口博导口硕导口会议记录（秘书）李莉论文答辩时间地点2015年5月17日，中国农业科学院植物保护研究所 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationAnalysisofGeneExpressionChangesinWheatLeavesinResponsetoWDVInfectionUsingRNA-SeqM.S.Candidate：WangLiangSupervisor：AssociateProf.LiuYanMajor：PlantPathologySpecialty:MolecularPlantPathologyMay2015 摘要由小麦矮缩病毒（Wheatdwarfvirus,WDV）引起、介体异沙叶蝉(PsammotettixstriatusL.)传播的小麦矮缩病是麦类作物生产上一类重要的双生病毒病害，其危害日益严重，然而目前关于该病毒致病的分子机理尚无深入研究。本研究利用RNA-Seq测序技术对WDV侵染下小麦在RNA水平上的基因表达变化情况进行分析，筛选与病毒症状诱导以及植物抗病相关的差异表达基因，利用qPCR方法对选择的差异表达基因进行验证，还对WDV诱导的寄主miRNA表达差异做以分析。通过在转录组水平上对WDV与小麦互作的动态特性进行分析，阐明了小麦矮缩病症状的形成和发展是一个复杂的过程，为进一步解释病毒致病的分子机制奠定基础。首先，利用RNA-Seq技术对WDV侵染下小麦转录组表达情况进行深度测序，经数据拼接与聚类分析后共获得了77221条unigenes，与健康对照组比较得到了4324个显著差异表达的基因，GO功能注释结果显示差异表达基因主要涉及的生物学过程有衰老、生物刺激反应、基因沉默、植物激素代谢、光合作用、DNA代谢、植物防卫反应等。筛选出与植物激素代谢、光合作用及植物防卫反应等相关的共23个差异表达基因进行qPCR验证。结果表明：受WDV侵染的小麦植株表现严重矮化和分蘖异常等症状，这可能与赤霉素、生长素、油菜素甾醇等合成或运输相关基因的表达变化以及细胞分裂素代谢失调有关；而光合作用相关酶以及叶绿素代谢中某些基因的差异表达，可能导致叶片褪绿黄化症状的发生。抗氧化途径、基因沉默等途径的相关基因的差异表达反映了植物抵抗病毒侵染所启动的防御反应发生情况。总之，WDV的侵染打破了植物体内各种激素之间或多个代谢途径的动态平衡。同时，利用RNA-Seq高通量测序技术分析了WDV侵染下小麦体内miRNA的差异表达情况。对10个显著差异表达的miRNA进行靶基因预测以及GO功能注释。结果表明，这些受到miRNA调控的靶标基因主要是生长素响应因子、微管蛋白折叠辅因子、钾离子转运子、水解酶、细胞色素P450以及一些植物抗病相关蛋白等。以靶基因预测结果为契合点，对miRNA与mRNA差异分析结果进行了负相关联合分析，结果获得了一些重要的调控信息。例如，受tae-miR5384-3p调控的FACTcomplexsubunitSPT16在转录、复制以及DNA修复方面发挥重要作用；受tae-miR2275-3p调控的三角状五肽重复蛋白（Pentatricopeptiderepeat）与植物叶片内叶绿素含量以及叶绿体发育过程相关；受tae-miR1123调控的橡胶延伸因子（Rubberelongationfactor）与植物防卫反应有关；tae-miR160的靶标基因为高亲和性钾离子转运蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter）；tae-miR9774的靶标基因为参与细胞凋亡及防卫反应的含有NB-ARC结构域的抗病相关蛋白（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein）等等。此外，还利用植物双元表达载体pLH9000构建了WDV中国分离物的侵染性克隆，并成功在小麦上建立侵染，为进一步研究病毒致病性提供了有效的工具。关键词：小麦矮缩病毒，小麦，高通量测序，侵染性克隆，致病性I AbstractWheatdwarfdiseaseisbecominganincreasinglyseveregeminivirusdiseaseontriticeaecropswhichcausedbyWheatdwarfvirus(WDV)andtransmittedbyPsammotettixstriatusL.Theexactpathogenesisofthisdiseasehavenotbeendeeplyexplored.Inthispresentstudy,RNA-Seqwasusedforgeneexpressionanalysisinwheatinresponsetowheatdwarfvirusinfection.DifferentiallyexpressedgenesrelatedtosymptomsandplantdefenseresponsewerevalidatedbyqPCR.Inaddition,differentiallyexpressedmiRNAwereanalyzedpreliminarily.Theseresultsillustratethedynamicnatureofthewheat–WDVinteractionatthetranscriptomelevelandconfirmthatsymptomdevelopmentisacomplexprocessthatcanbethebasistofurtherunderstandpathogenesisofWDV.Firstly,comparativetranscriptomeprofilingofTriticumaestivumL.inresponsetowheatdwarfvirusinfectionwasconductedbyRNA-Seq.Atotalof77221unigeneswereavailableafterTrinityassemblyandclusteranalysis,4324ofwhichweredifferentiallyexpressedifcomparedtothecontrol.Geneontology(GO)annotationrevealedthatalistofcandidategenesinvolvedinaging,responsetobioticstimulus,genesilencing,phytohormonemetabolism,photosynthesis,DNAmetabolicprocessre,regulationofdefenseresponseandsoon.Twenty-threedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithphytohormonemetabolism,photosynthesisandplantdefenseresponsewereselectedandvalidatedbyqPCR.Theresultsindicatedthatmetabolismchangesandtransportsuppressionofauxin,gibberellinsandbrassinosteroidmaycontributetoseveredwarfismintheinfectedwheatplants.Abnormaltilleringmaybeduetothemetabolicdisorderaboutauxinandcytokinin.Furthermore,genesexpressionchangerelatedtophotosyntheticenzymesandchlorophyllmayinducechlorosisofleaves.Inaword,theWDVinfectionbrokethedynamicequilibriumamongsomekindsofphytohormoneormetabolicpathway.Differentiallyexpressedgenesinvolvedinantioxidantorgenesilencingpathwaysrevealedthedefenseresponseagainstvirusinfection.Meanwhile,thedifferentialexpressionoftheknownmaturemiRNAsinthesampleswasdiscoveredbyRNA-Seq.Thedataanalysisofhigh-throughputsequencingshowedthattheexpressionpatternsof10miRNAsinleaveshadbeensignificantlychangedinresponsetoWDVinfection.TheirtargetgeneswerepredictedbypsTargetsoftware.GOanalysisdemonstatedthattheyweremainlyinvolvedinauxinresponsefactor,tubulinfoldingcofactor,potassiumtransporter,hydrolase,cytochromeP450familyproteinandsomediseaseresistanceprotein.ThensignificantinformationwasobtainedaccordingtonegativecorrelationanalysisbetweendifferentiallyexpressedgenesandmiRNAs:tae-miR5384-3ptargetsFACTcomplexsubunitSPT16whichplaysimportantrolesduringDNAtranscription,replicationandrepair;tae-miR2275-3ptargetsPentatricopeptiderepeatwhichisassociatedwiththechlorophyllcontentandchloroplastdevelopment;tae-miR1123targetsRubberelongationfactorwhichisrelatedtoplantdefenseresponse;tae-miR160targetshighaffinitypotassiumtransporter;tae-miR9774targetsNB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceproteininvolvedinapoptosisanddefenseresponse.TheresultsprovidenewinsightsintotheregulatorynetworksofmiRNAsandtheirtargetsinresponsetovirusinfection.II Inaddition,aWDVinfectiouscloneofChinaisolatehadbeensuccessfullyconstructedandusedtoinfectwheat(TriticumaestivumL.).ItprovidedausefultoolforstudyofpathogenesisaboutWDV.Keyword:Wheatdwarfvirus,TriticumaestivumL.,high-throughputsequencing,infectiousclone,pathogenicityIII 目录第一章引言....................................................................................................................11.1小麦矮缩病毒概述.....................................................................................................11.1.1WDV的分类地位及危害.....................................................................................11.1.2WDV的复制及转录调控.....................................................................................21.2植物病毒诱导症状形成的分子机制.........................................................................31.2.1病毒与寄主植物互作诱发症状形成...................................................................31.2.2miRNA等与症状形成的关系..............................................................................51.3高通量测序技术及侵染性克隆在植物与病毒研究中的应用.................................71.3.1高通量测序技术在研究植物与病毒及其互作关系中的应用...........................71.3.2侵染性克隆在病毒研究中的应用.....................................................................101.4本研究的目的及意义...............................................................................................12第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析..........................132.1材料与方法...............................................................................................................132.1.1材料.....................................................................................................................132.1.2方法.....................................................................................................................132.2结果与分析...............................................................................................................152.2.1小麦转录组数据的处理与生物信息学分析.....................................................152.2.2目标基因的选择.................................................................................................242.2.3荧光定量PCR方法对差异表达基因的验证...................................................262.3总结与讨论...............................................................................................................292.3.1WDV诱导寄主矮化症状的原因分析...............................................................302.3.2WDV诱导感病寄主分蘖异常的原因分析.......................................................302.3.3WDV侵染对寄主光合作用的影响...................................................................312.3.4WDV侵染以后寄主防御机制的启动...............................................................31第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析...........................333.1材料与方法...............................................................................................................333.1.1材料.....................................................................................................................333.1.2方法.....................................................................................................................333.2结果与分析...............................................................................................................333.2.1miRNA表达量的计算及差异表达miRNA的筛选.........................................33IV 3.2.2差异表达miRNA的靶基因预测......................................................................343.2.3差异基因与差异miRNA的负相关联合分析..................................................363.2.4miRNA调控靶基因的网络构建........................................................................373.3总结与讨论...............................................................................................................37第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建..................................................394.1材料与方法...............................................................................................................394.1.1材料.....................................................................................................................394.1.2方法.....................................................................................................................394.2结果与分析...............................................................................................................444.2.1侵染性克隆表达载体的构建.............................................................................444.2.2农杆菌针刺法侵染小麦及病毒检测.................................................................484.3总结与讨论...............................................................................................................51第五章全文结论与展望..................................................................................................525.1结论...........................................................................................................................525.2展望...........................................................................................................................53参考文献..............................................................................................................................54附录..................................................................................................................................61致谢..................................................................................................................................64作者简历..............................................................................................................................65V 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称WDVWheatdwarfvirus小麦矮缩病毒CMVCucumbermosaicvirus黄瓜花叶病毒BMVBromemosaicvirus雀麦花叶病毒TMVTobaccomosaicvirus烟草花叶病毒RDVRicedwarfvirus水稻矮缩病毒PVYPotatovirusY马铃薯Y病毒TNVTobacconecrosisvirus烟草坏死病毒SMVSoybeanmosaicvirus大豆花叶病毒RNAiRNAinterferenceRNA干扰siRNASmallinterferingRNA小干扰RNALIRLongIntergenicRegion长基因间隔区RCARollingCircleAmplification滚环扩增SSRSimpleSequenceRepeat简单重复序列CTKCytokinin细胞分裂素IAAIndole-3-aceticacid吲哚乙酸ZR+ZZeatinribosideandzeatin玉米素核苷和玉米素GAGibberellins赤霉素ABAAbscisicacid脱落酸SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶PODPeroxidase过氧化物酶PPOPolyphenoloxidases多酚氧化酶VIGSVirusInducedGeneSilencing病毒诱导的基因沉默核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加RuBisCORibulosebisphosphatecarboxylaseoxygenase氧酶GOGeneOntology基因本体论VI 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1.1小麦矮缩病毒概述1.1.1WDV的分类地位及危害小麦矮缩病毒（Wheatdwarfvirus,WDV）是双生病毒科（Geminiviridae）玉米线条病毒属（Mastrevirus）成员（第I亚组），病毒颗粒呈孪生形态，寄主范围广泛，可以侵染包括小麦、大麦、燕麦在内的多种禾本科植物及杂草。小麦矮缩病毒基因组编码四个蛋白：外壳蛋白（Coatprotein,CP）、运动蛋白(Movementprotein,MP)以及两个复制相关蛋白(Replication-associatedproteins,Rep和RepA）。病毒全基因组中包含有两个非编码区：长基因间隔区（Longintergenicregion,LIR）包含在病毒DNA链的复制起始区以及两条链基因转录的起始区之中，短基因间隔区（Shortintergenicregion,SIR）存在于转录终止区以及互补链的复制起始区。Rep和RepA由病毒互补链编码，两个蛋白N端序列相同，病毒链则编码MP和CP蛋白（Boulton，2002）。1985年，MacDowell等分析了瑞典分离物中WDV的全基因序列，证实序列中存在的四个反向重复序列可能与形成发夹结构有关，通过氨基酸序列的比较，表明WDV与玉米线条病毒（Maizestreakvirus,MSV），番茄金色花叶病毒（Tomatogoldenmosaicvirus,TGMV）以及木薯潜隐病毒（Cassavalatentvirus,CLV）可能有一个共同的原始起源（MacDowell等，1985）。图1.1双生病毒代表成员基因组结构模式图(引自Shepherd等，2009)Fig.1.1Genomeorganizationofrepresentativemembersofthefourgeminivirusgenera目前，由小麦矮缩病毒引起、介体异沙叶蝉(PsammotettixstriatusL.)传播的小麦矮缩病已成为生产上一类重要的病毒病害，可引起植株严重矮化、黄化、条斑及分蘖增多等症状，对小麦产量构成严重威胁。目前该病害危害范围已遍布欧洲大部分地区，甚至已经波及到非洲的突尼斯以及赞比亚等国家。2007年，小麦矮缩病在我国陕西韩城北部地区严重发生，发病面积约为7001 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言公顷，发病田块减产50%-80%，而且该病害在我国有加剧蔓延的趋势（王江飞等，2008）。Kumar等从印度小麦矮缩病毒(WheatdwarfIndiavirus,WDIV)病害复合物中分离出了木尔坦棉花曲叶病毒DNAα卫星分子(CottonleafcurlMultanalphasatellite,CLCuMA)、瓜尔豆卷叶病毒DNAα卫星分子(Guarleafcurlalphasatellite,GLCuA)以及胜红蓟黄化曲叶病毒DNAβ卫星分子(Ageratumyellowleafcurlbetasatellite,AYLCB)，说明玉米线条病毒属病毒存在复杂致病机制，也给病毒病防控带来潜在的挑战和困难（Kumar等，2014）。图1.2小麦矮缩病田间症状(刘艳摄于陕西韩城，2011)Fig.1.2Symptomofwheatdwarfdiseaseinthefield（photographedbyLiuYaninHancheng,ShaanxiProvince,2011）1.1.2WDV的复制及转录调控1.1.2.1WDV的复制玉米线条病毒属成员具有相似的基因组结构，病毒链第一个ORF和互补链第一个ORF之间存在约300nt的长基因间隔区LIR，LIR通常包含位于中部的上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)以及位于两端的双向启动子序列，LIR序列与基因组复制和基因转录密切相关。UAS通常具有一个约30nt的发夹环结构（hairpinloop)，它的茎部（Stem）富含GC碱基，环区（loop）则富含AT，环中保守的TAATATTAC序列与病毒复制起始有关（图1.3）。DNA序列分析表明，位于LIR中TATA盒附近通常存在由3-6个8nt-11nt组成的重复序列，其对病毒的复制十分重要，WDV的复制除了需要LIR的调控序列外，短基因间隔区（SIR）也是复制所必需的。WDV按照双生病毒共有的滚环复制的方式进行病毒基因组的复制（Hanley-Bowdoin等，1999）。复制分为两个阶段：第一步，合成互补链。以病毒链DNA为模板，在病毒和寄主因子(依赖寄主的DNA合成酶系)作用下合成超螺旋共价双链闭环DNA（dsDNA）的中间体，一般认为互补链的合成完全依赖于寄主因子，而且首先需要一段短的ssDNA或者RNA作为引物。第二步，滚环复制的起始。在病毒复制因子（Rep/RepA,REn等）和寄主细胞内复制因子的作用下，以dsDNA复制中间体作为模板合成的正义链从原来母链中游离出来产生单链，合成终止时被Rep蛋白切割并且链接形成环状DNA（Laufs等，1995）。2 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图1.3WDV序列中形成的发夹环结构(来源于http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/ResultsPages/1546332741660582267/Results.html的预测结果)Fig.1.3ThehairpinloopstructureofWDV1.1.2.2WDV的转录调控双生病毒dsDNA复制中间体不仅对滚环复制至关重要，同时还可作为模板进行病毒基因的转录表达。病毒的转录发生在寄主细胞核内，所需要的RNA聚合酶II系统及一些转录因子由寄主细胞提供，病毒基因间隔区中包含双向启动子，该启动子能够通过双向转录方式产生mRNA（Koonin等，1993）。WDV同双生病毒科其他成员一样拥有一套十分复杂的转录过程，病毒转录常常会形成多重重叠的转录产物，以多顺反子为主。不同双生病毒的转录策略也有所不同，双组分双生病毒的转录起始于CR或CR的一侧，单组分双生病毒的转录起始于IR。双生病毒基因组的转录分为早期转录和晚期转录两个阶段，早期转录阶段表达的是复制相关蛋白和转录激活蛋白以及其它一些由互补链编码的蛋白；晚期转录阶段表达病毒链编码的外壳蛋白及核穿梭蛋白，促进病毒DNA转运与装配。1.2植物病毒诱导症状形成的分子机制1.2.1病毒与寄主植物互作诱发症状形成由于病毒与寄主基因产物会发生互作，使得病毒侵染症状的发生成为一个错综复杂的过程。对于RNA病毒而言，早期关于致病相关基因的研究主要是通过多组分体病毒的假重组实验来完成，将不同病毒的不同RNA组分混合接种，以此来研究各基因的功能。然而对于单组份体的DNA病毒来讲，此种方法显然是行不通的，只能通过构建一系列突变体来实现。1.2.1.1植物病毒致病因子目前已经得到证实，烟草花叶病毒属（Tobamovirus）、雀麦花叶病毒属（Bromovirus）、香石竹病毒属（Dianthovirus）等许多病毒的CP与症状形成紧密相关，主要引起褪绿、坏死、局部3 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言病斑等。病毒编码的非结构运动蛋白MP主要介导病毒在寄主的胞间移动，也参与症状的表现（Rao等，1995;Shintaku等，1992;Tsai等，1993）。还有研究发现双生病毒的两个复制酶相关蛋白（解旋酶Rep及对复制起始具有正向调控作用的顺式作用蛋白RepA）也参与症状诱导。此外，复制酶也可参与病毒的胞间移动，构建雀麦花叶病毒（Bromemosaicvirus,BMV）的2a复制酶基因一系列缺失和移码突变体时发现，所有突变体在大麦植株上都不能造成系统侵染，但某些突变体可在大麦原生质体内正常复制，却抑制了BMV在胞间运动的能力（Traynor等，1991）。病毒常常伴随一些卫星分子，它们往往会影响病毒症状的发生程度。不同的卫星分子调节症状形成的能力不同，主要效果有加重症状、减轻症状或者无明显调节作用，这取决于寄主、卫星分子以及辅助病毒三者之间的相互关系。研究发现，黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）的卫星RNA有许多种株系,不同的株系对症状的调节作用有很大差别，用不同株系的卫星RNA与一种病毒组合接种番茄，会出现坏死、白化以及轻微显症三种不同的症状表现类型（Takanami，1981）。双生病毒也常常伴随有卫星DNA的存在，如双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒伴随着一种新型卫星分子DNAβ，DNAβ分子与病毒的致病性有密切关系，进一步研究发现，DNAβ上有一个位置保守的编码区，编码118个氨基酸的βC1蛋白，突变分析发现βC1蛋白是一个症状决定因子，βC1的启动子对症状诱导也会产生影响，miRNA芯片分析以及Northernblot实验表明βC1可能是通过某种机制降低miRNA的表达量，进而影响植物正常的生理活动（Ding等，2009;Zhou等，2003）。关于卫星分子减轻病毒诱导的症状，可能原因是它们与辅助病毒或者病毒争夺复制酶，从而抑制了病毒的复制进程。1.2.1.2植物病毒侵染对寄主代谢途径的影响病毒要在寄主上建立侵染，必须经过至少三个过程，即基因复制、胞间移动以及依赖于维管束系统的长距离运输，每一过程都是病毒与寄主植物互作的结果。抗病品种与感病品种对病毒致病因子的亲和力决定了病毒与寄主植物互作的结果，也成为最终症状产生与否的关键因素。植物病毒的侵染会对植物体内多种的生理活动产生深刻的影响，涉及到光合作用、植物防卫反应、物质代谢、能量传递等等。（1）病毒侵染对植物光合系统的影响。Rahoutei等研究了辣椒轻斑驳病毒不同株系：Peppermildmottleviruses（PMMoV）和Paprikamildmottleviruses（PaMMoV）侵染之后本氏烟光合系统发生的变化，结果显示，在所有显症和未显症的叶片上，光系统II的电子传递都受到了抑制，类囊体膜上放氧复合体中的24kDa和16kDa的外蛋白相比健康植株中含量有所下降。另外，病毒CP可以结合到叶绿体以及类囊体膜上，在感染病毒植株中叶绿素含量也下降（Rahoutei等，2000）。Gonçalves等以甘蔗黄叶病毒（Sugarcaneyellowleafvirus,SYLV）侵染后的甘蔗为研究对象，测定了叶片上的叶绿素a的荧光值以及气体交换率，并与光合色素以及碳水化合物的含量做了关联分析，受病毒侵染的叶片与健康对照相比较光合系统发生的变化有：光系统II的潜在量子效率下降、质体醌池的填充过程异常，CO2交换率降低，光合色素总量以及叶绿素a与叶绿素b的比值均有所下降（Gonçalves等，2005）。（2）病毒侵染对植物激素代谢的影响。植物体内各种激素的稳态平衡是植物正常生长发育的前提条件，植物在遭受到来自生物因素或非生物因素带来的胁迫时，便可能无法维持各激素之间的代谢平衡，导致代谢紊乱以及各种病变的发生。植物病毒侵染寄主植物后，通常表现出花叶、4 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言褪绿、矮化、畸变等症状，严重影响其产量和品质。了解病毒侵染植物导致的内源激素的变化情况，有助于解析植物病毒的致病机制，进而为生产上有针对性地防治病毒病害提供理论依据。除了生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯之外，油菜素甾醇、多胺、茉莉酸、水杨酸等新型植物激素也日益受到重视。为了同时了解生物压力与非生物压力对拟南芥生长发育的影响，Vitti等将生长2周的拟南芥幼苗分别用10μMCdSO4处理以及感染CMV，12天后与健康对照相比，结果表明两种压力胁迫下的幼苗均出现根毛增长、侧根增多的现象。激素含量测定显示在根中生长素与细胞分裂素的比值显著升高，两种胁迫下植物的表现相似（Vitti等，2013）。Gaudinova等测定了黑醋栗逆转病毒（Blackcurrantreversionvirus,BRV）侵染下，白醋栗和红醋栗花发育过程中激素含量的变化情况，结果显示，在花发育初期两个品种中的具有生物活性的细胞分裂素及细胞分裂素前体均有所提高。在花器官向浆果转变的过程中，健康植株中伴随着细胞分裂素含量明显升高的现象，然而感染病毒的花中未观察到这种变化，这导致花器官不能进一步发育。在叶片中，病毒的侵染对生长素和细胞分裂素的含量的影响不显著，而花中的脱落酸含量则略有上升（Gaudinova等，2008）。此外，早期的研究表明番茄不孕病毒（Tomatoaspermyvirus,ToAV）侵染番茄、烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）侵染烟草、黄瓜花叶病毒CMV侵染黄瓜、水稻东格鲁病毒（Ricetungrobacillifromvirus,RTBV）侵染水稻，马铃薯纺锤块茎类病毒（Potatospindletuberviroid,PSTVd）侵染马铃薯，大麦黄矮病毒（Barleyyellowdwarfvirus,BYDV）侵染大麦均导致寄主植物体内赤霉素含量降低，而被侵染植株通常也表现出脱落酸和乙烯含量的上升（Whenham，1982）。1.2.2miRNA等与病毒症状形成的关系miRNA是一类非编码RNA，曾经一度被科学界认为是无用的“垃圾RNA”，但随着近年来研究的不断深入，研究者发现非编码miRNA事实上在细胞功能中发挥着重要的作用，miRNA在植物体内参与多种多样的调节途径，包括生长发育、蛋白降解、细胞增殖和凋亡、信号转导、环境胁迫及病原入侵等等。研究表明，miRNA调控许多重要基因的表达，而且多数都是转录因子（Zhang等，2006）。近年来，miRNAs的鉴定和定性研究已成为迅速发展的一大热点领域。1.2.2.1植物体内miRNA产生和作用机理在真核生物体内，首先转录出较长的初级miRNA（primarymiRNA,pri-miRNA），然后在核内由RNaseIII样酶Drosha或Pasha加工成60-70个核苷酸的发夹状RNA，即前体miRNA（miRNAprecusor,pre-miRNA），在Exprotin-5复合物的帮助下被转运出细胞核，在细胞质中由Dicer剪切成为成熟miRNA，随即被整合进RNA沉默复合物（RISC）中，形成miRNP(核蛋白复合体)。在RISC的作用下miRNA与靶基因的3'-UTR区互补配对，对靶基因进行切割或者是翻译抑制（Jung等，2009），究竟起何作用取决于miRNA与靶基因的互补程度，完全互补时对靶基因进行切割；不完全互补时对靶基因进行翻译抑制。在植物体内，miRNA与靶基因多数都是完全互补的。5 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言图2.2植物体内miRNA产生及作用机制Fig.2.2ModelformiRNAbiogenesisandactivityinplants（Kidner等，2005）1.2.2.2逆境胁迫下植物miRNA的应答机制植物在生长发育过程中，不可避免地会遭受来自不良环境的非生物胁迫以及来自病虫害的生物胁迫，植物在对抗各种压力的过程中逐渐进化形成了一套防御机制，其中miRNA的调节和响应是植物面对逆境胁迫的重要途径，研究表明一种miRNA可能对多种胁迫做出响应（Chen，2005）。植物受到逆境胁迫之后，最终的结果是引起植物代谢途径发生改变，此时植物会启动包括转录水平、转录后水平和翻译水平上的调控，这是对外界刺激做出的适应性反应。miRNA调控方式通常是转录后水平上的，miRNA可以调控许多转录因子，然后通过改变转录因子的活性进而调控靶基因的表达。Guo等发现在拟南芥中miR164可以直接导致转录因子NAC1的mRNA降解，抑制生长素的信号转导，从而影响拟南芥侧根的发育（Guo等，2005）。（1）非生物胁迫下miRNA的响应机制。非生物胁迫主要来自干旱、营养缺乏、冻害、重金属、高盐等，Jones-Rhoades等利用比较基因组学的方法从拟南芥中筛选出了92个miRNA，靶基因预测结果显示，这些miRNA除了参与植物生长发育调控之外，还有一些参与超氧化物歧化酶、漆酶和ATP硫酸化酶等基因的调控，进一步实验表明“硫饥饿”诱导处理后，靶标基因为硫酸化酶的miR395表达上调（Jones-Rhoades等，2004）。（2）生物胁迫下miRNA的响应机制。植物遭受的生物胁迫主要来自于害虫取食以及细菌、真菌、病毒等病原物的侵染，这类因素会诱导植物中miRNA参与的抗病反应的启动和响应。6 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言Navarro等的研究表明来源于细菌鞭毛蛋白的肽段可以诱导拟南芥产生特定的miRNA，这种miRNA对F-box生长素受体TIR1、AFB2和AFB3起负调节作用，抑制生长素信号传递可以限制细菌性斑点病菌P.Syringae的生长（Navarro等，2006）。Sun等构建了水稻叶片和根的4个小RNA文库和和4个降解组文库，利用小RNA与降解组测序技术比较了健康水稻和受到水稻黑条矮缩病毒（Riceblackstreakeddwarfvirus,RBSDV）侵染的水稻体内miRNA的表达差异。分析结果表明，在叶片和根中分别有14个和16个miRNA显著差异表达，并且对病毒侵染响应的17个保守和16个非保守miRNA的靶基因进行了预测，该研究对于阐明病毒侵染条件下水稻不同组织miRNA调控网络具有重要意义（Sun等，2014）。1.2.2.3病毒来源的小RNA在致病过程中的作用植物病毒侵染后可以诱导寄主发生基因沉默现象，这一过程中许多病毒来源的小RNA起到了重要作用。Bouche等构建了4个不同的拟南芥Dicer酶突变体，用于研究Dicer酶不同功能域在切割产生小RNA方面的影响，结果显示，DCL1蛋白同时具有切割产生miRNA与siRNA的能力，而其他三个DCL蛋白只能产生siRNA。病毒dsRNA或ssRNA中某些结构化的区域可被不同的Dicer酶加工成为特定大小的小RNA，DCL2和DCL4在产生正链RNA病毒来源的小RNA时发挥主要作用（Bouche等，2006）。研究表明，来源于病毒的小RNA可以通过调控寄主靶基因的表达，从而调节病毒症状的形成。Smith等发现了CMV的Y卫星RNA(Y-Sat)能诱导烟草叶片产生黄化症状的分子证据，研究得出的结论是参与叶绿素合成的基因CHLI序列与CMV的Y卫星RNA(Y-Sat)存在一个22核苷酸的互补区域，而且在Y-Sat侵染的植物中，CHLI基因表达显著下调。小RNA测序以及5′-RACE实验证明，Y-Sat来源的siRNAs可以剪切CHLI的mRNA，从而影响叶绿素的合成。构建RNAi干涉载体沉默CHLI基因的表达，烟草出现了类似于Y-Sat侵染诱导的症状（Smith等，2011）。病毒来源的miRNA主要的功能存在于以下几个方面：首先，在病毒侵染的潜伏期，病毒仅表达维持其在细胞中存在所需要最小量的病毒基因，来逃避宿主的抗病毒反应。第二，调控寄主被侵染细胞的程序性死亡，以利于病毒的大量复制和扩增。第三，病毒的侵染过程中，调节自身基因或宿主基因的表达。病毒来源的miRNA与寄主miRNA之间的相互作用形成了错综复杂的调控网络。病毒miRNA与宿主miRNA共同调节宿主基因的表达，二者也共同调节病毒的基因表达。研究病毒编码miRNA与宿主miRNA的关系可为动物和人类病毒病的治疗提供新的思路，在植物中，也有助于阐明病毒致病的分子机制，为制定抗病毒策略提供理论依据（赵朴等，2007）。1.3高通量测序技术及侵染性克隆在植物与病毒研究中的应用1.3.1高通量测序技术在研究植物与病毒及其互作关系中的应用高通量测序技术（High-throughputsequencing）或“下一代”测序技术（Next-generationsequencingtechnology），是对以Sanger法（双脱氧链终止法）为代表的第一代测序技术的突破性变革。近年来，高通量测序技术以其高通量、高效率、高准确性和低成本等方面的突出优势，被广泛应用于全基因组测序、转录组测序和SmallRNA测序等方面的研究，推动了农业科学诸多领域的快速发展，如粮食作物及经济作物抗性基因的筛选、作物分子育种、动植物病原物致病分子机制、植物生长发育调控机理等。与此同时，高通量测序技术的日臻成熟和广泛应用正在引领7 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言众多新兴学科如计算生物学、功能基因组学、比较基因组学、生物信息学、表观遗传学、生物数学等进入一个前所未有的技术层面和发展高度。科学的发展使得研究者对测序工作的需求日益扩大，因此众多高通量测序平台应运而生。Roche的454焦磷酸测序技术、Illumina/Solexa的边合成边测序技术、以及ABI/SOLiD的基于连接酶的测序技术成为了其中的典型代表（Margulies等，2005;Shaffer，2007;Shendure等，2008）。（1）在植物研究中的应用。首先，植物全基因组测序中将高通量测序技术与传统测序方法相结合的策略，给遗传背景不清物种的测序带来了极大的便利，苹果、玉米等非模式物种的全基因组测序工作都是在高通量测序技术的应用下才得以在短时间内顺利完成（Sato等，2011;Schnable等，2009;Velasco等，2010）。植物在生长发育过程中生理活动的自我调节甚至受到不良刺激时代谢通路发生异常，本质上都是基因表达模式发生改变的结果，而转录水平的调控是植物体内基因表达调控中的关键环节。RNA-Seq深度测序技术因能全面地揭示生物在特定时间和特定组织的基因表达情况而被广泛应用于转录组的研究（Barakat等，2009;Dassanayake等，2009）。运用RNA-Seq可以在植物体内发现新的转录本、检测各个基因表达量、挖掘单核苷酸多态性(SNPs)、简单重复序列多态性（SSRs）以及可变剪接等等。异源六倍体小麦庞大而复杂的基因组使得其测序工作变得十分困难，Yu等利用高通量测序技术（RNA-Seq）获得了许多小麦和水稻SSR多态性位点，对二者同源性位点进行扩增时发现44%的SSR为二者共有，这在一定程度上说明水稻和小麦的基因具有相当程度的同源性（Yu等，2004）。Zenoni等运用RNA-Seq测定了葡萄在转录水平基因表达情况，共检测了17324个基因，在寻找与果实发育过程相关基因时，发现有6695个基因具有阶段表达特异性，385个基因具有可变剪接现象。除此之外，还发现了53个谷胱甘肽转移酶蛋白家族和28个MYB转录因子新基因（Zenoni等，2010）。Li等利用Illumina测序对玉米叶片不同发育阶段以及不同组织的转录组进行了测序，数据分析结果表明，不同发育阶段的叶片之间有64%的基因差异表达，而在维管束鞘和叶肉细胞之间有21%的基因差异表达，还利用基因组可视化工具Gbrowse观察了基因表达的动态变化，即由叶基部初生细胞壁和细胞内基础代谢向叶尖内次生细胞壁以及C4光合系统发育的过渡过程（Li等，2010）。miRNA作为一类重要的负调控因子，越来越受到重视，然而由于miRNA在植物体内分布广泛、数量庞大、种类繁多，而且某些miRNA在细胞内表达丰度特别低，因此传统的测序方法已经无法满足研究的需要。运用高通量测序技术不但能够检测到植物体内低表达的miRNA，而且在有物种参考基因组的情况下，还能挖掘出新的miRNA，这极大地加快了miRNA的研究进展（Sunkar等，2008）。Gebelin等利用Solexa测序技术对严重非生物胁迫下橡胶体内的miRNA表达情况进行了分析，结果鉴定了48个在其他物种中也同样保守的miRNA家族，发现了10个新的miRNA家族成员。所有的miRNA长度分布于20-22个核苷酸和23-27个核苷酸两个区段，这两类miRNA各自行使不同的功能。此外，还对miRNA的靶标基因进行了预测，结果显示靶基因主要功能为对刺激做出的反应、抗氧化、转录活性等（Gebelin等，2012）。研究植物在病虫害侵染等生物胁迫下体内miRNA的调控，有利于发现寄主新的抗性机制，从而筛选出抗性基因。Yin等对健康和受大豆花叶病毒（Soybeanmosaicvirus,SMV）侵染的大豆体内miRNA进行了测序分析，共获得了52个家族的179个miRNA，其中5个新的miRNA被鉴8 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言定出来。所有的miRNA指向346个潜在的靶标基因，利用5'-RACE对其中的12个靶基因进行了验证，结果显示，miR160、miR393以及miR1510三个miRNA参与了大豆抵抗SMV防卫反应的调控（Yin等，2013）。（2）在植物病毒研究中的应用。在高通量测序技术应用之前，只能通过病毒分离、光学和电子显微镜技术、分子诊断等对已知的病毒进行检测或发现新病毒。分子诊断技术中基于PCR的方法有序列非依赖性单引物扩增(SISPA)、滚环扩增(RCA)等，PCR与分子杂交相结合的方法，如代表性差异分析技术(RDA)、抑制消减杂交技术(SSH)等，这些技术在未知病毒的发现中得到了广泛的应用。高通量测序技术在新病毒资源发掘中的优势在于，可以在短时间内对大量样本中的未知序列进行通量分析，检测出所有的DNA病毒、RNA病毒、环状RNA分子、类病毒等。目前，将高通量测序技术与PCR及分子杂交相结合的方法来寻找新病毒，已经成为科学研究上的热点。Adams等将开花植物蛇鞭菊上分离出的一个未知病原通过摩擦接种传播到千日红上，对感染的千日红cDNA做消减杂交后进行高通量测序，结果发现了一个黄瓜花叶病毒属的新成员蛇鞭菊轻斑驳病毒（Gayfeathermildmottlevirus,GMMV）（Adams等，2009）。Zhang等利用RNA-Seq测序技术，结合改进的生物信息学分析软件FFOR，在苹果与葡萄中分别发现了两种新的环状小RNA：Applehammerheadviroid-likeRNA（AHVd-likeRNA）和Grapevinelatentviroid（GLVd），并验证了它们的核酶活性和自我复制特性，这是首次从苹果中发现了具有核酶活性的环状RNA（Zhang等，2014）。高通量测序技术还被应用于双生病毒的检测以及新病毒发现。Hagen等将滚环扩增(RCA)技术及454焦磷酸测序技术相结合，对来自墨西哥的辣椒和印度的番茄田间样品进行了检测,结果表明在辣椒上存在辣椒金色花叶病毒、瓦斯特科辣椒黄脉病毒以及番茄金色斑驳病毒三个双组分的双生病毒，在番茄上存在云南赛葵黄脉病毒、烟草曲茎病毒、番茄黄曲叶病毒等26个双生病毒及伴随的卫星分子（Hagen等，2012）。2007年，Schubert等利用双生病毒环状DNA基因组的特点，结合滚环扩增（RCA）、限制性片段长度多态性（RFLP）以及直接测序法，从来自德国的病毒分离物中发现了两个双生病毒新种：大麦矮缩病毒（Barleydwarfvirus,BDV）和燕麦矮缩病毒（Oatdwarfviru,ODV）。Wyant等用类似的方法并结合焦磷酸测序技术对来自亚洲、南美及中美的61份植物样品进行检测，结果显示获得的83条序列是双生病毒组分，4条序列来自于DNA卫星分子，随后的实验证明利用该方法对巴西菜豆金色花叶病毒属病毒的检测也是十分经济有效的。最近，Jeske等从古巴双生病毒分离物中发现了许多新株系、一个命名为“Peristrophemosaicvirus”病毒新种以及一个与矮缩病毒属关系较近的α卫星分子（Jeske等，2014;Schubert等，2007;Wyant等，2012）。（3）在植物与病毒互作研究中的应用。前文已经提及植物病毒诱导症状的形成是病毒与寄主在细胞和超细胞水平上互作的结果，病毒的致病因子与植物某些蛋白因子相互作用，从而改变寄主植物基因的表达模式，影响代谢通路的正常运行。通过转录组测序的策略可以获得由于病毒侵染导致的植物转录谱的变化情况，病毒致病因子可以与代谢途径的关键点直接互作，或者通过结合转录因子来间接影响基因的正常表达。因此，通过对病毒侵染下转录组差异基因表达分析，可以使研究者全面地理解植物与病毒之间的互作，有利于揭示病毒的致病机理以及寄主植物的抗病分子机制。Rubio等运用RNA-Seq深度测序技术对李痘病毒（Plumpoxvirus,PPV）侵染以后显症和无9 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言症阶段桃树叶片之间的基因表达差异进行了分析，结果发现359个基因具有可变剪接现象，12290个单核苷酸多态性SNP，425个基因具有注释信息。GO功能注释结果表明，未显症和显症阶段大量的差异表达基因主要是对生物刺激做出响应、脂类和碳水化合物的代谢以及催化活性的负调控等。病毒早期侵染的建立与寄主病原抗性基因的诱导有关，这些抗病原基因主要有茉莉酸、几丁质酶、细胞分裂素葡糖基转移酶等。研究还表明，病毒积累之后，过表达Dicer2a基因之后病毒HCPro和P1蛋白会抑制植物基因沉默途径的发生。从植物基因表达的变化可以发现病毒症状的诱导是一个错综复杂的过程（Rubio等，2015）。Fan等研究发现甜菜坏死黄脉病毒(Beetnecroticyellowveinvirus,BNYVV)RNA4编码的p31蛋白是症状诱导因子。运用高通量测序技术对含RNA4和不含RNA4的病毒侵染本氏烟后叶片组织转录组进行测序，与健康对照组比较后，鉴定出的3016个差异表达基因涉及到的代谢途径主要有基因沉默、泛素化、植物激素代谢等。体外喷施赤霉素矮化症状消失，说明病毒侵染本氏烟导致矮化症状可能是寄主体内赤霉素的积累受阻以及细胞壁合成相关基因表达下调共同作用的结果（Fan等，2014）。通过抗病品种和感病品种在病毒侵染下转录水平表达差异，可以挖掘植物的抗病基因，为植物抗病分子育种提供依据。Chen等通过全基因组测序对番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)侵染条件下抗感病品种在病毒胁迫下基因表达的差异变化进行了比较分析。结果共得到了34831个unigene，在抗病品种中有209个基因差异表达而感病品种中809个基因差异表达。在抗病品种有58.37%的基因上调表达，远高于感病品种中9.17%的比例。WRKY转录因子、R基因、蛋白激酶等在感病品种中下调表达，而在抗病品种中上调表达或无显著变化，这有利于针对病毒寻找到抗病基因（Chen等，2013）。1.3.2侵染性克隆在病毒研究中的应用所谓侵染性克隆是指，病毒具有侵染性的cDNA或DNA，或者是它们具有侵染性的体外转录物。上世纪70年代DNA重组技术的出现使得病毒工作者可以将RNA病毒的基因组转化为互补的cDNA拷贝，然后插入到细菌质粒中进行复制，这使得研究者能够对基因组相对较小的病毒或基因组为多分体的病毒进行反向遗传学操作。侵染性克隆技术的推广与应用，推动了病毒研究相关工作以及病毒学的向前发展。1.3.2.1侵染性克隆概述为了使插入载体的克隆序列高效表达，后来的改进措施是在插入片段上游的载体中加上启动子。若是构建具有侵染性的DNA或cDNA克隆载体，则通常用的是花椰菜花叶病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）35S启动子；若是利用它们产生具有侵染性的体外转录物，则需要加入的是T7、SP6等启动原核表达的启动子。这就是现在使用最广泛的侵染性克隆构建策略。实际上最早用于制备侵染性克隆的是DNA病毒，如双生病毒的DNA本身就是侵染性克隆，然而DNA病毒的复制能力不及RNA病毒，另一个限制其应用的是DNA病毒易发生同源重组（Hefferon等，2003）。1982年，植物DNA病毒的侵染性克隆首次在番茄金色花叶病毒（Tomatogoldenmosaicvirus,TGMV)中构建成功（Bisaro等，1982）。构建双生病毒的侵染性克隆时要将1.2-2.0个串联重复的全长基因组插入到一个双元转化载体中，才能保证其复制和侵染的完整性。10 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言目前这种方法已在多种玉米线条病毒属病毒中得到应用，如玉米线条病毒MSV、烟草黄矮病毒（Tobaccoyellowdwarfvirus,TobYDV）和菜豆黄矮病毒（Beanyellowdwarfvirus,BeYDV）。R.J.HAYES及Woolston,C.J.等早在1988年就尝试构建小麦矮缩病毒侵染性克隆，但并未观察到植株出现典型的症状表现，Ramsell等构建了小麦矮缩病毒大麦株系侵染性克隆用于研究其寄主范围，其研究结果表明改进的农杆菌介导的固体菌落针刺法适用于多种禾本科植物的侵染性克隆接种（Ramsell等，2009）。对于不能机械传播的病毒，其侵染性克隆的构建为进一步研究病毒基因组结构、功能和表达调控机制提供了可能。由于小麦矮缩病毒由异沙叶蝉专化性传播，不能通过机械摩擦接种传毒，使得致病性研究有一定的困难。实验表明玉米线条病毒属病毒均不能通过机械摩擦接种，一种农杆菌介导的侵染性克隆接种技术被发展起来用于此类病毒的接种。1.3.2.2侵染性克隆用于研究病毒致病机理病毒侵染性克隆构建成功以后，可以对载体上的病毒序列进行插入突变、置换突变、基因敲除等操作，通过建立一系列高效稳定的突变体和重组体侵染性克隆，从而明确致病相关基因的功能以及致病因子的关键功能域或关键氨基酸等。有些病毒的致病因子若某一个关键氨基酸发生突变，即可导致功能完全丧失。Wu等研究发现小西葫芦黄花叶病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV）的多功能蛋白HC-Pro具有三个与致病力相关的氨基酸位点，分别为180位Arg、205位Phe和396位Glu。若180位Arg和396位Glu两个位点发生突变，则病毒突变体致病力会明显下降，在寄主上只会诱导轻微的褪绿斑点且后期症状消失，如果180位Arg和205位Phe两个位点同时突变，则会完全丧失致病力（Wu等，2010）。1.3.2.3侵染性克隆作为外源基因表达载体或VIGS载体基于植物病毒载体表达外源基因的简便性与高效性，可以利用其作为生产某些重要疫苗、抗体等的工具，这样大大减少了成本，具有良好的发展前景和很高的商业价值。应用最广泛的病毒表达载体是PVX，Sablowski等利用PVX作为表达载体成功地将花器官中特异的MYB转录因子在叶片中实现了异位表达（Sablowski等，1995）。Liu等将能产生反义RNA的核酸序列重组到PVX载体上，该重组载体成功表达具有锤头型的核酶，该核酶的表达能使受到李痘病毒侵染的克氏烟上的症状延迟3-5天出现（Liu等，2000）。除此之外，一些外源无毒基因、糖蛋白之类的物质都在PVX上成功实现了表达。构建病毒诱导的基因沉默表达载体也是植物侵染性克隆的一个重要用途，将携带有侵染性克隆的植物表达载体经过适当改造后即可成为VIGS载体，将植物的未知目标基因构建到VIGS载体上，携带目标基因的病毒侵染后便会诱导植物内源基因沉默，引起表型变化，这已经成为目前研究植物基因功能十分有效的工具。大麦条纹花叶病毒（Barleystripemosaicvirus，BSMV）是目前唯一能在小麦以及大麦上实现的VIGS载体，2002年，Holzberg等首次在大麦上成功建立了VIGS体系，将大麦PDS部分序列插入经过改造的BMSV的γ链中，通过摩擦接种大麦叶片，成功诱导了大麦内源PDS的基因沉默（Holzberg等，2002）。Scofieid等在小麦上成功建立了BSMV介导的VIGS体系，研究了Lr21介导的叶锈病抗性通路中RAR1、SGT1以及HSP90三个基因的功能（Scofield等，2005）。11 中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1.4本论文研究目的及意义病毒致病因子与植物体内相关蛋白互作，改变了寄主植物正常的生理生化过程，从而诱导相关症状的发生。然而由于小麦庞大而复杂的基因组，使得研究小麦病毒与植物之间的相互作用关系变得十分困难。近年来，第二代测序技术的快速发展为研究基因表达及调控、基因功能、蛋白/核酸互作等带来极大的方便。本研究利用RNA-Seq高通量测序技术对WDV侵染下小麦转录组以及miRNA进行深度测序。依据转录组数据分析差异表达基因时，重点选择与植物激素、光合作用、防卫反应等相关基因，以期解析WDV诱导的矮化、黄化、分蘖异常等症状形成的原因；对病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达分析时，重点通过miRNA与靶标基因的负相关联合分析，来获得了一些miRNA参与的重要调控信息。寄主植物转录谱表达变化以及miRNA的差异表达反映了寄主受到WDV侵染以后体内多个代谢途径的改变，这为揭示病毒致病的分子机理提供重要参考。另外，尝试构建WDV中国分离物的侵染性克隆，为从更深层次研究病毒致病机理提供有效的工具，而且侵染性克隆在研究病毒诱导的基因沉默、解析病毒基因功能以及品种抗病鉴定等方面也具有积极意义。12 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析植物病毒从侵染初期到症状的发生是一个错综复杂的过程，这是由于病毒与寄主的基因产物会发生互作。在此期间，病毒通过释放致病因子干扰寄主植物基因的正常表达，同样寄主为清除病毒会积极调动防御机制，当控制植物正常生长发育的调节因子失去了作用以及植物抗病相关通路受到抑制时，随即诱导形成症状，造成危害。无论是研究病毒侵染过程中细胞基因表达模式的改变、寻找具有重要功能的基因，甚至发掘寄主体内SSR分子标记等等，都可以通过分析病毒侵染以后寄主植物转录组水平的差异变化来获得大量的信息。近些年来，高通量测序技术的广泛应用给许多生物转录组学的分析带来了新的思路和方法。在众多转录组的研究方法中，深度RNA测序技术（RNA-Seq）以其较高的重现性与灵敏度而备受青睐，而且无需完整的基因组图谱以及大量的生物信息数据库，更重要的是不仅可以检测低丰度表达的基因，且表达值与蛋白质水平的关联度也更好，因此它比生物芯片更加有效。本研究应用RNA-Seq测序技术对WDV侵染前后小麦在RNA水平上的基因表达变化情况进行分析，重点筛选与病毒症状形成以及植物抗病相关的基因，利用qPCR方法对选择的差异表达基因进行验证，以期通过寄主植物转录谱的差异变化来揭示病毒致病的分子机制。2.1材料与方法2.1.1材料2.1.1.1传毒介体及植物材料小麦矮缩病毒毒源、传毒介体异沙叶蝉以及高感小麦矮缩病的小麦品种扬麦12号均由本实验室繁殖和保存。2.1.1.2实验试剂SYBR®PremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)、PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)购自TaKaRa公司，提取高纯度RNA所用TRIzol购自Invitrogen公司，其他试剂与耗材均购自国内生化试剂厂商。2.1.2方法2.1.2.1用于转录组测序分析RNA样品的准备利用本实验室接种并传毒扩繁的WDV获毒小麦植株，对介体昆虫异沙叶蝉进行饲毒，3-4天后将介体昆虫转移至一心一叶的健康小麦植株上进行传毒，同时以健康小麦作为对照，观察接种植株的发病情况。在温室接种条件下，第20天时植株出现典型症状，本研究目的在于比较显症叶片与健康叶片之间的基因表达差异，故在接种后第20天采集出现典型症状的感染病毒的小麦叶片以及同时期的健康对照组小麦叶片。样品的收集方法为：将8株显症的小麦叶片全部剪碎，混合均匀后取样，健康样品收集方法与此相同，RNA提取的具体步骤如下：（1）取感染WDV与健康的新鲜小麦叶片各0.1g，加液氮充分研磨，向样品粉末中分别加13 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析入1mlTRIzol试剂后继续研磨，室温静置5min；（2）将TRIzol试剂与样品粉末的混合物移至1.5ml去酶离心管中，加入200μl氯仿后剧烈振荡15s，室温静置2-3min；（3）冷冻离心机中以12000rpm，4℃，离心15min；（4）小心吸取450-500μl上清液，置于新的1.5ml去酶离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min；（5）冷冻离心机中以12000rpm，4℃，离心15min；（6）弃上清，加入1ml70%的无水乙醇（灭菌的DEPCddH2O配制）洗涤沉淀；（7）冷冻离心机中以7500rpm，4℃，离心5min；（8）在超净工作台中干燥沉淀，加入40-60μl灭菌的DEPCddH2O溶解；（9）NanoDrop-2000紫外分光光度计（ThermoScientific）检测RNA的质量和浓度，以确保达到要求，-70℃保存所提取的总RNA，准备送往公司进行测序。2.1.2.2小麦转录组测序（RNA-Seq）将提取的健康小麦(命名为CK组)与获毒小麦叶片RNA(命名为W20组)两组样品送达北京贝瑞和康生物技术有限公司进行测序，样品的具体信息见表2.1。表2.1样品信息汇总Table2.1Informationofthesamples样品编号体积（μl）浓度（ng/μl）总量（μg）物种样品质量备注CK42202685.09小麦合格健康小麦W205450627.32小麦合格感染WDV的小麦（20dpi)2.1.2.3反转录体系按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)试剂盒说明书上描述的方法进行反转录操作，具体步骤如下：（1）5×gDNAEraserBuffer2.0µlgDNAEraser1.0µlTotalRNA1.0µgRNaseFreedH2O补至总体积10.0µl（2）将步骤（1）中的混合物置于42℃2min或者室温条件下静置5min；（3）5×PrimeScriptBuffer24.0µlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0µlRTPrimerMix4.0µlRNaseFreedH2O1.0µl总体积10.0µl14 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析（4）将步骤(1)与(3)中的两种反应物混合均匀，37℃放置15min后，85℃变性5s即可。2.1.2.4实时荧光定量PCR反应体系及内参基因的选择利用qPCR方法对筛选出来的感兴趣的差异表达基因进行分析验证，验证时为了保证实验结果的科学性，设置了3次技术性重复，3次生物学重复。选择了4个在小麦体内稳定表达的持家基因作为内参基因，分别是翻译延伸因子1A（EF-1α）、GTP结合蛋白（GTPB）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、β微管蛋白[TUBβ(Tubb4)]。依据SYBR®PremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)试剂盒说明书中的进行qPCR操作，反应体系如下：SYBRPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)10.0µl上游引物(10µM)0.8µl下游引物(10µM)0.8µlROXReferenceDyeII(50×)0.4µl模板2.0µl灭菌ddH2O6.0µl总体积20.0µl2.1.2.5引物设计与合成内参基因的引物依据相关文献以及GenBank上登录的部分序列设计，而待验证的差异表达基因引物直接依据测序获得的unigene序列设计，设计好的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相关引物的具体序列信息见附录。2.2结果与分析2.2.1小麦转录组数据的处理与生物信息学分析2.2.1.1原始数据的处理由Illumina（RNA-Seq）高通量测序获得了健康对照组（CK）11.24Gb与病毒感染组（W20）9.87Gb的原始数据，由于原始数据的产生经过了核酸提取、建库及测序等多个环节，此过程中会产生大量对后续生物信息数据高级分析带来严重干扰的冗余数据，比如建库阶段会出现建库长度的偏差，测序阶段会出现测序错误的情况。通过一些手段将原始测序数据中包含的接头序列，低质量碱基，未测出的碱基（以N表示）等无效数据去除掉，最终得到了健康对照组11.01Gb与病毒感染组8.75Gb的有效数据（cleandata），以fastq文件格式存储，经过这样的数据过滤后可以保证生物信息学分析的正常进行。原始测序数据（rawdata）按照以下方法进行过滤：（1）需要过滤掉含有接头序列的reads；（2）当任意一端read中含有的N的含量超过read长度的3%时，需要去除此对reads；（3）当任意一端read中含有的低质量(低于3)碱基数超过read长度的50%时，需要去除此对reads。2.2.1.2转录组数据的拼接与基因注释15 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析利用Trinity软件对获得的有效数据进行拼接，将获得的contig经过聚类分析后共得到77221条unigene，其中所有unigene的平均长度为1286bp，UnigeneN50为1525bp，所有unigene长度的中位数为1042bp。健康对照组以及病毒感染组的相关数据见表2.2。为了全面了解unigene序列中蕴含的生物信息，将转录组获得的全部序列比对到水稻及拟南芥基因组上，得到与给定unigene具有最高序列相似性的蛋白(E-value<1e-5)。结果显示，获得的77221条序列与同为禾本科的水稻以及模式植物拟南芥都具有相当数量的同源基因，50048条序列与水稻有同源匹配信息，40803条序列与拟南芥有同源匹配信息，这些信息的获得使我们对小麦转录组测序结果有了概括性的了解。表2.2转录组数据拼接结果Table2.2Assemblyresultsoftranscriptomedata聚类后健康对照组（CK）病毒感染组（W20）TotalUnigene772216772085587UnigeneN50(bp)152511121102UnigeneAveragesequencelength(bp)1286.66700.79703.30UnigeneMediansequencelength(bp)1042416421TotalTranscript95101125281TranscriptN5012221209TranscriptAveragesequencelength793.62800.03TranscriptMediansequencelength512526N50length122212092.2.1.3RNA-Seq相关性检验以及转录组Mapping数据不同样品之间基因表达水平的相关性是检验实验结果是否可靠以及样品选择是否科学的重要衡量标准，因此，需要对高通量测序结果进行相关性（图2.1）以及均一性分布检验（图略）。本研究中spearman与kendall-tau两个相关系数均大于0.9，而相关系数越接近1，表明样品之间基因的表达模式的一致性越高。本研究分析的物种为小麦，没有参考转录组，故需要对转录组数据进行组装，得到ReferenceSequence，再采用BWA软件将测序结果中的短序列Mapping到参考基因组上，Mapping率的高低直接关系到基因表达量的计算以及后续的生物信息学分析。表2.3显示健康对照组（CK）与感染病毒组（W20）reads的Mapping率分别达到了0.99与0.98，UniqueMapping率也分别达到0.887与0.708。16 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析图2.1RNA-Seq相关性检验Fig.2.1CorrelationtestofRNA-Seq表2.3转录组Mapping数据Table2.3Mapping_StatisticsofshortreadsStatisticsTermResult(CKgroup)Result(W20group)AllReads10650604980358039UnMapped10316761571274MappedReads10547437378786765MappingRate0.990.98UniqueMapping9450458656898394UniqueMappingRate0.8870.708RepeatMapping10969787218883712.2.1.4基于RNA-Seq数据对小麦SSR分子标记的开发简单重复序列(Simplesequencerepeats，SSR)遗传位点广泛分布于所有原核生物和真核生基因组中，具有分布丰富性、遗传共显性和技术简单性等特点。本研究利用新一代的高通量Illumina测序技术获得的小麦转录组数据来开发小麦功能基因组SSR分子标记。使用MISA（MIcroSAtelliteidentificationtool）通过以下标准进行筛选：单核苷酸重复次数10次或10次以上，二核苷酸重复次数6次或6次以上，三核苷酸至六核苷酸重复次数5次及5次以上，结果共获得了12404个SSR17 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析位点，这些位点分布于10717个Unigenes上（表2.4）。从重复序列类型分布来看，小麦转录组SSRs种类十分丰富，主要集中在单核苷酸重复单元、二核苷酸重复单元及三核苷酸重复单元，三者的总和占到了全部SSRs的95.65%，三核苷酸重复单元数量最多，占到了总数的51.18%（图2.2）。从各种类型核苷酸重复单元出现的频率来看，单核苷酸重复单元中出现频率最高的是A/T，占SSRs总数的20.95%，C/G只占了1.84%；二核苷酸重复单元中，AC/GT、AG/CT占了大多数，其次的类型为AT/AT、CG/CG；三核苷酸重复单元中，CCG/CGG具有绝对的数量优势，共有2240个，占了SSRs总数的18.06%，其他类型如AGC/CTG、AGG/CCT、ACC/GGT、ACG/CGT等出现的频率也较高，余下的多核苷酸重复单元则分布较为分散。综合分析，小麦体内SSR遗传位点数量多且丰富，具有很高的实用性。表2.4微卫星DNA搜索结果Table2.4ResultsofmicrosatellitesearchCategoryNumberTotalnumberofsequencesexamined77221Totalsizeofexaminedsequences(bp)99356869TotalnumberofidentifiedSSRs12404NumberofSSRcontainingsequences10717Numberofsequencescontainingmorethan1SSR1446NumberofSSRspresentincompoundformation551图2.2不同重复序列类型的分布Fig.2.2Distributiontodifferentrepeattypeclasses18 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析2.2.1.5转录组数据中基因表达量的计算以及差异基因的提取为了探究WDV侵染对寄主小麦生长发育中生理生化过程产生的影响，需要对转录组测序获得的数据进行基因表达量的计算。采用国际精确算法Counts、RPKM(ReadsPerKilobaseofexonMillionmappedsequencereads)进行基因表达定量，RPKM即每1百万个map上的reads中map到外显子的每1千个碱基上的reads个数。经统计分析，在健康对照组中有75.0%以上unigene的RPKM值大于0.2，在病毒感染组中有95.0%以上unigene的RPKM值大于0.2，这表明即使在基因表达丰度很低的情况下，应用高通量测序方法仍可以检测到基因的表达。应用EB_Seq算法筛选健康对照组（CK）与感染病毒组之间的差异表达基因。筛选过程是基于counts的数据，而不是RPKM，筛选的条件是FDR(FalseDiscoveryRate)<0.05，log2FC>1或log2FC<-1。经过这样的显著性分析与FDR分析之后，就获得了2倍以上表达差异变化的差异表达基因。对于无生物学重复的实验来讲，可以通过上述差异倍数以及显著性水平对差异基因进行筛选，这样处理可以消除由于生物学变异带来的误差。为了更直观地反映差异表达基因的整体分布情况，以log2foldchange为横坐标，以-log2FDR为纵坐标，绘制了差异基因的火山图（VolcanoPlot），见图2.3。图2.3差异基因火山图Fig.2.3VolcanoPlotofdifferentiallyexpressedgenes2.2.1.6差异表达基因的GO与Pathway分析虽然到目前为止，普通小麦基因组草图几近绘制完成，但是由于小麦基因组极其庞大与复杂，而且大量基因的功能未知，因此我们在转录组数据分析中，差异表达基因的功能注释与分类分析工作，仍然主要参考模式植物水稻和拟南芥来进行。通过FDR错误控制方法以及log2FC表达差异倍数的限制，共获得了4324个具有显著表达差异的基因，感染病毒组（W20）相对于健康对照组（CK），上调表达的基因有2136个，下调表达的基因有2188个。在上调表达的基因中，与水稻数据库比对后有同源信息的1733个，在NCBI中有具体功能描述的1673个，与拟南芥数据库比对后有同源信息的1430个，在NCBI中有具体功能描述的1382个；在下调表达的基因中，与水稻数据库比对后有同源信息的1222个，在NCBI中有具体功能描述的1011个，与拟南芥数19 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析据库比对后有同源信息的974个，在NCBI中有具体功能描述的824个，见图2.4。图2.4差异表达基因上下调情况Fig.2.4Overviewofthedifferentiallyexpressedgenes2.2.1.7差异表达基因GO分类分析使用Fisher对所有的4324个显著差异表达基因进行功能分类，就是计算这些差异基因同GO分类中某个特定分支的超几何分布关系，GO分析会对每个有差异基因存在的GO输出一个p-value，较小的p值(p<0.05)表示差异基因在该GO中出现了富集。按照生物学过程(Biologicalprocess)、细胞组分(Cellularcomponent)和分子功能(Molecularfunction)三大亚类进行分析和汇总，从图2.5可以看出，当病毒侵染以后，寄主小麦体内差异表达基因涉及的主要生物学过程有老化、对抗压力做出响应、磷饥饿反应、对有毒物质的反应、光合作用、DNA复制及代谢、系统获得性抗性、植物先天性抗性、基因沉默、氧化压力下的反应、碳水化合物代谢过程、生长发育调节等；差异表达基因涉及到的细胞组分主要是细胞内、胞外结构域、质外体、细胞壁、细胞质膜边界囊泡、光系统I与II、叶绿体被膜等；差异表达基因涉及到的分子功能主要有酸性磷酸酶活性、谷胱甘肽转移酶活性、水解酶活性、电子载体活性、糖类跨膜转运子活性、氧化还原酶活性、氧结合活性等。20 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析BiologicalprocessCellularcomponentMolecularfunction图2.5小麦转录组GO功能分类Fig.2.5GOclassificationofTriticumaestivumtranscriptome2.2.1.8差异表达基因Pathway分析同GO分析类似，Pathway分析获得较小的p值(p<0.05)表示差异基因在该代谢通路中出现了富集。通过差异基因的Pathway分析，可以找到富集差异基因的Pathway条目，从而找到不同样品的差异基因可能与哪些代谢通路的改变有关。Pathway分析的结果显示的是蛋白质之间的相互作用，Pathway的变化可以由参与这条Pathway途径的蛋白的表达量或者蛋白的活性改变而引起。图2.6显示的是以富集度的大小来衡量差异表达基因在各代谢通路上的分布情况，本研究所筛选出来的差异表达基因主要参与的代谢通路有淀粉与蔗糖代谢、谷胱甘肽代谢、DNA复制、半乳糖代谢、黄酮类物质合成、双萜类物质合成、苯丙素生物合成、错配修复、同源重组、柠檬烯与蒎烯降解、氨基糖与核苷酸糖代谢、吲哚生物碱合成、植物生理节律调节等等。差异表达基因参与了众多的信号通路，通过构建信号通路调控网络，可以从整体层面了解Pathway之间的信号传递关系，而且从调控网络关系图中可以找到与本实验密切相关的核心Pathway（图2.7）。分析结果表明，氨基糖与核苷酸糖代谢途径、苯丙素生物合成途径等处于代谢通路较为核心的位置，在信号传递及基因调控方面发挥重要作用。为了更直观地了解转录组数据中涉及到的参与主要代谢通路的基因间互作情况，本研究还利用显著性Pathway中的水稻基因构建了基因间相互作用关系网络，图2.8显示该网络关系图中涉及到的主要是淀粉及蔗糖代谢途径中的相关基因，如蔗糖合成酶（Sucrosesynthase）、淀粉分解酶（Alpha-amylaseisozyme2Aprecursor）、果糖激酶（Fructokinase1）等；以及赤霉素合成途径中贝壳杉烯合成酶（KaurenesynthaseA）基因与萜类化合物合成酶（Terpenoidsynthasedomaincontainingprotein）基因之间的互作关系；酪氨酸/尼克酰胺转氨酶、过氧化物酶基因与酪氨酸/多巴脱羧酶基因之间的互作关系，另外，从图中还可以发现糖基转移酶在单半乳糖甘油二酯（MGDG）合成途径的重要作用，MGDG是植21 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析物光合膜的主要组分，其在病毒侵染后基因表达的显著变化，对于揭示寄主植物光合作用效率下降具有重要意义。图2.6小麦转录组Pathway富集分析Fig.2.6PathwayEnrichmentanalysisofTriticumaestivumtranscriptome图2.7小麦转录组信号通路调控网络Fig.2.7Pathway-Act-NetworkofTriticumaestivumtranscriptome22 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析图2.8小麦转录组基因互作关系网络（以水稻基因表示）Fig.2.8Gene-Act-NetworkofTriticumaestivumtranscriptome（Thenetworkisshownwithgenesofrice）注：红色表示基因表达上调，绿色表示基因表达下调，黄色表示该Pathway中的相关基因既有上调又有下调表达表2.4基因互作网络中相关基因的描述Table2.4DescriptionofthegenesinGene-Act-NetworkBlasttoRice_SymbolPathwayBlast_DescriptionOs04g0309600path:osa00500SucrosesynthaseOs01g0894300path:osa00500Fructokinase1Os07g0616800path:osa00500Sucrose-UDPglucosyltransferase3Os01g0966700path:osa00500Beta-fructofuranosidaseOs03g0401300path:osa00500Sucrose-UDPglucosyltransferase2Os02g0528200path:osa00500Branchingenzyme-3Os04g0535600path:osa00500Beta-fructofuranosidase1precursorAlpha-amylaseisozyme2AprecursorOs06g0713800path:osa00500(1,4-alpha-D-glucanglucanohydrolase)Os03g0212800path:osa00500Beta-glucosidaseOs09g0397300path:osa00500HAD-superfamilyhydrolasesubfamilyIIBproteinOs02g0106100path:osa00500FructosyltransferaseOs01g0142300path:osa00561Glycosyltransferase,group1domaincontainingproteinOs08g0299400path:osa00561MGDGsynthasetypeAOs04g0611800path:osa00904TerpenoidsynthasedomaincontainingproteinOs02g0278700path:osa00904KaurenesynthaseAOs05g0510600path:osa00360Tyrosine/DOPAdecarboxylase1.Os08g0113000path:osa00360Peroxidase47precursorOs11g0552000path:osa00360Tyrosine/nicotianamineaminotransferasesfamilyprotein23 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析2.2.2目标基因的选择本节重点对病毒症状形成以及寄主植物防卫反应相关因子进行选择，分别筛选植物激素代谢或运输相关基因、植物光合作用反应过程及叶绿素代谢相关基因、植物抗逆反应相关基因，还有一些与基因沉默相关基因、转录因子等。2.2.2.1植物激素代谢或运输相关基因前文已经提及到植物激素在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花结实、成熟衰老、休眠萌发等方面发挥关键作用，它们分别或相互协调地调控着植物的生长、发育与分化。内源激素含量与稳态平衡是保证植物正常生理过程的有序进行的前提，病毒的侵染有可能打破植物体内这种稳态平衡，导致小麦发育迟缓、叶片黄化、分蘖异常等症状的发生。本研究发现在WDV侵染前后，许多与生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、油菜素内酯等蛋白修饰、运输、代谢或者信号转导相关的基因表达发生显著变化。这些基因包括与生长素运输、合成及信号转导有关的生长素极性运输外流载体（Effluxcarrierofpolarauxintransport），吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase），AUX/IAA蛋白（IAA8），生长素响应因子10（Auxinresponsefactor10），羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（Hydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinatehydroxycinnamoyltransferase）等；与细胞分裂素修饰及运输相关的细胞分裂素N-葡萄糖基转移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1），嘌呤透性酶10（Purinepermease10）等；与赤霉素合成相关的内根-贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3），与脱落酸信号转导相关的F-BOXWITHWD-402及与油菜素内酯信号转导相关的富含亮氨酸重复序列（LRR）油菜素甾醇受体激酶（BrassinosteroidLRRreceptorkinase）等。这些基因中，除了抑制生长素运输的羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（HCT）、F-BOXWITHWD-402、细胞分裂素N-糖基转移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1）以及参与细胞分裂素跨膜转运的嘌呤透性酶（Purinepermease10）基因表达上调，其余基因均下调表达。表2.5与植物激素相关基因Table2.5DifferentiallyexpressedgenesrelatedtophytohormoneBlasttoRice_AccIDLog2FCFDRE-valueBlast_DescriptionLOC_Os03g17310.1-1.9670.036601.00E-10EffluxcarrierofpolarauxintransportLOC_Os05g44810-1.8150.021682.00E-89IAA8LOC_Os04g43910.1-2.0530.018192.00E-16Auxinresponsefactor10LOC_Os08g23150.1-2.6712.67E-070Indole-3-glycerolphosphatesynthase-likeHydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinateLOC_Os10g238202.4430.0039930hydroxycinnamoyltransferaseLOC_Os07g13800.16.6211.75E-098.00E-146Cytokinin-N-glucosyltransferase1LOC_Os04g497572.2660.039713.00E-109Purinepermease10LOC_Os04g52210.1-4.8031.84E-110Ent-kaurenesynthase-like3LOC_Os06g11630.120.006.52E-051.00E-46TA2protein/F-BOXWITHWD-402LOC_Os01g52050.1-2.7454.61E-050BrassinosteroidLRRreceptorkinase24 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析2.2.2.2光合作用及叶绿素代谢相关基因小麦矮缩病毒侵染以后，寄主叶片中叶绿体超微结构遭到严重破坏，多数小麦植株多数会出现褪绿黄化的症状，这与植物光合作用速率的下降、叶绿素代谢的异常以及膜脂过氧化作用都有密切关系。转录组测序结果表明，差异表达基因中许多都与光合作用以及叶绿素代谢有关，包括光合作用关键酶RuBisCO小亚基及RuBisCO活化酶、捕光色素蛋白复合体I结合蛋白（LHCItypeIVchlorophyllbindingprotein）、参与叶绿素合成的原叶绿素酸酯氧化还原酶（Protochlorophyllidereductase）及叶绿素分解的红色叶绿素代谢产物还原酶（Redchlorophyllcatabolitereductase)、叶绿体前体中的碳酸酐酶（Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor）及非绿质体叶绿体前体中的磷酸丙糖/磷酸转运蛋白（Triosephosphate/phosphatetranslocator,non-greenplastid,chloroplastprecursor）等等。表2.6光合作用及叶绿素相关基因Table2.6DifferentiallyexpressedgenesrelatedtophotosynthesisandchlorophyllBlasttoRice_AccIDLog2FCFDRE-valueBlast_DescriptionRibulose1,5-bisphosphatecarboxylaseLOC_Os12g17600-20.0006.00E-61smallsubunitmRNALOC_Os04g56320.1-1.7340.012841.00E-132RuBisCOactivaseLOC_Os08g33820.1-20.008.31E-041.00E-88LHCItypeIVchlorophyllbindingproteinLOC_Os10g35370-2.2970.045995.00E-125ProtochlorophyllidereductaseBLOC_Os10g25030.14.7062.85E-103.00E-111RedchlorophyllcatabolitereductaseLOC_Os01g45274-20.002.10E-077.00E-77Carbonicanhydrase,chloroplastprecursorLOC_Os01g07730.1-2.3393.86E-049.00E-115Triosephosphate/phosphatetranslocator2.2.2.3植物抗逆反应及基因沉默相关基因、转录因子寄主植物受到病毒侵染以后会启动防御机制以减轻病原造成的危害，例如水杨酸途径、茉莉酸途径、基因沉默途径、抗氧化防护系统、诱导产生病原相关蛋白(PRs)等等。本研究的转录组测序结果中同样检测到了上述抗逆途径中某些基因表达的显著变化，重点筛选了在植物体内活性氧清除等防护系统中发挥重要作用的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）相关基因，siRNA介导的基因沉默中发挥作用的AGO4基因，激活水杨酸途径的WRKY转录因子家族成员WRKYDNA结合蛋白70（WRKYDNA-bindingprotein70）以及对水杨酸刺激做出响应的在细胞间沟通与细胞生长中起重要作用的细胞壁相关激酶（Wall-associatedkinase2）等。25 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析表2.7植物抗逆反应及基因沉默相关基因、转录因子Table2.7Differentiallyexpressedgenesrelatedtogenesilencing,defenseresponseandtranscriptionfactorsBlasttoRice_AccIDLog2FCFDRE-valueBlast_DescriptionLOC_Os08g44770-2.1962.22E-042.00E-80SuperoxidedismutaseLOC_Os08g02110.15.5271.06E-052.00E-149Peroxidase47precursorLOC_Os04g53300.120.000.0073021.00E-28PolyphenoloxidaseLOC_Os01g168702.0730.025400Argonaute4proteinLOC_Os05g40060.13.7346.92E-084.00E-55WRKYtranscriptionfactor48NM_001189956.14.6980.0022029.00E-121Wall-associatedkinase22.2.3荧光定量PCR方法对差异表达基因的验证分别以翻译延伸因子1A（EF-1α）、GTP结合蛋白（GTPB）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、β微管蛋白[TUBβ(Tubb4)]为内参基因，利用qPCR方法对筛选出来的差异表达基因进行验证，在计算基因的相对表达量时采用2-△△Ct法进行分析。2.2.3.1植物激素相关基因的qPCR验证qPCR验证植物激素相关基因差异表达的结果（图2.9）说明促进生长素极性运输的生长素极性运输外流载体（Effluxcarrierofpolarauxintransport）、与色氨酸与吲哚乙酸生物合成有关的吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase）、参与生长素输入过程的信号转导且对侧根发育起正调节作用的生长素响应因子10（Auxinresponsefactor10）、AUX/IAA转录抑制子家族蛋白（IAA8）基因表达均下调，抑制生长素转运和植物生长的羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（Hydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinatehydroxycinnamoyltransferase）基因表达上调；细胞分裂素N-葡萄糖基转移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1）与嘌呤透性酶10（Purinepermease10）基因上调表达反映出被侵染寄主体内细胞分裂素含量的上升；赤霉素合成相关的内根-贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3）以及油菜素内酯信号转导相关的富含亮氨酸重复序列（LRR）油菜素甾醇受体激酶（BrassinosteroidLRRreceptorkinase）基因显著下调，说明病毒侵染抑制了植物赤霉素的生物合成以及油菜素内酯的信号转导，而与脱落酸信号转导相关的F-BOXWITHWD-402基因呈上调表达，这些结果与转录组测序数据完全一致。综合来看，病毒侵染造成寄主小麦体内生长素、赤霉素、油菜素内酯等促进生长发育的激素水平降低，这可能是造成感病植株矮化的重要原因；细胞分裂素与生长素的比例失调，可导致小麦分蘖发生异常。26 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析图2.9qPCR验证植物激素相关差异表达基因Fig.2.9ValidationofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtophytohormonebyqPCR2.2.3.2光合作用及叶绿素代谢相关基因的qPCR验证对qPCR验证植物光合作用及叶绿素代谢相关基因差异表达的结果进行分析（图2.10），表现在光合作用关键酶RuBisCO小亚基异常升高，大小亚基比例失衡，而且RuBisCOactivase基因表达下调影响了RuBisCO活性。参与叶绿素分解的红色叶绿素代谢产物还原酶（Redchlorophyllcatabolitereductase）也上调表达，以上基因的qPCR验证结果与转录组数据一致。然而，参与叶绿素合成的原叶绿素酸酯氧化还原酶（Protochlorophyllidereductase）、与光保护作用有关的捕光色素蛋白复合体I结合蛋白（LHCItypeIVchlorophyllbindingprotein）、叶绿体前体中的碳酸酐27 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析酶（Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor）及非绿质体叶绿体前体中的磷酸丙糖/磷酸转运蛋白（Triosephosphate/phosphatetranslocator,non-greenplastid,chloroplastprecursor）基因均上调表达，qPCR验证结果与转录组数据出现了相反的情况。图2.10qPCR验证光合作用及叶绿素代谢相关的差异表达基因Fig.2.10ValidationofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtophotosynthesisandchlorophyllbyqPCR2.2.3.3植物抗逆反应及转录因子相关基因的qPCR验证qPCR验证植物抗逆反应及转录因子相关基因差异表达的结果（图2.11）说明病毒侵染以后寄主植物体内活性氧清除系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD），参与酚类、木质素合成的多酚氧化酶（PPO）以及细胞生长中起重要作用的细胞壁相关激酶2（Wall-associatedkinase2）基因表达下调，与siRNA介导的基因沉默密切相关的AGO4、植物特有的一类抗性相关转录因子WRKYDNA结合蛋白70（WRKYDNA-bindingprotein70）基因表达上调。值得商榷28 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析的是，在本节验证的相关基因中，仍有一些与转录组数据结果相反，比如过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、细胞壁相关激酶2（Wall-associatedkinase2）基因在转录组测序结果中是上调表达，而qPCR结果却都是下调表达。总的来讲，这些基因的表达变化在一定程度上反映了小麦在受到病毒侵袭以后，会调动体内某些防御机制应对病毒造成的危害。图2.11qPCR验证植物抗逆反应及转录因子相关的差异表达基因Fig.2.11ValidationofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtodefenseresponseandtranscriptionfactorsbyqPCR2.3总结与讨论本研究利用RNA-Seq高通量测序技术对WDV侵染前后的小麦转录组进行深度测序，重点筛选与诱导病毒症状形成相关的差异表达基因以及寄主抗病防御反应途径中的相关基因，转录因子等，利用qPCR方法对转录组测序结果进行分析验证。目的在于从RNA水平揭示病毒诱导症29 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析状形成的致病分子机制、寄主对抗病毒侵染的防卫反应机理以及寄主与病毒之间的互作等。2.3.1WDV诱导寄主矮化症状的原因分析小麦在拔节期前受到病毒侵染会导致植株严重矮化，发病严重者不能抽穗，这是小麦矮缩病重要的症状表现。植物激素作为一类内源调节因子，对植物生长发育具有重要意义。无论是促进细胞及营养器官伸长生长、促进细胞分裂分化、诱导开花结实等的生长素，促进细胞体积增大的细胞分裂素，促进茎秆伸长、抑制衰老的赤霉素，抑制生长的脱落酸以及促进衰老、打破休眠的乙烯，还是新确认的油菜素内酯、水杨酸、茉莉酸和多胺等，它们在调节植物各种生理活动时都不是单一发挥作用的，而是维持几种激素之间的稳态平衡，这其中包括协同作用、增效作用、拮抗作用等。例如，细胞分裂过程是IAA、CTK、GA三种激素协同作用的结果、GA对内源IAA水平的调节作用以及IAA、CTK、GA与ABA之间的相互拮抗作用等。烟草花叶病毒（TMV）复制酶与拟南芥生长素应答基因调节因子PAP1/IAA26互作，超表达PAP1/IAA26的转基因植株受到病毒侵染后不显症状，而且病毒复制酶与植物生长素应答系统互作，从而诱导特定症状的产生（Padmanabhan等，2005）。许多研究已经证实赤霉素在促进植物生长方面具有显著作用，植物病毒与赤霉素合成过程关键酶互作是诱导矮化症状的重要原因，水稻矮缩病毒（RDV）的P2蛋白与内根-贝壳杉烯氧化酶在体内互作，干扰水稻体内赤霉素的生物合成（Zhu等，2005）内根-贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase,KS）催化赤霉素合成的第二步反应，在赤霉素早期合成中极为重要，许多研究已经证实该酶为赤霉素合成中的关键酶（Coram等，2010;Jackson等，2014;Zerbe等，2012）。另外，近年来新发现的新型植物激素油菜素甾醇等在植物生长中突出作用而日益受到关注，相关研究通过蛋白组学以及VIGS技术揭示了油菜素甾醇、茉莉酸等增加棉花黄萎病抗性的机理（Gao等，2013），在病毒侵染过程中，油菜素甾醇一类物质是否有增强植物抗病毒能力的作用，还需要进一步研究和探讨。本研究转录组数据以及后续的qPCR验证都表明，参与生长素合成与运输的生长素极性运输外流载体（Effluxcarrierofpolarauxintransport）、吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase）以及参与信号转导生长素响应因子10（Auxinresponsefactor10）、AUX/IAA蛋白（IAA8）基因表达均显著下调，而抑制生长素转运的羟基肉桂酰辅酶A莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶（Hydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinatehydroxycinnamoyltransferase）基因表达上调；赤霉素合成关键酶内根-贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3），油菜素甾醇信号转导相关的富含亮氨酸重复序列（LRR）油菜素甾醇受体激酶（BrassinosteroidLRRreceptorkinase）基因显著下调。WDV的侵染打破了促进植物生长发育的这几大类激素代谢的稳态平衡，可能是导致小麦植株严重矮化的原因。2.3.2WDV诱导感病寄主分蘖异常的原因分析在田间，受WDV侵染的小麦植株，根部通常可见众多小分蘖的产生，表现为整株丛生，而叶部症状则呈现多样化。本研究采用的WDV分离物来源于陕西韩城，其在温室接种条件下，植株在发生分蘖前已死亡，叶部症状表现为心叶卷曲并有缺刻、早期叶脉黄绿相间，后期叶片黄化。30 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析分蘖发生是小麦重要的农艺性状之一，分蘖过多或过少都会严重影响单产，植物激素在分蘖的发生与衰亡过程中起着关键的作用（Kariali等，2007）。小麦分蘖的发生与其内源IAA和ZR+Z的含量尤其是二者间的比值密切相关，IAA/(ZR+Z)值低，利于分蘖的发生，高则不利于分蘖的发生。细胞分裂素不仅具有促进细胞分裂和分化的作用，还能延迟蛋白质和叶绿素的降解，抑制衰老。研究表明，细胞分裂素基因的引入和表达降低了烟草幼苗对烟草坏死病毒（Tobacconecrosisvirus,TNV）的易感性，提高了其氧化应激的耐受性（Pogany等，2004）。受到马铃薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）侵染后，在易感马铃薯品种中检测到嘌呤环N9位葡糖基化细胞分裂素（Cytokinin-9-Glucosylation）含量有明显的上升，在抗病品种中却观察不到这种现象，这表明PVY侵染以后诱导发生糖基化而造成细胞分裂素不可逆的失活（Dermastia等，1995）。本研究结果表明在WDV侵染后寄主小麦体内催化细胞分裂素糖基化修饰导致其发生不可逆失活的细胞分裂素N-葡萄糖基转移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1）以及促进嘌呤类物质运输的嘌呤透性酶10（Purinepermease10）基因均上调表达。由此推测，病毒侵染以后寄主体内细胞分裂素含量上升，是对抗病毒的一种应激反应，糖基化修饰酶相关基因的上调可能是由于病毒诱导产生，也可能是植物对体内细胞分裂素过量的自我调节反应。综上所述，生长素与细胞分裂素的比例失调，还有ABA的参与，可能是导致感病小麦植株分蘖异常的原因。2.3.3WDV侵染对寄主光合作用的影响病毒的侵染常常造成植物重要的营养器官叶片的黄化褪绿，使光合作用受到抑制，这依然是由于病毒致病因子与植物体内相关蛋白互作造成的，CMV编码的2b蛋白是病毒基因沉默抑制子，该蛋白会造成叶绿体畸形、抑制光合作用基因，从而造成黄化症状的产生，病毒2b突变体毒性减轻（Mochizuki等，2014）。其他研究也表明，病毒的侵染会破坏寄主植物叶绿体的超微结构以及光合作用膜系统的正常运行，从而导致叶绿素代谢的紊乱和光合作用中的关键酶的活性降低等等（Ryslava等，2003;Spoustova等，2013;Wilhelmova等，2005）。本研究中转录组数据的验证结果显示，WDV侵染导致小麦体内光合作用关键酶RuBisCO大小亚基比例失调，RuBisCO活化酶基因表达下调，从而抑制了光合作用。参与叶绿素合成与分解代谢的原叶绿素酸酯氧化还原酶（Protochlorophyllidereductase）、红色叶绿素代谢产物还原酶（Redchlorophyllcatabolitereductase)基因表达均上调，这说明叶绿素代谢是一个错综复杂的过程，是由多个基因共同调控的结果。叶绿体前体中的碳酸酐酶（Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor）及非绿质体叶绿体前体中的磷酸丙糖/磷酸转运蛋白（Triosephosphate/phosphatetranslocator,non-greenplastid,chloroplastprecursor）及捕光色素蛋白复合体I结合蛋白（LHCItypeIVchlorophyllbindingprotein）等基因表达量上升，可能是植物光合作用补救和光保护作用的一种表现。2.3.4WDV侵染以后寄主防御机制的启动本研究还关注了植物抵抗病毒防御机制中的的抗氧化系统、水杨酸途径、基因沉默途径及一些抗病相关转录因子等在病毒侵染后的差异表达变化，研究表明在植物中表达SOD、谷胱甘肽等一类抗氧化物质相关基因，可以使其有效抵御氧化压力等刺激带来的伤害（Lim等，2007;Strohm31 中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒侵染小麦的转录组测序及差异表达基因分析等，2002）。基因沉默是植物用来抵抗外源核酸的入侵一种重要手段，用于调节基因在时间和空间上的表达，利用RNAi技术培育转基因抗病毒植株是目前病毒防治的有效方法，基因沉默中相关基因的表达对于植物抵抗病毒的侵染具有重要意义（Aliyari等，2008;Ding等，2007）。AGO（Argonaute）蛋白家族参与所有已知的小RNA沉默途径，对形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）具有决定作用。编码AGO蛋白家族的基因数量和表达模式在不同的物种有很大差别，在同一物种中，AGO基因家族成员调节植物生长发育过程中的许多不同的代谢通路，并且调控策略也存在差异。本研究结果表明，WDV侵染以后寄主抗氧化系统中的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等基因表达下调，这不利于寄主体内活性氧等氧化物质的清除。AGO4基因表达上调说明被侵染植物体内可能启动了抵抗病毒的基因沉默途径。转录因子WRKYDNA结合蛋白70（WRKYDNA-bindingprotein70）基因表达上调，该类转录因子被认为是水杨酸信号通路中的重要的调节因子，而对茉莉酸途径却起到的是负调节作用，这说明，病毒侵染以后寄主植物通过转录因子的调节作用启动了抗病代谢通路中水杨酸途径，对水杨酸信号响应的细胞壁相关激酶（Wall-associatedkinase2）在细胞生长、细胞壁与细胞质之间的通讯等方面中起重要作用，在病毒侵染后下调表达。综合分析，病毒破坏了寄主体内的抗氧化系统等主要的防御体系，虽然寄主植物也启动了诸如基因沉默、抗病代谢途径等来抵御，但最终还是在这场博弈中败下阵来。32 中国农业科学院硕士学位论文第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析miRNA在植物生长发育过程中起着重要的调控作用，主要是通过抑制靶mRNA转录、翻译或将靶mRNA剪切并促进其降解来发挥功能。本研究利用高通量测序技术对寄主植物小麦体内的miRNA表达情况进行初步研究，通过比较WDV侵染诱导小麦体内miRNA的表达差异，来探究病毒是如何通过影响寄主miRNA的正常表达，从而干扰植物正常生理过程的致病分子机制。对差异表达的miRNA靶基因进行预测，寻找与寄主病程相关的基因，从而根据miRNA调控植物防卫反应相关基因的机制，解析植物免疫途径的发生过程。由于无法获得小麦的全基因组信息，因此本研究只能通过数据库中已有的小麦的miRNA信息作为参考来进行初步分析，未能对新的miRNA进行预测。3.1材料与方法3.1.1材料本研究用于miRNA高通量测序分析的材料与小麦转录组测序分析的相同，相关内容参见第二章。3.1.2方法3.1.2.1miRNA测序原始数据处理（1）测序得到的原始数据（RawReads）分别进行过滤，将得到的有效数据（Cleanreads）mapping到小麦miRNA数据库，所得的mappedreads就是有效测序量。（2）利用国际精确算法Counts进行miRNA表达定量，计算出各个样本的miRNA表达量。3.1.2.2miRNA生物信息分析过程（1）用EB-Seq对实验组与对照组进行比较，筛选得到差异基因及差异miRNA，筛选的标准为log2FC>1或log2FC<-1，P-value<0.05，FDR<0.05。（2）对差异miRNA进行靶基因预测。（3）以靶基因为契合点对差异基因与差异miRNA进行负相关联合分析。（4）根据负相关分析结果，构建miRNA与靶基因调控关系网络。3.2结果与分析3.2.1miRNA表达量的计算及差异表达miRNA的筛选将miRNA测序得到的原始数据进行过滤后，利用BWA软件比对到小麦miRNA数据库，共获得119条已知成熟miRNA的表达量，用PMMR显示出来。利用EB-Seq算法，基于miRNA的Counts计算两组样品之间miRNA表达的差异性，按照上述方法中的筛选标准，对测序得到的数据进行差异表达分析，如表3.1所示，共获得了10条显著差异表达的miRNA，其中上调表达的有2个，下调表达的有8个。33 中国农业科学院硕士学位论文第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析表3.1显著差异表达的miRNATable3.1DifferentiallyexpressedmiRNAPre-miRNAAccIDmiRNASequenceLogStyle2FCFDRNametae-miR171btae-MIR171bttgagccgtgccaatatcacg-1.4110.04636down-regulatedtae-miR5384-3ptae-MIR5384tgagcgcgccgccgtcgaatg-1.5802.614E-06down-regulatedtae-miR531tae-MIR531cgctcgccggagcagcgtgca-1.8007.921E-10down-regulatedtae-miR160tae-MIR160tgcctggctccctgtatgcca-1.0870.002505down-regulatedtae-miR9653btae-MIR9653btggccaaggtctcttgaggct-1.2024.836E-04down-regulatedtae-miR397-5ptae-MIR397tcaccggcgctgcacacaatg1.0020.02029up-regulatedtae-miR1123tae-MIR1123tccgtgagacctggtctcataga-1.7401.293E-08down-regulatedtae-miR169tae-MIR169gggcaagtcaccctgggctacc-3.5460down-regulatedtae-miR9774tae-MIR9774caagatattgggtatttctgtc-1.5093.529E-07down-regulatedtae-miR2275-3ptae-MIR2275tttggtttcctccaatatctcg2.4194.804E-11up-regulated3.2.2差异表达miRNA的靶基因预测植物体内成熟的miRNA是由较长的初级转录物经过核酸酶剪切加工而产生，然后组装进RISC（RNA诱导的基因沉默复合体）中，通过碱基互补配对的方式识别靶基因，并且根据互补程度引导RISC执行抑制靶mRNA的翻译或者促进靶mRNA的降解的功能。以显著差异表达的miRNA为研究对象，利用psTarget进行靶基因的预测。从表3.2分析可知，同一个miRNA可以有多个不同代谢通路上的靶标基因，tae-miR160的靶标基因是生长素响应因子、微管蛋白折叠辅因子、钾离子转运子；tae-miR9653b的靶标基因有生长素响应因子、脂氧合酶；tae-miR397-5p的靶标基因是水解酶及转导蛋白；tae-miR5384-3p的靶标基因是细胞色素P450；tae-miR531的靶标与液泡以及液泡膜蛋白相关。此外，比较值得一提的是，tae-miR9774以及tae-miR2275-3p的靶标基因涉及到一些植物抗病相关蛋白，而且这两种miRNA的表达差异趋势并不一致，这说明miRNA对靶标基因的调控作用是一个相对复杂的过程，可能涉及到更多的调控因子的参与。34 中国农业科学院硕士学位论文第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析表3.2差异表达miRNA的靶基因预测Table3.2PredictedtargetofdifferentiallyexpressedmiRNAAccIDPredictedTargetmiRNA_aligned_fragmentInhibitiontae-miR5384-3pCytochromeP450familyproteinUGAGCGCGCCGCCGUCGAAUGTranslationFACTcomplexsubunitSPT16UGAGCGCGCCGCCGUCGAAUGTranslationtae-miR531Vacuolarprotein-sortingprotein45CGCUCGCCGGAGCAGCGUGCCleavageTonoplastmembraneintegralCGCUCGCCGGAGCAGCGUGCTranslationproteinZmTIP3-1tae-miR160Auxinresponsefactor16UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCCleavageTubulinfoldingcofactorUGCCUGGCUCCCUGUAUGCCACleavagePotassiumtransporterUGCCUGGCUCCCUGUAUGCCCleavagetae-miR9653bLipoxygenase3UGGCCAAGGUCUCUUGAGGCUTranslationAuxinresponsefactor6UGGCCAAGGUCUCUUGAGGCUCleavagetae-miR397-5pHydrolaseUCACCGGCGCUGCACACAAUCleavageTransducinfamilyproteinUCACCGGCGCUGCACACAAUCleavageRubberelongationfactorfamilytae-miR1123UCCGUGAGACCUGGUCUCAUAGATranslationproteintae-miR169UnknownproteinGGGCAAGUCACCCUGGGCUATranslationtae-miR9774SNF1-relatedproteinkinaseCAAGAUAUUGGGUAUUUCUGCleavageNB-ARCdomain-containingCAAGAUAUUGGGUAUUUCUGCleavagediseaseresistanceproteinUbiquitin-likemodifier(SUMO)CAAGAUAUUGGGUAUUUCUGTranslationE3ligaseThiol-activatedcytolysinfamilytae-miR2275-3pUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUCGTranslationproteinTransposableelementgeneUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUCGCleavagePentatricopeptiderepeatUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUTranslationResistanceproteincandidateUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUCleavage35 中国农业科学院硕士学位论文第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析3.2.3差异基因与差异miRNA的负相关联合分析以靶基因预测结果为契合点，对miRNA与转录组测序获得的mRNA差异分析结果进行负相关联合分析。利用miRNA对于预测得到靶基因的负调控作用，即miRNA差异上调，其相应靶基因差异下调，miRNA差异下调，其相应靶基因差异上调，之后对负相关分析的基因进行GO功能注释。从表3.3中分析结果表明，tae-miR1123负调控的靶标指向橡胶延伸因子蛋白家族[Rubberelongationfactorfamilyprotein(REF)]和另一未知基因，相关研究表明，REF具有淀粉样蛋白特性，不仅与天然橡胶的合成及凝固有关，还参与植物防卫反应及压力应激反应（Berthelot等，2012）。tae-miR5384-3p的靶基因是FACTcomplexsubunitSPT16和细胞色素P450蛋白家族（CytochromeP450familyprotein，CYP450），2013年MariaHondele等在Nature发表文章指出，组蛋白伴侣FACT识别组蛋白H2A和H2B，在转录、复制和DNA修复过程中有重要作用，FACT的Spt16M伴侣区域与H2A-H2B二聚物之间可以形成复合物，Spt16M会阻断H2B与DNA的相互作用，这有利于解释FACT使核小体失去稳定性的原因（Hondele等，2013）。众所周知，植物CYP450在植物激素、甾醇、黄酮类、萜类等生物合成中发挥重要作用，还参与外源化合物的代谢解毒；tae-miR2275-3p的靶标指向转座子基因和三角状五肽重复蛋白（Pentatricopeptiderepeat，PPR），PPR在水稻中由YSA编码，在幼叶和茎秆中高表达，其表达受光调节，突变体ysa在3叶期以前出现白化叶片，之后逐渐变绿，到6叶期完全恢复到正常绿色，分析表明突变体叶色的改变是由于叶绿素含量以及叶绿体发育的变化造成的（Su等，2012）；tae-miR160的靶标基因为高亲和性钾离子转运蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter）；tae-miR9774的靶标基因为含有NB-ARC结构域的抗病相关蛋白（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein），该蛋白参与细胞凋亡及防卫反应。表3.3显著差异表达的miRNA与差异基因联合分析Table3.1ConjointanalysisofdifferentiallyexpressedmiRNAandtargetgenesmiRNA-AccIDLog2FCFDRmiRNA-StylePredictedTargetLog2FCFDRmRNA-Styletae-miR1123-1.7401.293E-08down-regulatedUnknownprotein2.4420.02414up-regulatedRubberelongationfactortae-miR1123-1.7401.293E-08down-regulated2.2500.005811up-regulatedfamilyproteinCytochromeP450familytae-miR5384-3p-1.5802.614E-06down-regulated2.9471.328E-13up-regulatedproteinFACTcomplexsubunittae-miR5384-3p-1.5802.614E-06down-regulated3.0880.0002921up-regulatedSPT16tae-miR2275-3p2.4194.804E-11up-regulatedTransposableelementgene-3.5798.575E-13down-regulatedtae-miR2275-3p2.4194.804E-11up-regulatedPentatricopeptiderepeat-1.5840.04964down-regulatedtae-miR160-1.0870.002505down-regulatedPotassiumtransporter1.9910.03173up-regulatedNB-ARCdomain-containingtae-miR9774-1.5093.529E-07down-regulated4.9691.777E-06up-regulateddiseaseresistanceprotein36 中国农业科学院硕士学位论文第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析3.2.4miRNA调控靶基因的网络构建为了更直观地了解miRNA调控靶基因相关关系，对差异基因与差异miRNA负相关联合分析结果进行网络构建，见图3.1。图3.1miRNA调控靶基因网络构建Fig.3.1miRNATargetNetwork注：红色表示上调表达，绿色表示下调表达，表示负调节作用3.3总结与讨论本研究利用RNA-Seq高通量测序技术，分析了WDV侵染下小麦体内miRNA的差异表达情况，获得了119条已知miRNA的表达量，经差异表达分析后得到了10条显著差异表达的miRNA。靶基因的预测以及GO功能注释的结果表明，这些受到miRNA调控的靶标基因基因主要是生长素响应因子、微管蛋白折叠辅因子、钾离子转运子、脂氧合酶、水解酶、转导蛋白、细胞色素P450、液泡以及液泡膜蛋白，还有一些植物抗病相关蛋白等。以靶基因预测结果为契合点，对miRNA与转录组数据中mRNA差异分析结果进行了负相关联合分析，结果获得了一些重要的调控信息。例如，受tae-miR5384-3p调控的FACTcomplexsubunitSPT16在转录、复制以及DNA修复方面发挥重要作用，CYP450在生物合成以及代谢解毒中发挥重要作用；受tae-miR2275-3p调控的三角状五肽重复蛋白（Pentatricopeptiderepeat，PPR），与植物叶片内叶绿素含量以及叶绿体发育过程密切相关，该miRNA还参与调节转座子基因的表达；受tae-miR1123调控的Rubberelongationfactor（REF）与植物防卫反应及压力应激反应有关。WDV诱导寄主小麦miRNA差异表达分析，反映出植物受到病毒侵染以后生理活动的变化过程，同时也为解析病毒致病的分子机制提供重要参考。tae-miR160的靶标基因为高亲和性钾离子转运蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter），钾元素有助于提高植物抗逆性，还能够改善光合作用、调节植物激素水平，防止早衰；tae-miR9774的靶标基因为含有NB-ARC结构域的抗病相关蛋白37 中国农业科学院硕士学位论文第三章小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA差异表达的初步分析（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein），该蛋白不仅参与细胞凋亡，还参与植物的一系列防卫反应。需要特别说明的是，本章对小麦矮缩病毒侵染诱导寄主miRNA的差异表达进行了初步分析，后续工作还包括新的miRNA预测以及Northernblot等实验证据的完善和补充。38 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建病毒致病因子通过与寄主植物代谢通路上的蛋白互作，干扰植物基因正常表达，从而改变植物正常的生理生化过程，上一章通过RNA-Seq深度测序技术对WDV侵染导致的转录组差异表达情况进行分析，为揭示病毒致病机理提供依据和新的思路。侵染性克隆是研究植物病毒致病分子机制、构建病毒过量表达载体和病毒诱导的基因沉默载体的重要研究工具。为了进一步研究WDV的致病性，本章试图构建小麦矮缩病毒中国分离物的侵染性克隆，通过农杆菌介导法在适生寄主小麦上建立侵染体系，并通过症状观察法、PCR法、介体传毒法等对其侵染性进行验证。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1毒源与植物材料WDV病毒分离物和传毒介体异沙叶蝉均来源于陕西韩城，由本实验室在高感小麦矮缩病的小麦品种扬麦12号上繁殖与饲养。4.1.1.2菌株、载体及试剂大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105、植物双元表达载体pLH9000均由本实验室保存，中间克隆载体pGEM®-TEasyVectorSystems、T4DNA连接酶、Wizard®SVGelandPCRClean-UpSystem购自Promega公司，限制性内切酶购自NEB公司，ExTaq®、rTaq酶、dNTPs、DNAMarker等购自TaKaRa公司，illustra™TempliPhi™100AmplificationKit购自GEHealthcare公司，FastAPThermosensitiveAlkalinePhosphatase购自ThermoScientific公司，其它试剂均购自国内生化试剂厂商。4.1.2方法4.1.2.1CTAB法提取小麦叶片总DNA将采自陕西韩城等生态区的小麦矮缩病样品，按照经典的CTAB法提取小麦叶片总DNA，用于WDV的检测，常规PCR检测所用的引物信息见附录。（1）取小麦叶片0.1g，加液氮充分研磨后移入2ml灭菌离心管；（2）向样品粉末中加入900μlCTAB裂解液，65℃温浴1h，期间不时地颠倒混匀4-5次；（3）取出后置于冰上冷却5min，加入500μl氯仿：异戊醇（24：1）混合物，涡旋混匀；（4）冷冻离心机中以12000rpm，4℃，离心15min；（5）小心吸取600μl上清液，置于新的1.5ml灭菌离心管中，加入8μlRNase(10mg/ml)，轻轻涡旋混匀，37℃放置2h；（6）加入1/10体积3M醋酸钠与等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃静置30min以上；（7）冷冻离心机中以12000rpm，4℃，离心15min；（8）弃上清，向沉淀加入1ml预冷的70%无水乙醇小心洗涤，重复2次；39 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建（9）冷冻离心机中以12000rpm，4℃，离心10min；（10）弃上清，真空干燥仪中干燥沉淀，加入40-60μl灭菌ddH2O溶解，-20℃保存备用。表4.1CTAB裂解液Table4.1CTABlysisbuffer试剂加入量终浓度1MTris-HCl（pH8.0）10ml100mM0.5MEDTA（pH8.0）4ml20mM5MNaCl（pH8.0）28ml1.4MCTAB2g2%（wv）灭菌ddH2O至总体积100ml4.1.2.2PCR反应体系10×PCRBuffer2.5µldNTP2.0µlPrimer5′（5µM）1.0µlPrimer3′（5µM）1.0µlDNA聚合酶0.2µlDNA1.0µlddH2O17.3µl总体积25.0µl上述混合溶液置于入PCR仪中扩增，反应条件如下所示。反应结束后，取适量加入LoadingBuffer的PCR产物，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。95℃预变性4min95℃变性30s温度视引物而定退火45s34个循环72℃延伸1min72℃再延伸10min10℃保存4.1.2.3PCR扩增产物的回收、连接及转化PCR扩增产物的回收纯化按照Wizard®SVGelandPCRClean-UpSystem说明书进行：（1）PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶，将胶块置于1.5ml灭菌离心管中，按1：1加入溶胶液，65℃放置10min直至胶块完全溶解；40 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建（2）回收柱放入收集管中，将溶胶混合液完全加入柱中，室温静置1min；（3）12000rpm离心1min，弃废液，重新将柱子放回收集管中；（4）加入700µl洗膜液，12000rpm离心1min，弃废液，重新将柱子放回收集管中；（5）加入500µl洗膜液，12000rpm离心1min，弃废液，重新将柱子放回收集管中；（6）12000rpm离心2min，至酒精挥发；（7）将柱子转移至1.5ml离心管中，加入50µl灭菌ddH2O后室温静置1min；（8）12000rpm离心1min，弃柱子，回收产物于-20℃保存备用。PCR回收产物的连接按照pGEM®-TEasyVectorSystems的说明书进行。本研究采用热激法进行连接产物转化大肠杆菌的操作，步骤如下：（1）10µl连接产物加入到50µl感受态细胞中，轻轻混匀；（2）冰浴30min，42℃热激45s-90s，冰浴2min；（3）向离心管中加入500µl液体LB培养基，37℃，200rpm摇培1h；（4）将100-200µl菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上；（5）37℃，培养10h左右。4.1.2.4质粒提取及酶切体系大肠杆菌质粒提取按照Axygen公司的质粒小提试剂盒说明书进行，重组质粒需要经过酶切鉴定，体系如下：10×CutSmartBuffer5.0µl限制性内切酶1.0µl质粒DNA2.0µgddH2O加至总体积50.0µl4.1.2.5载体构建策略利用双元植物表达载体pLH9000（图4.1），将1.42倍正向串联重复的WDV序列连入表达载体，主要分为以下步骤：（1）含有WDV-LIR（长基因间隔区）短片段病毒序列的克隆，长度为WDV全长的0.42倍；（2）将病毒短序列连入双元表达载体pLH9000多克隆位点，获得重组质粒pLH9000-0.42V；（3）滚环扩增获得WDV全长序列；（4）将线性化的WDV全长序列连入重组质粒pLH9000-0.42V中；（5）筛选获得具有正确插入取向的重组表达载体pLH9000-1.42V。41 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建图4.1pLH9000载体示意图Fig.4.1SketchmapofpLH9000vector4.1.2.5.1重组质粒pLH9000-0.42V的获得以WDV阳性材料的DNA为模板，利用ExTaq®高保真酶，以0.4V-HindIII-F与0.4V-BamHI-R为引物（见附录），扩增包含病毒LIR（长基因间隔区）的短片段，称为0.42V，此片段在原病毒序列3′引入BamHI酶切位点，以便于重组载体的构建。将该片段回收后连入中间克隆载体pGEM®-TEasyVector，转化大肠杆菌后筛选并提取阳性质粒，BamHI和HindIII双酶切上述重组克隆载体，获得具有双酶切位点的插入片段。将上述片段回收纯化后插入同样BamHI和HindIII双酶切的双元植物表达载体pLH9000中，获得阳性重组质粒pLH9000-0.42V。4.1.2.5.2侵染性克隆表达载体pLH9000-1.42V的获得以WDV病毒基因组DNA为模板，利用illustra™TempliPhi™100AmplificationKit扩增得到1倍全长的病毒序列，HindIII将滚环复制得到的扩增产物线性化，线性化后的WDV全长序列与同样单酶切的并经去磷酸化处理的pLH9000-0.42V重组载体进行连接。由于这一步是单酶切策略构建载体，因此插入片段具有正反两个插入取向，为此本研究设计了一对插入取向检测引物（引物Orient-F与Orient-R），引物设计原则是：下游引物包含载体（短插入片段一侧）部分序列，上游引物设计在长插入片段内部，如果WDV全长序列插入方向正确，通过PCR反应便可得到2100bp的扩增片段，如果插入序列方向相反或未成功插入载体中，则不能扩增产生片段。如此一来就可以得到含有1.42个病毒正向串联重复序列结构的侵染性克隆表达载体pLH9000-1.42V，见图4.2。42 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建图4.2插入取向检测引物设计示意图Fig.4.2Designmentofprimerstocheckinsertorientation滚环扩增的具体操作步骤如下：（1）取1µlDNA模板加入到5µl样品缓冲液中；（2）上述混合液于95℃加入变性3min，立即置于冰上冷却；（3）向体系中加入5µl反应缓冲液及0.2µl酶混合物，轻轻混匀；（4）30℃条件下反应18h，65℃放置10min终止反应；（5）获得的扩增产物于-20℃保存备用。线性化质粒末端去磷酸化的操作步骤如下：（1）按照以下方法配制预混液：LinearDNA1.0µg10×reactionbuffer2.0µlFastAPThermosensitiveAlkalinePhosphatase1.0µlddH2O至20.0µl（2）轻轻混匀，于37℃孵育10min；（3）75℃放置5min终止反应。4.1.2.6农杆菌感受态制备及质粒转化农杆菌感受态的制备按照以下步骤操作：（1）将农杆菌单菌落接于1mlLB液体培养基中（含25µg/ml利福平），28℃摇培过夜；（2）取适量菌液接于50mlLB液体培养基中（含25µg/ml利福平），28℃摇培至OD600达到0.5；（3）4000rpm离心10min收集菌体，弃上清；（4）向菌体中加入30ml0.15mol/LNaCl，充分悬浮细胞后冰浴30min；（5）冷冻离心机中以4000rpm，4℃离心10min，弃上清；（6）向菌体中加入1ml预冷的含有15%甘油的20mmol/LCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞；（7）分装制备感受态细胞，液氮速冻后置于-80℃保存备用。采用冻融法将重组质粒导入农杆菌感受态细胞中，具体步骤如下：（1）将1µl质粒加入到100µl农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；43 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建（2）冰浴30min后于液氮中速冻1min，30℃放置5min；（3）加入400µl液体LB培养基，28℃摇培4h；（4）将100µl菌液涂布于LB固体平板培养基上（含25µg/ml利福平与100µg/ml卡那霉素）；（5）28℃培养36h左右，用菌落PCR法鉴定出阳性菌落；（6）阳性菌落划线可以保存1个月左右。4.1.2.7农杆菌介导的WDV适生寄主（小麦）侵染体系的建立将构建在植物表达载体上的WDV侵染性克隆表达载体通过冻融法导入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中。将阳性菌落在含有卡那霉素与利福平的固体平板上划线培养2天，备用。采用固体菌落针刺法对高感小麦矮缩病的扬麦12号初萌发的小麦种子进行刺伤接种，具体做法是：用抹刀刮取适量菌体在胚部或胚部附近涂抹均匀，以昆虫针按不同角度针刺3~4次，接种后的小麦种子于28℃暗培养24h，转入18-22℃恒温培养箱培养，光照时间16h，每批接种80~100株，观察接种材料发病情况。同时，以含有pLH9000空载体的农杆菌接种作为阴性对照。4.1.2.8病毒侵染活性验证对于侵染性克隆接种后的适生寄主小麦，采用PCR法检测病毒、并用介体传毒法方法验证病毒生物学活性。介体传毒方法主要是利用具有典型症状的小麦病株对无毒异沙叶蝉进行饲毒，3天后将介体昆虫转移至一心一叶的健康小麦植株上，观察植株的症状表现。4.2结果与分析4.2.1侵染性克隆表达载体的构建4.2.1.1重组质粒pLH9000-0.42V的构建及酶切鉴定利用BamHI与HindIII两个限制酶，从连接了0.42V短片段的重组质粒pGEM-T-0.42V上，双酶切获得含有两个不同黏性末端的序列片段。将0.42V短片段连接到同样双酶切的表达载体pLH9000上，即重组质粒pLH9000-0.42V的获得同样需要进行酶切鉴定。从图4.3（A）可以看出，以WDV阳性材料DNA为模板，PCR扩增获得了两端具有HindIII与BamHI酶切位点的短序列片段0.42V，经T-A克隆后送生工生物工程有限公司测序，序列比对显示与原始序列完全一致。图4.3（B）表明利用HindIII与BamHI双酶切重组载体pGEM-T-0.42V，获得了长度为1150bp的两端含有不同黏性末端的DNA短片段。图4.3（C）表示利用HindIII与BamHI双酶切鉴定重组载体pLH9000-0.42V，重新获得了9120bp的空载体与长度为1150bp的插入片段，说明插入片段已经成功连入到了表达载体中（图4.4）。44 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建(A)(B)(C)图4.3重组质粒pLH9000-0.42V的构建及酶切鉴定Fig.4.3ConstructionofrecombinantplasmidpLH9000-0.42Vanditsidentificationbyrestrictionenzymedigestion(A)M：DL2000Marker；泳道1-2：PCR扩增获得的WDV短片段0.42V(B)M：DL5000Marker；泳道1-2：重组质粒pGEM-T-0.42V双酶切图(C)M：DL15000Marker；泳道1：质粒pLH9000双酶切图；泳道2：WDV短片段0.42V；泳道3：重组质粒pLH9000-0.42V酶切鉴定图；(A)M:DL2000Marker;Lane1-2:PCRampliconofWDVnamed0.42V(B)M:DL5000Marker;Lane1-2:RestrictionenzymedigestionofrecombinantplasmidpGEM-T-0.42V(C)M:DL15000Marker;Lane1:RestrictionenzymedigestionofpLH9000;Lane2:PCRampliconofWDVnamed0.42V;Lane3:RestrictionenzymedigestionofrecombinantplasmidpLH9000-0.42V图4.4pLH9000-0.42V载体示意图Fig.4.4SketchmapofpLH9000-0.42Vvector4.2.1.2植物表达载体pLH9000-1.42V的初步构建以WDV病毒环状DNA为模板通过滚环扩增（RCA）得到的产物是高分子量的线性双链，是加入模板即WDV全长序列的串联重复拷贝，利用HindIII单酶切RCA扩增产物，获得了1倍45 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建WDV长度即2750bp的全基因组序列片段，此片段两端均为HindIII酶切形成的黏性末端，见图4.5（A）。从图4.5（B）可以观察到，用HindIII将重组质粒pLH9000-0.42V线性化之后，得到的条带大小为10284bp，与预期的载体长度一致。由于线性化载体pLH9000-0.42V由单酶切获得，极易发生载体自连现象，需要对其进行末端去磷酸化处理，具体操作见4.1.1.5.2。(A)(B)图4.5滚环扩增产物及重组载体pLH9000-0.42V的线性化Fig.4.5DigestionofampliconofRCAandrecombinantplasmidpLH9000-0.42VbyHindIII(A)M：DL5000Marker；泳道1-2：HindIII将RCA扩增产物线性化后电泳图M:DL5000Marker;Lane1-2:AmpliconofRCAwasdigestedbyHindIII(B)M：DL15000Marker；泳道1-2：HindIII将重组质粒pLH9000-0.42V线性化后电泳图M:DL15000Marker;Lane1-2:DigestionofrecombinantplasmidpLH9000-0.42VbyHindIII4.2.1.3正确表达载体pLH9000-1.42V的筛选与酶切鉴定将线性化后的WDV全长序列与末端去磷酸化后的载体pLH9000-0.42V进行连接时，会出现正反两种插入取向，只有通过后期筛选，才能获得具有正确插入取向的重组表达载体。连接产物转化大肠杆菌，利用设计的插入取向检测引物进行菌液PCR检测。图4.6显示，挑取的30个单克隆中筛选到了7个正向插入的阳性克隆，含有阳性克隆的菌液摇培提取质粒，便获得了侵染性克隆表达载体pLH9000-1.42V。将获得的表达载体分别利用HindIII单酶切鉴定以及利用HindIII与BamHI进行双酶切鉴定，结果表明，利用HindIII单酶切重组质粒，重新分离出了2750bp的WDV基因组序列全长的插入片段，利用HindIII与BamHI进行双酶切时，切出了三条带，分别为9120bp的空载体、2750bp的WDV全长序列片段以及1150bp较短的插入片段（0.42V），见图4.7。酶切鉴定的结果显示，已经成功地将总长1.42倍WDV正向串联重复序列插入到了表达载体pLH9000的多克隆位点之中（图4.8），可以利用该载体进行后续的侵染性试验。46 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建图4.6重组载体pLH9000-1.42V的菌液PCR鉴定Fig.4.6IdentificationofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyPCRM：DL2000Marker；泳道1-30：重组质粒转化后菌液PCR；31：阴性对照M:DL2000Marker;Lane1-30:PCRampliconsaftertransformationofrecombinantplasmid;31:Negativecontrol图4.7重组质粒pLH9000-1.42V的酶切鉴定Fig.4.7IdentificationofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyrestrictionenzymedigestionM：DL15000Marker；泳道1：重组质粒pLH9000-0.42V；泳道2：WDV全长插入片段；泳道3：HindIII单酶切鉴定重组质粒pLH9000-1.42V；泳道4：HindIIIandBamHI双酶切鉴定重组质粒pLH9000-1.42VM:DL15000Marker;Lane1:RecombinantplasmidpLH9000-0.42V;Lane2:GenomesequenceofWDV;Lane3:DigestionofpLH9000-1.42VbyHindIII;Lane4:DigestionofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyHindIIIandBamHI47 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建图4.8pLH9000-1.42V载体示意图Fig.4.8SketchmapofpLH9000-1.42Vvector4.2.1.4冻融法转化质粒采用冻融法将侵染性克隆表达载体导入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，利用菌落PCR法筛选阳性克隆（图4.9），空载体转化作为阴性对照，摇培24h划线培养2天，备用。采用固体菌落针刺法对初萌发的高感小麦矮缩病的扬麦12号小麦种子进行刺伤接种。图4.9重组质粒pLH9000-1.42V转化农杆菌后的菌落PCRFig.4.9PCRampliconsaftertransformationofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VM：DL5000Marker；泳道1-9：重组质粒转化后菌落PCR；泳道10：阴性对照M:DL5000Marker;Lane1-9:TocheckrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyPCR;Lane10:Negativecontrol4.2.2农杆菌针刺法侵染小麦及病毒检测用含有WDV侵染性克隆的菌体接种感病小麦（扬麦12号），实验结果显示农杆菌介导的病毒侵染性克隆接种20天后，部分小麦植株较之健康对照表现出了明显的生长迟缓、叶片黄化褪绿症状，持续观察发现新抽出幼嫩的心叶有缺刻现象，这些症状表现初步证实寄主受到了病毒的侵染（图4.10）。48 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建mockpLH9000-1.42V(A)(B)(C)图4.10农杆菌介导的pLH9000-1.42V接种小麦第20天后的症状表现（黄化、叶心缺刻、矮化）Fig.4.10Symptoms(chlorosis,incisionandstuntedgrowth)inducedbyagroinfectiousviralcloneonwheatat20dpi4.2.2.1生物学验证49 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建WDV侵染性克隆接种后的发病植株经介体异沙叶蝉传毒后，健康小麦植株上同样出现了WDV的典型症状（图4.11），柯赫氏法则的完成进一步说明适生寄主（小麦）侵染性克隆体系建立成功。图4.11经异沙叶蝉传毒后的小麦症状表现Fig.4.11SymptomsinwheatsaftertransmittingvirusfrominfectedplantstohealthyonesbyPsammotettixstriatusL.4.2.2.2接种小麦的分子检测利用检测WDVCP基因的特异性引物（WDV-CP-F与WDV-CP-R）对生物学症状明显的小麦做分子检测，结果表明，具有典型症状的植株中均能扩增出783bp的目的条带（图4.12）。第一批接种120株，成活105株，具有典型症状的有7株；第二批接种100株，成活81株，具有典型症状的9株。第三批接种160株，成活143株，具有典型症状的10株。综合接种植株的症状表现、介体传毒以及分子检测结果，本研究所建立的农杆菌介导的WDV侵染性克隆的接种效率为6.7%-11.1%。图4.12PCR检测侵染性克隆接种后症状明显的小麦Fig.4.12PCRdetectionofWDVinthesymptomaticwheatsM：DL2000DNAMarker；1-10：用引物WDV-CP-F和WDV-CP-R扩增WDV特异片段；11：阴性对照；12：阳性对照M:DL2000DNAMarker;1-10:PCRfragmentswiththeprimersWDV-CP-FandWDV-CP-R;11:Negativecontrol;12:Positivecontrol50 中国农业科学院硕士学位论文第四章小麦矮缩病毒中国分离物侵染性克隆的构建4.3总结与讨论初期阶段关于WDV的研究多集中于将其作为病毒载体表达外源基因或作为植物DNA病毒的模式生物进行细胞调控等方面的基础研究（Collin等，1996;Gooding等，1999;Hofer等，1992;Laufs等，1990;Matzeit等，1991;Timmermans等，1992）。然而，随着该类病毒病害在世界范围内的日益猖獗，有关病毒致病分子机制方面的研究越来越受到人们的关注。农杆菌介导的侵染性克隆在研究植物病毒致病机制、交叉保护以及病毒诱导的基因沉默方面发挥了重要作用，尤其对于小麦矮缩病毒这类无法通过摩擦接种实现传毒的植物病毒来讲，更是不可或缺的研究工具。前人研究发现不同地区的小麦矮缩病毒分离物，其基因组序列存在很大差异（Koklu等，2007;Kundu等，2009;Kvarnheden等，2002;Schubert等，2014;Tobias等，2011）。病毒在与寄主植物以及传播介体的长期相互作用中形成了不同的进化机制，也导致了致病性方面的差异，这使得构建不同地区分离物的侵染性克隆十分必要。本研究基于WDV陕西韩城分离物，利用植物双元表达载体pLH9000构建了一个含有病毒1.42倍全长序列的侵染性克隆表达载体，命名为pLH9000-1.42V，通过固体菌落针刺法建立农杆菌介导的适生寄主（小麦）侵染体系，采用PCR方法以及介体传毒法对接种后小麦植株病毒侵染情况进行检测。综合分析多次接种及检测的结果，本研究建立的农杆菌介导的WDV侵染性克隆的接种效率为6.7%-11.1%，影响侵染性克隆接种效率的因素主要有以下几点：（1）与接种受体小麦的基因型有关。本研究中用于接种的小麦品种为高感小麦矮缩病的扬麦12号，温室内经异沙叶蝉传毒，发病率100%，另外，该品种还高感叶锈病，中感条锈病和纹枯病。（2）与农杆菌有关。农杆菌介导法成功的前提是携带重组质粒的农杆菌首先需要侵染小麦，本研究选用的农杆菌菌株EHA105为超毒菌株，侵袭力较强，有利于农杆菌介导的侵染性克隆体系的成功建立。（3）与接种时小麦胚部的生长状态及刺伤程度有关。由于本研究利用的是含有WDV侵染性克隆的固体菌落针刺法来进行接种，接种部位是小麦的幼胚，因此胚部的生长状态对于接种效果来讲至关重要，接种时期过早或过晚均不能达到理想的效果。另外，利用昆虫针透过固体菌落刺伤胚部的过程很容易造成小麦胚伤害过度，导致幼苗的死亡。在实验的过程中，还发现有一部分接种后的小麦植株出现分蘖异常增多的现象，但未显现出病毒病其他的症状，推测这可能只是由于胚部受到机械刺伤后的一种表现。本研究建立了农杆菌介导的WDV中国分离物侵染性克隆，通过PCR和介体传毒法验证了侵染性克隆在适生寄主小麦的活性，接下来在如何提高侵染效率等方面还需要进一步深入地研究。51 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论与展望第五章全文结论与展望5.1结论1.利用RNA-Seq高通量测序技术对WDV侵染下的小麦转录组表达情况进行深度测序，通过数据拼接与聚类分析，共获得了77221条基因注释可信度较高的unigene。比较感染病毒组与健康对照组，共获得了4324个显著表达差异的基因，其中上调表达的基因有2136个，下调表达的基因有2188个，这些基因在植物体内主要参与老化、植物激素代谢、光合作用、抗氧化等多个生物学过程。2.为了揭示WDV诱导寄主症状形成的原因，从转录组分析数据中筛选出10个植物激素代谢相关、7个光合作用相关及6个植物防卫反应途径相关的差异表达基因进行qPCR验证。根据实验结果推论，WDV侵染造成小麦植株严重矮化的原因可能是病毒打乱了植物体内各种激素之间的动态平衡关系，具体表现为促进赤霉素、生长素、油菜素甾醇等合成或积累的相关基因下调表达，而抑制这类激素运输的某些基因上调表达。感病小麦分蘖的异常可能与细胞分裂素、脱落酸代谢的变化有关。WDV的侵染导致光合作用关键酶RuBisCO活性下降，而叶绿素合成与分解代谢中的某些基因的差异表达变化表明感病小麦体内叶绿素代谢的紊乱，这些都可能导致叶片褪绿黄化症状的发生。另外，本研究证实植物启动了水杨酸途径、基因沉默途径等来抵御病毒的侵染，然而在感染病毒的寄主体内一些参与植物防卫反应的相关基因如POD、SOD、PPO表达水平下降，这种现象在一定程度上意味着植物的某些防御体系可能已经被病毒攻破。3.利用RNA-Seq高通量测序技术，分析了WDV侵染诱导小麦体内miRNA的表达差异，结果显示这些受到miRNA调控的靶标基因主要是生长素响应因子、微管蛋白折叠辅因子、水解酶、抗病相关蛋白等。将miRNA与mRNA差异分析结果进行负相关联合分析，结果获得了一些重要的调控信息：受tae-miR5384-3p调控的FACTcomplexsubunitSPT16在转录、复制以及DNA修复方面发挥重要作用，受其调节的CYP450在植物体内参与植物激素、萜类、黄酮类等化合物的生物合成以及外源化合物的代谢解毒；受tae-miR2275-3p调控的Pentatricopeptiderepeat（PPR）与植物叶片内叶绿素含量以及叶绿体发育过程相关，此外该miRNA还参与调节转座子基因的表达；受tae-miR1123调控的Rubberelongationfactor（REF）参与植物防卫反应；tae-miR160的靶标基因为高亲和性钾离子转运蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter）；tae-miR9774的靶标基因为含有NB-ARC结构域的抗病相关蛋白（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein），该蛋白参与细胞凋亡以及植物的一系列防卫反应。WDV诱导寄主小麦miRNA差异表达分析，解析了植物受到病毒侵染以后代谢路径的变化过程，也为研究病毒致病机理提供依据。4.本研究利用植物双元表达载体pLH9000构建了一个含有病毒1.42倍全长序列的侵染性克隆表达载体pLH9000-1.42V，以针刺法接种小麦，分别利用PCR检测法和介体传毒法对接种小麦进行检测和验证，建立了农杆菌介导的WDV适生寄主（小麦）侵染体系。结果表明，所建立的WDV侵染性克隆可以在寄主上发生系统侵染，这也为探究植物病毒致病分子机制、构建病毒过量表达载体和病毒诱导的基因沉默载体提供了重要的研究工具。52 中国农业科学院硕士学位论文第五章全文结论与展望5.2展望（对后续研究工作的展望）1.在症状形成相关的基因中，吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase）以及内根-贝壳杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3）分别是生长素以及赤霉素合成过程的关键酶，WRKY蛋白家族是植物特有的一类抗性相关的转录因子，在siRNA介导的基因沉默中发挥重要作用的AGO4基因等，有必要对这些基因进行功能验证。主要的技术手段有：利用蛋白组学的方法筛选WDV侵染下小麦在蛋白水平的表达差异，采用VIGS、酵母双杂交等技术验证基因功能或阐明病毒与寄主之间的互作机制。2.在植物与病毒互作中，表型的发生并不是孤立的，众多的信号转导途径参与其中。本研究中通过转录组测序分析获得的差异表达基因中，涉及到许多其他的代谢通路，例如，植物抗病响应蛋白家族中的病程相关蛋白、衰老相关蛋白DIN1等参与的老化与抗衰老进程、磷饥饿响应与磷酸根离子转运、雌雄配子体发育过程、细胞壁降解、DNA修复、泛素-蛋白酶降解途径、呼吸作用中电子传递、多种糖类的代谢及一些微量元素或金属离子转运等等，这些代谢途径的差异变化，表明病毒的侵染对于寄主的正常生理生化过程产生了极为广泛的影响，对于这些基因的进一步研究，可以从更多的层面揭示病毒的致病机理。3.在进一步提高农杆菌介导的侵染性克隆侵染效率的基础上，利用侵染性克隆对病毒致病相关基因的关键功能域及关键氨基酸进行分析，可以从更深的层次揭示病毒致病的分子机理。53 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中国农业科学院硕士学位论文附录qPCR方法验证转录组数据引物列表（续）引物名称引物序列备注RemarkPrimernamePrimersequence(5′-3′)Ribulose1,5-bisphosphatecarboxylasesmallRub-FCCGTCAGTACAACAGTTCACCAGGsubunitmRNARub-RTCAACACCTGAGCAGCATCAGTGBTV-FTGATGATCAATGACCTAGATGCTGGRuBisCOactivaseBTV-RGCCAAGTTCATCAATGTTCCAACCLHC-FGCCAAGAAAGGAGAGTGGTTGCLHCItypeIVchlorophyllbindingproteinLHC-RCGAGTCCCAATGGATCGAATCNADP-FCTTCGCTTGATAGTGTCCGCCProtochlorophyllidereductaseBNADP-RGCAGTTGGCTGGTAAACAGCAGRCR-FCTGATGCCAGATGGCTGGACACRedchlorophyllcatabolitereductaseRCR-RCAGTGCATGTTCTCCAACAGCGCAD-FACAAGCACTGTGTCCAATGACCACCarbonicanhydrase,chloroplastprecursorCAD-RTGGTTCCACCATATGACCAGGCPPT-FAGCTGCCATTACCATTGCCAGTriosephosphate/phosphatetranslocatorPPT-RATCCTCACACGGTTCTGGCTTGSOD-FACGACGGTGAACGTTCGTATCACSuperoxidedismutaseSOD-RGTGGACCTGTTGATATGCATCCATPOD-FTTCGACGGCGTCTACTTCAAGGPeroxidase47precursorPOD-RACATGTTCACCAGCCGCTGCPPO-FGGATCCGCTCGTGGAAGTAGAGGPolyphenoloxidasePPO-RCCTACGACCAGGTCGGCTTCCAGO4-FGTGCTCATGCGGGACCTATAGGArgonaute4proteinAGO4-RACTAGGCTCTGGAGTTCATCTGCTGWRKY-FCGAAGTGGTCCCAGTCCAAGCWRKYtranscriptionfactor48WRKY-RGTCGGAGGACTCACACGCGATAK2-FGGCTTCGAGTGTATGTTCCACCTGWall-associatedkinase2AK2-RCTGGTCCAAATACTAGATCCGCAGG62 中国农业科学院硕士学位论文附录侵染性克隆构建引物列表引物名称Primername引物序列Primersequence(5′-3′)备注Remark0.4V-HindIII-FCACGAAGCTTGTTCTGCACGAGAACGHindIII酶切位点BamHI、KpnI酶切位点0.4V-BamHI-RCGCGGATCCGGTACCCTGTATGTTAAATTTGOrient-FCTAGGACAGTCACTGCGAAGCAG插入取向检测Orient-RGTGATCAGGATCCGGTACCCTGTATG插入取向检测WDV-CP-FATGGTGACCAACAAGGACTCCWDV检测（下同）WDV-CP-RTTACTGAATGCCGATGGCTTTGWDV-245FCGACTACGCCTGGCGAACATTTGWDV-1418RCATCAACTACTCGTTCGCCTCCGGWDV-1381FCAGTGACATCTTCGCCGGAGWDV-2445RTGTACCCTTGAGCCACAGTACGCCWDV-2420FAAGGCGTACTGTGGCTCAAGGGWDV-435RGGAGTCCTTGTTGGTCACC63 中国农业科学院硕士学位论文致谢致谢岁月匆匆，师恩难忘。点滴暖心，如沐春风。首先，在此对我的恩师刘艳副研究员致以崇高的敬意和真诚的感谢！刘老师在我课题完成的每一个阶段都给予了细致入微的指导和帮助，令我深受感动。您是一位贴心的导师，无论在生活上还是在实验上面临困难时，总能得到您耐心的教导和温暖的关怀。感谢您能包容我有时候小小的固执和倔强，感谢你让我学会了怎样去学习和生活，感谢在我的人生中能遇到这样一位好老师，好朋友。特别感谢王锡锋研究员，王老师治学严谨、正直敬业的可贵精神，是我们学习的榜样。您对我们的严格要求是因为给予了厚望，感谢您在实验上给予的诸多指导和教诲，感谢您为整个课题组的日夜操劳和辛勤付出。感谢和蔼可亲的周广和先生、温文尔雅的李莉老师和亲民友善的吴蓓蕾老师对我学习和生活上的关心，感谢你们为课题组做出的贡献。感谢已经毕业的王亚娇师姐、雷阳师兄、张鹏师兄、武科科师姐、ThiThiMar、金文师姐、李羽师姐，你们的优秀让我看到了努力的希望，真诚地祝福你们都能有美好的前程。感谢依然可以在一起奋斗、一起欢笑的粮食作物病毒病害组的兄弟姐妹：刘文文、王彪、秦发亮、Jamal、WinThan、张培培、赵艺泽、尚晓楠、刘贝贝、张宏波、简熠、王惠、冯耿、吴慧娟、辛敏等，特别感谢为实验室良好运转付出辛勤劳动的苗苗姐和武丽姐，感谢两位好姐姐在实验上和生活提供的关心和帮助，苗苗姐在叶蝉饲养传毒和材料种植管理方面给予了太多的支持。和谐友善、快乐天天的实验室大家庭是大家共同努力构筑的，团结奋进、不离不弃的实验室好氛围是大家齐心协力营造的，感谢有你们陪伴我度过三年充实而快乐的美好时光，无论何时，无论何地，都是一辈子的朋友！诚挚地感谢西北农林科技大学郝兴安老师在实验过程中诸多细节上的指导以及后期实验材料方面提供的帮助。感谢上海烈冰信息科技有限公司侯朋伟先生在高通量测序数据分析上给予的帮助。感谢曾在这里实习的李文燕、毛文渝、母熙等，虽然只有短暂的相处，但让我看到了你们身上乐观向上、热情洋溢的年轻活力，希望实验室的点点滴滴能给大家带来永恒的美好回忆。硕士八班，一个神奇的班级！感谢硕士八班班主任高弘毅老师以及所有可爱的同学们，永远不会忘记大家一起欢笑、一起奋斗的美好岁月，感谢大家能汇聚在一个这么有爱的班集体之中。永远记得大家一起拔河、一起聚餐、一起合唱、一起游玩、一起学习的美好瞬间，一句话，一辈子，一生情，一杯酒！感谢我的父母家人以及亲朋好友的支持和鼓励，你们无私的关爱是我在挫折面前重燃生机的最大动力，你们幸福的微笑是我在人生路上奋力向前的璀璨灯塔。衷心地祝愿：福寿安康、幸福久长！64 中国农业科学院硕士学位论文作者简历作者简历姓名：王亮性别：男籍贯：山东荣成学历：农学硕士教育背景：2012.9-2015.7中国农业科学院植物保护研究所植物病理学硕士2008.9-2012.7山东农业大学农学院种子科学与工程学士硕士期间发表论文：1.LNA探针实时荧光定量PCR检测小麦矮缩病毒体系的建立（《植物病理学报》2015年4月已接收）2.LiuY,JinW,WangL,andWangXF.Replication-associatedproteinsencodedbyWheatdwarfvirusactasRNAsilencingsuppressors.VirusResearch[J],2014,190:34-39.65