小麦矮缩病毒实时荧光定量pcr体系在小麦和异沙叶蝉中的建立与应用

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万方数据AbstractWheatdwarfvirus(WDV)，transmittedbyleathopper(PsammotettixstriatusL．)inapersistentcirculativemannegbelongstothegenusMastrevirus，familyGeminiviridae．WDVandleafhopperorwheatinteractedgeneexpressionplaysanimportantroleforspreadofwheatdwarfdisease．IthasbeenprovedthatGeminiviridaecoatproteinactasanauxiliaryforMP,eitheractivelyorbyprotectingthegenomewhenthevirusmovescelltocellthroughplasmodesmata．TheCPproteinofWDVhasbeeninteractedwithleafhoppetThepurposeofthisstudyistoanalysisWDVgeneexpressionpatterninwheatandleafhopperusingreal-timequantitativePCR(RT-qPCR)．(1)WebuilttheRT-qPCRprotocolinregardtostudygeneexpressioninthewheat，using5housekeepinggenesTEF一1-0l，GAPDH，18SrRNA，UBCand28SrRNAasthecandidatereferencegenesGenesexpressionstabilitywasassessedinthestemandleaftissueofwheatusingGenorm，NormFinderandBestkeepersoffwares．Inthestemtissue．TEF一1—0【rankedasthemoststableandthe28SrRNAistheleaststableone．Whereas，inleaftissuegenestabiltywasvaringinallthethreesoftwareusedforanalysisgeneexpression．TEF一1一olfollowedby18SrRNA，GAPDH，28SrRNAandUBCshowedmorestabilityinGenormanalyticalsoftware．GAPDHwasprovedmorestableascompareto18SrRNA，TEF·I一0L，UBCand28SrRNAinNormFindersoftware．Ontheotherhand，Bestkeepersoftwareshowed18SrRNAasmorestableinleavestissuesascomparetootherfourgenes．HoweveLTEF·1-0tandGAPDHweremoresatbleinbothtissuesandtheoptimalnumberofreferencegenesfornormalizationwasatIeastfive．(2)ThisstudyanalyzedtherelativeexpressionofWDV-CPgeneinthestemandleafofwheatbytheRT-qPCRsystemwebuilt．TherelativequantitativeofWDV-CPgeneinthestemwashigherthantheleaf．ThismightbeastheresultoftheenteringofWDVinthewheatphloembytheleafhopperandthenmoveinthephloemuptodown．(3)TheRT-qPCRsystemwasbuiltintheleafhopperusing6housekeepinggenes(RPS23e，UBC，Beta-TUB，GAPDH，18SrRNAandACT2)whichwerethefirsttimesequencedfromtheleathopper．OurresultsshowedthatRPS23ewasmoststableandACT2waslessstableascomparetoUBC，Beta-TUB，GAPDHand18SrRNAinleafhopperusingeitheranalyticalsoftware．However，themoststablecombinationwasBeta—TUBandUBC．Theoptimalnumberofreferencegenesfornormalizationwasalsoatleastfive．(4)Furthermore．weanalyzedtheWDV-CPgeneexpressioninleafhopperaRer12hto156hwithintervalof12hfeedingonvirusinfectedplant．WefoundthetiterofWDVdecreasedffoml2hto48h，andthenincreasefrom48hto96htothehighestpoint．withthereductionagainbetween96htoI20handincreasefrom120hto156h．Thisresultsuggeststhefeedingbehaviorormouthpartoflear'hopperwasinvoledtoregulatevirustiterinleafhoppers．Takenalltogether,wesuccessfullyquantifedWDVtitersindifferentpartofwheatplantandentireleafhopperbedy．SuchquantitativeinsightofWDVtitersinwheatandleafhopperwillbeusefulto 万方数据understandWDV-Wheat—Leafhopperinteraction．Keywords：Wheatdwarfvirus，RT-qPCR，Wheat，Leafhopper111 万方数据目录第一章引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1植物病毒的致病机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．1．1抑制植物的抗病反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1．2干扰激素调控⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．1．3干扰细胞周期和基因表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21．2植物病毒昆虫介体传毒机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一31．2．1昆虫介体传毒方式⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．2．2昆虫介体传毒机制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3基因表达的分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一41．3．1Northern杂交⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．2基因表达系列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．3相对表达序列标签⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．4大规模平行标记测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．5DNA微阵列⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51．3．6实时荧光定量PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．4实时荧光定量PCR内参基因的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．61．4．1内参基因选择的标准⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．4．2内参基因选择的方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61．5小麦内参候选基因的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一71．6植物病毒昆虫介体(半翅目)内参候选基因的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．7小麦矮缩病毒(Wheat咖口矿virus，WDV)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．7．1WDV的生物学特点与研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一81．7．2WDV的传毒介体异沙叶蝉(户striatusL．)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10IV 万方数据1．8研究的目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．132．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．1从健康小麦和带毒小麦中提取总RNA电泳图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．2内参基因和WDV-CP基因扩增效率和特异性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．212．2．3检测健康对照小麦和处理组小麦茎和叶的总RNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯222．2．4检测处理组小麦茎、叶组织的普通RT-PCR产物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．232．2．5五个内参基因cT值的箱线分布图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯232．2．6统计学分析内参基因的cT值差异⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．2．7分析内参基因的表达稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．252．2．8选择合适的内参基因数目⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．262．2．9WDV-CP基因在小麦茎、叶中的相对表达量⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．272．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．28第三章异沙叶蝉体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．1．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．303．1．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．2．1检测异沙叶蝉带毒率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．2．2单头无毒的异沙叶蝉成虫总RNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．373．2．3内参基因RT-PCR扩增结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．2．4分析异沙叶蝉内参基因核苷酸序列的相似性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．393．2．514个时间点(oh．156h)单头异沙叶蝉总RNA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40V 万方数据3．2．6内参基因扩增效率和特异性检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．413．2．7分析内参基因的表达稳定性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．423．2．8选择合适内参基因数目⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．433．2．9不同取食时间点WDV-CP基因在异沙叶蝉体内的相对表达量⋯⋯⋯．443．3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45第四章全文总结与展望⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．47参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．55致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯58作者简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．59Vl 万方数据英文缩略表VII 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言第一章引言1．1植物病毒的致病机制植物病毒属于活体寄生病原物，需要在寄主体内完成增殖，因此植物病毒一般不会导致植物死亡，而是处于一种侵染一防御的动态过程中。在一些例子中，有些病毒侵染不会对植物寄主引起明显的生理影响或者甚至为寄主提供可选择的有利条件，但是在多数情况下植物病毒会引起系统表型的变化。这些表型是由病毒干扰或者竞争寄主能源，破坏寄主生理，发生病变引起的。寄主被特定的病毒侵染会诱导或抑制至少4000种基因的表达(Senthil等，2005；Whitham等，2003)。这些基因参与大多数细胞生理过程，比如：植物的抗病反应、激素调控、控制细胞周期等(Pallas等，2011)。此外证据表明，植物发育和抗病毒防御过程之间相互影响，病毒通过干扰植物的信号通路可以引起病理表现(Chapman等，2004；G6mez等，2009；Jay等，2011)1．1．1抑制植物的抗病反应1．1．1．1抑制植物的过敏性坏死反应为了侵入植物的防御系统，病原物自己可以直接在寄主细胞中分泌一种效应子蛋白，无毒因子(Avirulencefactor，Avr)便是效应子基因的一种产物。它可以提高病原物毒性和克服植物防御。为了应对这种策略，植物产生了一种特殊的防御，即抗性基因(Resistancegene，R)。只有当植物中抗性蛋白与病原物的无毒因子相识别，才引起由尺基因调控的过敏性反应(hypersensitiveresponse，HR)(Dangl等，2001)。HR引起复杂的信号转导通路，导致侵染部位细胞迅速死亡从而切断病原物的营养来源和阻止其传播。最近一些研究表明一些细菌的avr基因可以抑制寄主植物的HR：丁香假单胞菌番茄株系(Pseudomonassyringaepv．tomato)的AvrPtoB在番茄体内短暂表达可以抑制由抗性蛋白Pto和Cf9引起细胞程序死亡(Abramovitch等，2003)，大豆病原菌户syringaepv．phaseolicola的VirPphA，AvrPphC和AvrPphF蛋白可以阻止诱发HR(Tsiamis等，2000)。关于病毒，首次报道了芜菁皱缩病毒(Turnipcrinklevirus，TCV)的p38基因编码的衣壳蛋白可以抑制植物的HR(Jyoti，2007)。1．1．1．2干扰RNA沉默RNA沉默机制是宿主细胞质中的核酸内切酶Dicer剪切病毒的dsRNA结构形成大量的小干扰RNA(smallimerferingRNAs，siRNA)，细胞内的RNA解旋酶将siRNA解链成正义链和负义链，负义siRNA和体内一些酶(如argonaute家族的成员，如AG01，AG02，AG03，AG04等)结合成RNA诱导的沉默复合物(RNA．inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC可以降解病毒ssRNA和抑制它的翻译。一种病毒因子不仅可以通过诱导寄主抗性机制而且可以通过抑制它带来病理反应。沉默抑制子在病毒致病中起重要作用。马铃薯Y病毒组的辅助蛋白(helpercomponentproteinase，HC．Pro)1 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言不仅可以妨碍病毒RNA的降解，而且可以利用小RNA(microRNAs，miRNA)干扰RNA沉默途径。HCPro蛋白的异常表达增加了特定的不活跃miRNA的积累，因为这些小RNA具有负调控的功能，从而HCPro蛋白的表达可以加速了这些目标基因得到功能表型。这些基因中一些事植物正常发育所必需的，因此会引起与病毒侵染期间相似的植物畸形(Chapman等，2004)。病毒也可以通过沉默抑制子干扰miRNA功能引起植物畸形。最近，已有研究证明三种不同的病毒抑制子通过误调miRl67的靶标植物生长素效应子引起植物的不正常发育(Jay等，2011)。除了沉默抑制子还有其他蛋白可以干扰miRNA生物转化途径和积累，TMV在转基因植物中表达的MP和CP之间的互作增加了miRNA的含量(Bazzini等，2007)。1．1．2干扰激素调控如上述所说，沉默抑制子对植物的影响揭示了病毒侵染症状是由改变植物生长和发育所致(Chapman等，2004；Jay等，2011)。除了干扰miRNAs，特定病毒因子与细胞组分的互作和改变激素合成和通路己经被证明(Culvcr等，2007)。例如，TMV复制酶中的解旋结构域与植物生长素／吲哚乙酸(Aux／IAA)蛋白家族中的一些成员互作(Padmanabhan等，2006)等。对这些Aux／IAA蛋白进行亚细胞定位，发现这些蛋白都被改变并且当有TMV复制酶存在时，它们积累量下降。另外，水稻矮缩病毒(Rice咖硝virus，RDV)的P2蛋白和寄主体内的内．贝壳杉烯(ent．Kauren)氧化酶蛋白互作。这种寄主蛋白在赤霉素(GA)的生物合成中起着关键作用。在RDV侵染的植株中，内．贝壳杉烯氧化酶的表达量和GAl的内源水平都下降，然而对RDV侵染的植株外用GA3之后便会恢复正常生长。另一方面，推测P2与内．贝壳杉烯氧化酶之间的互作干扰植物抗毒素的生物合成，因此有利于病毒的复制，但是目前仍缺乏实验证据(Zhu等，2005)。花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus，CaMV)的VI基因的产物与乙烯信号通路之间的互作也已经被观察到。可以抑制由转基因调控CaMVVI基因表达量引起的表型。拟南芥突变体不易被CaMV侵染并且对乙烯的敏感性降低(Geri等，2004)。但是，没有研究去确认vl基因的产物是否直接影响乙烯通路中的任何成份。1．1．3干扰细胞周期和基因表达病毒的侵染会干扰植物的细胞周期和与细胞周期相关的基因表达。有些病毒只侵染那些分裂的细胞，由于这种现象不是针对于大部分植物细胞，这些病毒已经形成一种机制去改变寄主的细胞周期。已有研究表明，双生病毒的Rep蛋白与rb肿瘤相关蛋白(retinoblastoma．relatedproteins，pRBR)之间的互作参与细胞周期的负调控(Kong等，2000)。可以推测，与Rep之间的互作抑制了pRBR蛋白活性，导致细胞进入s期，提高病毒复制所需要的寄主DNA复制机制形成产物。另外，蚕豆坏死黄化病毒(Fababeannecroticyellowvirus，FBNYV)中Clink蛋白编码的F-box蛋白与苜蓿(Medicagosativa)的同源蛋白Skp．1和一个pRBR蛋白都互作。而且，Clink与pRBR蛋白结合的能力与其刺激病毒复制的能力呈正相关(Aronson等，2000)。因此，Clink可能通过蛋白酶导致pRBR蛋白降解，从而可以干扰它的细胞周期。， 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言1998年，Aranda等用实验证明了植物病毒可以像动物病毒一样重新安排寄主的基因表达(Aranda等，1998)。现在进一步有证据表明这种现象和病毒的致病性之间可能的联系是病毒感染干扰细胞基因表达的严重性与病毒症状严重性之间的相关性(Havelda等，2008)。1．2植物病毒昆虫介体传毒机制植物病毒可以引起谷类、蔬菜、水果和花卉产业的严重产量损失，尤其是作物产量。植物病毒的传播主要通过芽、种子或者块茎、无脊椎节肢动物、线虫、真菌等。大多数植物病毒通过昆虫介体传播(Power等，2000)。半翅目昆虫例如蚜虫、粉虱、飞虱和叶蝉等是主要的植物病毒传播介体。这些昆虫均是刺吸式口器，特有吸食植物韧皮部，广泛的寄主范围有利于病毒传播。1．2．1昆虫介体传毒方式植物病毒通过昆虫传播的方式可以分为四类：非持久性传播、半持久性传播、持久循回性传播和持久增殖性传播。非持久性传播和半持久性传播的病毒不打破昆虫介体的肠障碍，而是保留在昆虫的口针或前肠进行传播。因为病毒位于昆虫细胞的外面，它们只需克服很少的障碍从先前的植株传播到一个新的植物寄主，这些病毒在获毒后可以在数秒到数小时之内被传播。大多数以非持久性传播的病毒主要是通过蚜虫、叶蝉，而粉虱主要传播半持久性传播的病毒(Hogenhout等，2008；Ng等，2006)。持久性传播的病毒在传毒之前在昆虫的体内进行循回，通常穿过肠脏进入血淋巴或者其他组织，最终在传染到新寄主植物之前入侵唾液腺(Ammar等，2009)。持久性传播的病毒可以分为两类：一是循回性病毒可以穿过肠障碍并且在血腔中循回，但是不能再昆虫介体内复制；二是增殖性病毒既可以在介体内循回又可以复制。因为这些病毒在昆虫体内必须要跨越许多分子和生理障碍，在获毒和传毒期间需要一个潜伏期，它们的传毒需要数天到数周。持久增殖性传播的病毒主要由蓟马、叶蝉、飞虱和蚜虫进行传播，然而以持久循回性传播的病毒主要通过粉虱、蚜虫和叶蝉进行传播(Hogenhout等，2008)。1．2．2昆虫介体传毒机制1．2．2．1非持久性和半持久性病毒介体传毒机制半翅目昆虫介体与病毒之间复杂和特异的互作以及它们所传播的病毒已经被广泛研究。两种普遍的传毒策略已经被证实：衣壳和辅助策略。两种策略均在蚜虫以非持久性传播的植物病毒中发现，证据表明这些策略也存在半持久传播的病毒中(Ng等，2006)。非持久性传播的黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)主要是通过病毒衣壳蛋白的氨基酸直接与昆虫介体口针结合(Pirone等，1996)。相同传播方式的马铃薯Y病毒属(Potatovirusy，PVY)的病毒则是通过辅助蛋白HC．Pro，它是一个双功能蛋白，～个功能区与病毒衣壳蛋白结合，另一个与介体口针结合。具体结合过程为：HC．Pro蛋白通过N端四个氨基酸残基与介体口针受体蛋白结合，PVY衣壳蛋白的N端氨基酸三联子“DAG’区域与HC．Pro蛋白的C端“PTK” 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言区域相互作(Plisson等，2003)。花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus，CaMV)以半持久性方式被传播。它与介体的互作位点位于前肠，并且是通过两种病毒编码的蛋白P2和P3进行调控。当P3的三个单体中两个相邻单体N端序列互作在CaMV衣壳表面形成二聚体，P3的三个单体抛锚于CaMV病毒衣壳。P2蛋白调控P3．病毒复合物与昆虫前肠的结合(Ng等，2006)。1．2．2．2持久性病毒介体传毒机制持久性传播的病毒在介体中需要克服四种障碍：一、中肠侵染障碍；二、散播障碍(包括中肠释放和唾液腺侵染)；三、唾液腺释放障碍；四、经卵巢传播障碍(Ammar，1994)。持久性病毒在昆虫介体中穿过不同器官需要病毒与介体组分之间的特异互作(Gray等，2003)。持久循回性病毒包括双生病毒科(Geminiviridae)、矮缩病毒科(Nanoviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)等12科属170多种病毒。黄症病毒属病毒的衣壳蛋白(coatprotein，CP)和通读蛋自(readthroughdomain，RTD)均参与蚜虫的传播(Brault等，2000；Lee等，2005)。RTD决定蚜虫中病毒．肠趋性，同时影响病毒只入侵中肠或入侵中肠和后肠的能力(Brault等，2005)。对于持久增殖性病毒，所有包被的植物病毒都是以这种方式传播。这些病毒种类中包括布尼亚病毒(Bunyaviridae)和弹状病毒(Rhabdovirldae)。三组无包被的病毒即呼肠病毒科(Reoviridae)、纤细病毒属(Tenuivirus)和雷亚多非罗病毒属(Marafivirus)也是以持久增殖方式传播(Hogenhout等，2008)。例如：布尼亚病毒科番茄斑萎病毒属的番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus，Tswv)就是以蓟马为介体进行持久增殖性传播的。研究表明，两种表面暴露的糖蛋白在该病毒与介体之间的互作起着关键作用。这两种蛋白是由病毒MRNA编码的GN和Gc，它们是从一个开放阅读框(Openreadingframe，ORF)作为一种多聚蛋白被翻译。GN／Gc多聚蛋白裂解之后形成单一的糖蛋白是蓟马传播该病毒所必需的(whitfield等，2008；Whitfield等，2004)。两个蛋白位于病毒颗粒表面，因此有可能是在蓟马中肠与小分子互作的第一个病毒成份，GN糖蛋白与蓟马中肠之间的直接互作已经被证实(Whitfield等，2004)。另外，外源GN阻碍蓟马介体获毒和随后的传播(whitfield等，2008；Whitfield等，2004)。这些发现证明GN作为一种病毒配体参与调控TSMV与蓟马中肠表皮细胞上的受体结合。1．3基因表达的分析方法现在已经有很多技术可以分析mRNA的表达水平或者表达差异，主要包括Northern杂交、基因表达系列分析(Serialanalysisofgeneexpression，SAGE)、相对表达序列标签(Comparativeexpressedsequencetag，EST)、大规模平行标记测序(Massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)、DNA微阵列和实时荧光定量PCR(Real—timequantitivePCR，RT-qPCR)(Takumi等，2002)。4 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言113．1Northern杂交Northern杂交的原理：提取的RNA通过电泳将其按片段大小分离，再通过印迹转到固体介质上如尼龙膜。标记的DNA探针和尼龙膜在有助于退火的条件下一起孵育，探针便会和尼龙膜上的RNA分子相配对。最后将尼龙膜置于x射线下进行照相。通过检测图像中感兴趣的探针结合区域的信号强度来对RNA进行定量。通常，对照RNA和目标RNA同时检测。1．3．2基因表达系列分析SAGE是由VogelsteinandKinzler实验室发明的(Velculescu等，2000)。SAGE利用一系列的生化反应建立短的DNA片段(13bp)库，每一个短片段来源于生物样品中单一的mRNA分子。这些短DNA片段被称作SAGE标签，被串联起来形成长DNA分子可以被测序。然而，一个单一分子包含的DNA片段代表大于30种不同的RNA分子，所以一个单一的测序反应可以测得大于30种模板的表达量。只要可以建立一个相应的SAGE标签库，特殊的软件可以区分每个SAGE标签和计算完全相同的标签，因此可以检测RNA库中每一个转录本的数量和分布。当比较两个RNA样品时，每个样品进行可信的统计学比较会涉及分析30000．100000SAGE标签。1．3．3相对表达序列标签EST是由Venter和他的同事在1990年代提出的(Lee等，1995)。这个策略包括建立一个代表一个细胞或组织所有表达的mRNAs的cDNA文库，然后通过对选取的数千个cDNAs进行测序，建立的数据库可以鉴定和计算所有表达的基因，这个数据库术语上就是ESTs。1．3．4大规模平行标记测序MPSS像SAGE是一个新方法，通过测序来检测基因并且将其与平行处理系统相结合来提供高输出量的分析。简而言之，MPSS包括通过获得上百万微粒并且将其组装成一个阵列建立一个cDNA文库。单一微粒在一系列复杂测序反应中单独地被成像同时成千上万转录本的DNA序列也被确定。通过测序16—20个碱基，每一分子特异身份可以被推测出来，同时包含所有转录本的数据库也被建立。因此，测序分析提供基因鉴定和简单对每个序列的拷贝数进行计数，从而揭示转录丰富性或表达水平。研究表明这个检测方法可以有效地检测酵母和人类细胞中基因表达水平(Takumi等，2002)。1．3．5DNA微阵列DNA微阵列或基因芯片，已经成为一种最流行的平台来分析基因表达水平。微阵列提供了～种相当快的、可靠的、可再生的和定量的方法同时对数千个基因进行表达分析(Nagasawa：2001)。基本上，该方法是创建一个对应于数千个不同基因的数千个不同DNA分子或多聚核苷酸或cDNAs的斑点阵列。然后，从RNA样品开始，一系列的生化反应生成一种荧光标记的cRNA5 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言或SS—cDNA探针。这个探针与微阵列进行杂交，之后用激光扫描仪进行扫描。通过比较探针结合的每个印迹的荧光强度来检测表达水平。迄今为止，最主要的微阵列平台是美国昂飞公司多聚核苷酸微阵列和玻璃载片cDNA或多聚核苷酸微阵列(Jain，2000)。1．3．6实时荧光定量PCR该方法是可以快速、准确、灵敏和低成本的分析基因表达。它是在同一个型号的仪器对目标基因和内参基因进行特异扩增和检测，利用荧光定量临界循环数(Thresholdcycle，CT)即当报告基团的荧光信号超过设定临界值时候的循环数，进行分析基因相对表达量。近年来有许多计算方法来分析基因的相对表达量，例如：效率校正方法通过荧光定量的扩增效率和c一值进行(Pfaffi，2001)：称为s形曲线拟合方法即将实验数据套入一个经验公式来预测PCR扩增效率和估算扩增子起始的拷贝数(Rutledge，2004)：另一种则是现在广泛被应用的2出u法(Livak，2001)，这个方法依靠于两个假设，一是反应的扩增效率为100％，换言之，PCR经过每一个循环，PCR产物量成两倍增长，二是有一个或多个基因在样品之间稳定表达，这类基因常被称为内参基因。1．4实时荧光定量PCR内参基因的选择1．4．1内参基因选择的标准基因表达定量结果包括两个变异来源：固有的技术或实验和生物学变异(VanGuilder等，2008)，合适选择内参基因将会使这些变异标准化。用于标准化的内源持家基因或内参基因需要满足以下假设：(1)在研究中所有样品之间表达一致；(2)表达量不受实验条件的影响；(3)与目标基因以相同动力完成荧光定量PCR的所有步骤(Bustin，2000)。1．4．2内参基因选择的方法目前，用来作为内参基因分析基因表达的持家基因主要有泛素(UBQ)、泛素结合蛋白(UBC)、肌动蛋白(ACT)、3-微管蛋白(TUB)、18s核糖体(18SrRNA)、核糖体小亚基蛋白(RPLs)等(Jain等，2006；胡瑞波等，2009)。然而，许多文献表明这些基因表达会发生变化，尽管偶尔在特定细胞类型或实验条件下稳定(Czechowski等，2005)。对此，已有许多评估候选内参基因表达稳定性的统计学计算方法被报道，例如GeNorm(Vandesompele等，2002)，Bestkeeper(Pfaffi等，2004)，NormFinder(Andersen等，2004)。GeNorm软件计算方法依据一个原则即在不考虑实验条件或细胞类型情况下，两个理想的内参基因在所有样品中的表达斜率是一致的。这样两个真实的持家基因表达斜率的变化反映出这两个基因中一个或都不是稳定表达的事实，因为斜率不断增加的变异与表达稳定不断降低相对应。对于每一个候选内参基因与所有其他内参基因的配对变异是表达斜率对数的标准差，而内参基因稳定性程度M是这个内参基因与其他所有内参基因配对变异的平均。M值越小，基因表达稳定性越好。另外，该软件可以计算出最佳选择内参基因的数目。假设内参基因不是共同调控，逐步排除M最大的基因，直到剩余两个最稳定的内参基因。6 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言同时会计算出v。／V。+1(n为内参数目)，通常比值的临界值设为0．15，即当vdv。+i>0．15时，表明第n+1个内参对稳定性有显著影响，当计算可靠的标准化因子(NormalizationFactor，NF)是应该被考虑，换言之应该选择n+1个内参分析基因表达量，反之亦然(Vandesompele等，2002)。NormFinder和Beskeeper两个软件只能评估内参基因的稳定，均是代表稳定性的内参值越小，内参基因越稳定。1．5小麦内参候选基因的研究进展小麦(TriticumaesavumL．)是全球大范围种植的粮食作物并且对人体营养至关重要。然而，有多种植物病毒严重危害和影响小麦的产量，例如小麦矮缩病毒(Wheatdw．qvirus，WDV)、大麦黄矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus，BYDV)、水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)等。目前，在植物生物学和病毒学领域研究植物与病毒之间的互作一直是一个最热的话题(Dodds等，2010)。近来，通过微阵列、RNA．seq和病毒引起的基因沉默进行的高通量分析已经开始阐明更多参与植物和病毒互作过程的基因(Becker等，20IO)。然而，由于RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性、准确性和重复性，常常被用来分析那些参与病毒致病机理的基因。而RT-qPCR中最重要的一步就是选择合适的内参基因，因为合适的选择内参基因可以减少结果的误差。因此，如果利用RT-qPCR分析病毒与小麦之间的互作需要选择合适的内参基因。近来关于在小麦受到病毒侵染条件下选择合适内参基因的研究如下：曾有报道，当5种不同单子叶植物(大麦，小麦，玉米，高粱和二穗短柄草)在不同病毒包括大麦条状花叶病毒(Barleystripemosaicvirus，BSMV)，雀麦草花叶病毒(Bromemosaicvirus，BMV)，水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus，RBSDV)和甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus，SCMV)侵染条件下，评价这5种单子叶植物中作为RT-qPCR中的候选内参基因的10个持家基因(ACT，TEF．1一o【，F．BOX，GAPDH，GTPB，PP2A，SAND，TUB，UBC和UK)的适用性。结果表示在RBSDV病毒侵染后的小麦内，TEF．1．0t、UBC和GTPB三个持家基因表达最稳定(Zhang等，2013)。同时，通过BYDV病毒侵染和黑暗处理的非生物压力分析小麦、燕麦和大麦植株内7个候选内参基因(GAPDH，18SrRNA，28SrRNA，TUBB，TUBA，TEF．1．a和EIF40t)的适用性，结果建议利用GAPDH，18SrRNA，28SrRNA和EIF4ct四个持家基因作为内参来分析小麦中的基因表达(Jaro§ovfi等，2010)。1．6植物病毒昆虫介体(半翅目)内参候选基因的研究进展大部分植物病毒是由半翅目昆虫传播的，而最有经济重要性的昆虫介体局限于半翅目很少的～些科。例如蚜科(Aphididae)的蚜虫，粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，叶蝉科(Cicadellidae)的叶蝉，飞虱科(Delphacidae)的飞虱。截止2008年12月7日由ICTV(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses)鉴定的697种病毒中，蚜虫和粉虱传播325种植物病毒，其中110种属于马铃薯Y病毒属的病毒只由蚜虫传播，菜豆金黄花叶病毒属的115种病毒只由飞虱传播。叶蝉传播26种植物病毒，飞虱传播18种植物病毒，其余的13种植物病毒由其他半翅目昆虫传播包括介壳虫，木虱和树蝉(Hogenhout等，2008)。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言近几年，研究植物病毒与昆虫介体之间的互作也是植物生物学和病毒学领域最热的话题，而RT-qPCR是研究互作中分析基因表达的一个有力工具，而合适的选择内参基因是RT-qPCR实验结果可靠和准确的前提。目前，已有文献报道以上所述的半翅目主要的昆虫介体受植物病毒侵染之后的内参基因选择。飞虱(Delphacodeskuscheli)以持久增殖性传播呼肠孤病毒科斐济病毒属的里奥夸尔托病毒(MaldeRioCuartovirus，MRCV)，该病毒在阿根廷引起主要的玉米病害。有文献检测受到MRCV侵染后的飞虱(Delphacodeskuscheli)的18SrRNA、ACT、TUB、GAPDH、EFIA、RPSl8和UBI基因被用作内参基因来检测其表达量和稳定性，结果表示18SrRNA、ACT和UBI是最适合作为内参基因来定量研究MRCV侵染飞虱后的基因表达(Maroniche等，2011)。同时，有文献检测禾谷缢管蚜(Rhopalosiphumpadi)不同翅型和其传播的黄矮病毒(YDVs)组成的六种组合(有翅：WYDV-GPV、BYDV-PAV和BYDV-GAV；无翅：WYDV-GPV、BYDV-PAV和BYDV-GAV)中禾谷缢管蚜4种内参基因(EF．1d、ACTI、GAPDH和18SrRNA)的稳定性，鉴定结果表明EF—l。c和ACTI两者结合可以很好地定量检测受BYDV-PAV和BYDV-GAV侵染之后的有翅和无翅的禾谷缢管蚜中内源基因的表达量(Wu等，2014)。另外，通过取食和传播病毒的甜薯粉虱烟粉虱(Bemisiatabaci)中内参基因的选择也曾被研究，选取曾被用来研究烟粉虱转录组分析的15种内参基因，分析这些内参在烟粉虱处于不同生物和非生物压力下的稳定性，结果发现在生物压力(植物寄主，获得植物病毒，发育时期，不同组织和粉虱生态型)下RPL29表达最稳定。相反，当在不同的非生物压力下(光周期、温度和杀虫剂敏感性)EFIA、NADH、PPIA、SDHA和HSP40持续表达稳定(Li等，2013)。1．7小麦矮缩病毒(Wheatdwa∥virus，WDV)1．7．1WDV的生物学特点与研究进展联体病毒是一种在植物体中成功的建立起侵染循环的一种小型极少数的DNA病毒之一，是一种重要的植物病原物，在单子叶和双子叶植物中的广泛分布体现了其高效的进化机制(Rojas，2005)，联体病毒的研究已成为植物病毒学最活跃的领域之一。联体病毒因它们的孪生颗粒而得名，为ssDNA病毒，由4个不同的属组成，分别是菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus)、甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)和玉米线条病毒属(Mastrevirus)(Hanley．Bowdoin等，2013)。主要危害食物和纤维作物，观赏植物和野草，在世界范围内引起严重的作物损失，尤其是温带和热带区域(Navas．Castilio等，2011)。在非洲和亚洲，玉米线条病害、木薯花叶病害和棉花卷叶病害造成受害田地颗粒无收(Sattar等；2013)。小麦矮缩病毒属于联体病毒科(Geminiviridae)玉米线条病毒属的成员。WDV寄主广泛，包括小麦(zaestivumL．)、大麦(HordeumvulgoFeL．)、燕麦(ArenasativaL．)和多种杂草(Kotlizky等，2000)。引起植株的严重矮缩、黄化、矮缩、条斑(Vacke等，2004)(图1．1)，该病毒由异沙叶蝉(PsammotettixstriatusL．)传播危害(图1．3)。1961年，WDV最先在捷克发现。目前该病害在我国分布于华北、西北、西南和华中麦区的13个省市自治区；在世界范围内分布于亚洲的中国(Xie等，2007)，欧洲(T6bi6s等，2009)，非洲(Ekzayez等，2011)等12个国家。在过去的lO年里，该病害在欧洲大爆发，特别是在匈牙利、乌克兰等地致使造成大量的减产(T6bi6s只 万方数据中国农业科学院硕十学位论文第{引=等．201”：2007年的4月，我国陕西韩城纳新城、西庄和龙门镇小麦矮缩病害大发生，发病面岳哟007万hm2，发病田平均病株幸80％．减产50．80％(千江飞等，2007)。WDV整个基圳组为环状的单链DNA，由2739-2750个核廿酸组成．编础4个蛋白和两个{I：编码K，包括运动蛋白(MPNl)、外壳蛋白(CP／V2)、两个复制酶相关蛋R酶(RepA和Rep)和两个薹嘲间隔区(LIR和SIR)(GmieⅡez等，1999)．(图12)。研究表明．外壳蛋白cp与芹沙叶蝉介体传毒相关(Wang等，2014)。AB田1I小麦接缩瘸睿症状(iⅡ、等，2007)(AWDV在戢洲匈牙“爆&流行情况：BWDV在我口小麦产区的典型痹椿瘟状)Fig¨Sympt帆sofwh∞tdwarfdisease({Ⅱ飞#．2007)(AEpidemicsituationofWDVinII∞gaty：B,IXypicalsympt㈣sofWDVinihewh％1．g⋯％⋯fChina)口1．2WDV基目组结拇田(Gutle眦#．1999)Fi91．2MolecularsI㈣eofWDVgenome(Gutie％#．19999 万方数据耋呈垒兰：喾兰2．：：兰兰：鼍：i!i17．2WDV的传毒介体异沙叶蝉(PstrialusL)异沙叶蝉(PstriatusL)属于半翅目，叶蝉科，角顶叶蝉亚科．是小麦作物的一种重要害虫。界沙叶蝉的u器是刺吸式u器，可以刺八檀物的韧皮部取食。成虫体K约4,0mm，全体灰黄色，头部旱钝角突出．头冠近端处具浅描色斑纹1对，后与黑{16色中线接连，两侧中部各具I不规则的大型斑块，近后缘娃叉各生逗点形纹2个，顿面两侧有黑描色横纹，复眼黑褐色．1对单眼，前胸背板其5条浅黄色至扶向色条纹纵贯前胸背板上与4条获黄色至褐色较宽纵带相间捧列：小盾板2侧角有暗褐色斑，中间具明显的=166色点2个，横刻纹褐黑色；前翅浅荻色，、}透明，翅脉黄白色i胸部、腹部黑色：足浅黄色：卵长093ram，长卵形，浅黄色：若虫共5龄，5龄时背部可见深褐色纵带。I-5龄整体背面观见图13。若虫从l龄长到5龄{蔫35天左右．产卵孵化期为lO天左右。早在1950‘F代，在中国北部干旱和半干早地M已有芹沙叶蝉的发生报道(Xiang等，1996)。目前主要分布在我国的东北、华北、西北、K江流域。寄主为小麦、大麦、黑麦、肯稞、燕麦、莜壹、糜子、谷子、高粱、__Ii米、水稻等。以成、若虫刺吸作物茎叶，致受害幼苗变色，生K受到抑制，该介体除了传播小麦矮缩病毒．j；±=可传插小麦红矮病毒和引起小壹蓝矮病的植原体(An等，1991)。l。，彰霪寥{l[影l1．8研究的目的与意义植物病毒病害严重危害着全球农作物．病害的发生和流行主要是病毒、寄土和介体之间的相互作用。为了找到有效防清方法，目前大量的科研工作肯投入精力研究病毒与寄土，病毒与介体10 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第一章引言之间的互作。在研究过程中发现，这种互作会影响植物寄主或介体体内重要基因的表达。同时，在众多检钡4基因表达量的方法中，实时荧光定量PCR具有高灵敏度、定量准确、重复性好、高通量等优点，现已广泛被应用。因此，建立一个特定的实时荧光定量PCR体系具有重要的理论和实践意义。由于小麦矮缩病在我国和世界的发生范围广泛，因此研究WDV与小麦、WDV与异沙叶蝉之问的互作机理，揭示其内在机制，为防治小麦矮缩病害探寻策略具有重要的意义。目前，已经建立了WDV绝对荧光定量PCR体系，而检测WDV在异沙叶蝉介体和小麦寄主中相对表达量的体系仍然缺乏。本论文将通过克隆、筛选内参基因，分别建立了检测异沙叶蝉和小麦中WDV相对表达量的荧光定量PCR体系，从而为今后WDV病毒、寄主和介体之间的互作搭建检测平台和奠定研究基础。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用小麦(zaestivumL．)是全球大范围种植的粮食作物并且对人体营养至关重要。小麦是具有三个非常大的同源基因组的六倍体(AABBDD)，每一个基因组包含7对染色体。小麦全部的六倍体基因组比水稻的基因组大40倍，这个巨大的差别主要是因为包含重复序列(Feuillet等，2002)。由于小麦的基因组太大，全基因测序工作基本完成，所以在转录水平上研究小麦基因的结构和功能分析显得尤为重要(Paolacci等，2009．Mayer等，2014)。另外，植物受到病毒的侵染之后，病毒与植物的互作会影响植物的正常代谢，相关的基因表达将会改变(Senthil等，2005；Whitham等，2003)。目前，分析基因表达即从转录水平上分析基因，实时荧光定量PCR(Real—timequantitivePCR，RT-qPCR)是最有效和最灵敏的技术。可靠的荧光定量PCR分析需要许多参数的细调和标准化，例如：样品起始量，RNA完整度和纯度，cDNA合成和PCR扩增酶的活性，分析的组织或细胞整体转录水平(Bustin，2002；Ginzinger，2002)。在这许多建议的方法中(Ginzinger，2002：Hugger等，2005)，通常利用内参基因来标准化荧光定量PCR和减少基因表达分析中可能出现的误差。因此，本实验通过以往研究中评价较高的持家基因作为候选内参基因，利用软件评价其稳定性，筛选出内参基因并辅助分析WDV在小麦中的相对表达量，建立小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系。2．1材料与方法2．1．1材料2．1．1．1WDV毒源、传毒介体异沙叶蝉和小麦寄主WDV病株标样2005年采自山西太原，经双抗体夹心酶联免疫吸附法和PCR验证为WDV的小麦后，在小麦扬麦12(本实验的WDV小麦寄主)上继代培养，保存于实验室(Xie等，2007)。本实验中所使用的无毒的异沙叶蝉来自2010年从陕西韩城采集的样品，之后用健康的扬麦12在25。C光照培养箱(16h白天／8h黑夜)中连续饲喂，保持无毒状态。将无毒的异沙叶蝉(PalienusL．)在带毒的扬麦12上饲毒4天，确保大量扩繁(传毒4天)，以期获得带毒的异沙叶蝉(PalienusL．)。2．1．1．2试剂与耗材来自Takara公司产品：rTaqTM，dNTPs，10×PCRbuffer(M92+plus)，DL2000DNAMarker，DL500DNAMaker，RecombinantRNaseInhibitor(RRI)。来自Promega公司产品：M-MLVReverseTranscriptase，Mmlv5×buffer，Wizard@SVGelandPCRClean-UpSystemKit，pGEM-TEasyvector，T4DNALigase。来自Transgene公司产品：Trans5uECoB来自Invitrogen公司产品：TRlzolreagent12 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PcR体系的建立皇壁用来自AXYGEN公司产品：不含DNase／RNase的离心管(1．5ml、o．5ml和o．2m1)，0．2ml透明薄壁PCR离心管(八连排)，不含DNase／RNase的枪头(1mi、200pl和10阻1)。来自TIANGEN公司产品：SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)，FastQuantRTKit(withgDNase)。来自AMERSCO公司分析纯试剂：Agar，Tris，氨苄青霉素钠盐(AmpicillinSodiumSalt，Amp)。来自Sigma公司产品：焦碳酸二乙酯(Diethypyrocarbonate，DEPC)来自北京化工厂常用的试剂：无水乙醇，氯仿，异丙醇2．1．1．3仪器紫外凝胶成像系统(Bio-Rad，UniversalHoodII，America)，NanoDrop-2000微量紫外分光光度仪(ThermoFisherScientific，Denmark)，台式离心机(Eppendorf，Germany)，PCR仪器(Bio—Rad，America)，7500RealTimePCR仪(AppliedBiosystems，America)，移液枪(Eppendorf，Germany)，水平核酸电泳仪(北京市六一仪器厂，DYY-6C，China)，光照培养箱(Ningbojiangnan，China)。2。1。2方法2．1．2．1实验处理用毒源饲毒异沙叶蝉4天，达到异沙叶蝉体内病毒量最高的时候，将其转移到健康单株小麦上(15株长势一致，均处于第二叶刚张开时期)，每一株小麦上放置3头带毒异沙叶蝉。根据第三章叶蝉体内的病毒含量在12-48h(1．5d)降低，48．96h(2d)升高，96h-120h(1d)降低，120—156h(1．5d)升高，在96h之后即第4天叶蝉体内的病毒含量处于下降趋势，推测其体内病毒会大部分转移到植物的韧皮部。所以，在饲喂第四天时候将带毒叶蝉转移出去。种植处理组同时种植15株健康小麦作为对照，继续观察，待出现发病症状(实验室积累的经验一般20d左右)，分别收集发病植株和健康植株的茎和叶两种组织，每一个植株每一种组织收集4份，一份用做普通RT-PCR检测是否含有WDV，其余三份用作RT-qPCR的三个生物学重复。2．1．2．2小麦内参基因和病毒基因的选择本研究所选取的5个小麦内参基因(18SrRNA，28SrRNA，GAPDH，UBC和TEF．1cc)曾被多次用来分析基因表达(Paolacci等，2009；Jarogowi等，2010)。但是，曾有报道指出内参基因并不是一直表达稳定的，受组织和实验条件的影响(Bustin，2002；Bustin等，2005)。5个内参基因的具体信息见表2．1。为了检测所确定的候选内参基因的使用性，本实验选择的目标基因为WDV的衣壳蛋白(coatprotein，CP)基因，WDv_CP蛋白已被证实可以介导WDV识别与结合叶蝉体内的受体蛋白，即 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用衣壳蛋白是异沙叶蝉传播WDV的相关蛋白(Wang等，2014)，详细信息见表2．1。检测该蛋白的表达量将为深入研究WDV、传毒介体异沙叶蝉和小麦寄主三者之间互作奠定基础。表2．1小麦内参基因和病毒基因信息Table2．1．InformationofreferencegenesforZaestivumL．andWDV基因基因全称分子功能来源1内参基因l8SrRNAl8SribosomalRNA28SrRNA28SribosomalRNAUBCGAPDH病毒基因WDV．CPTranslationelongationfactor1alphaGlyceraldehyde--3--phosphatedehydrogenaseMastrevirusWheatdwarfvirus．CoatproteinParticipatesinproteinAJ272181translationofEukaryotesParticipatesinproteinAY049041translationofEukaryotesRegulatingproteinbyAY736121ubiquitinationEnzymaticdeliveryofM90077aminoacyltRNAstotheribosomeCa吣zesthereversibleAF251217oxidativephosphorylationEncodesmajorstructuralFN806786proteinofvirusparticle；leafhopper．!婴!磐i!匹!!：堡!型!!P婴塑垫8NCBI上GenBank登录号2．1．2．3提取小麦组织总RNA提取小麦组织RNA之前，需要用工业酒精将研钵和研杵燃烧处理，等待研钵和研杵冷却之后，称取约为0．1g的小麦组织，置于研钵中进行用力研磨，直到成为很细的粉末，粉末越细，组织破裂越完全，提取的效果越好，将粉末转移到1．5m1离心管(不含RNase，RNA提取过程中所用的离心管均不含RNA酶)中。接着按照以下步骤完成总RNA的提取：(1)向装有组织粉末的1．5ml离心管中加入1mlTrizol试剂，剧烈振荡混匀，以便Trizol可以完全裂解组织细胞，混匀之后室温放置5min。(2)打开1．5ml离心管，加入200Ixl氯仿，剧烈振荡15sec，将离心管放在冰上静置2—3min，14 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用加速有机相和水相的分层。(3)将离心管放入4。C离心机中，以转速12000rpm，离心15min。离心后混合物分成三层：上层为无色的水样层，中间有一层白色物质为蛋白质，下层是苯酚．氯仿层。RNA存在于水相中。(4)用黄色枪头小心将上清吸取到另外一个新的1．5ml离心管中，再向其中加入等体积的异丙醇，之后上下轻轻地颠倒混匀离心管，将离心管放在．20。C冰箱2—3h进行沉淀RNA。(5)沉淀之后，将离心管放在4℃离心机中，以12000rpm转速，离心15rain，收集RNA沉淀。(6)倒掉离心管的上清液，加入1ml75％乙醇(用DEPC处理过的ddH20稀释)，上下轻轻地颠倒离心管进行洗涤沉淀。(7)洗涤之后，将离心管重新放入4。C离心机，12000rpm转速，离心10min(8)重复步骤(6)和(7)。(9)倒掉离心之后的上清液，用黄色枪头小心地吸取离心管底部的上清，将离心管倒置，晾干RNA沉淀之后，加入20ulDEPCddH20溶解RNA。RNA提取之后，取1山RNA使用NanoDrop一2000微量紫外分光光度仪检测RNA的纯度和浓度，标准如下A260／280的比值在1．8．2．1之间，A260／230的比值大于等于2．0。同时，根据RNA的浓度对RNA进行稀释，一般稀释10倍，最后取4-5[tl跑电泳检测RNA的完整性，完整的RNA一般三个条带：28S、18S和5s。2．1．2．4小麦内参基因和病毒CP基因的RT-qPCR引物设计根据表2．1上列出的NCBI登陆号，下载每个基因的编码区序列作为模板设计RT-qPCR的上、下游引物，用于设计引物的软件是PrimerPremier3．0，设计过程中的参数如下：正反向引物的Tm为58—62。C，G+C的含量设为40．60％之间，扩增片段长度为100．400bp，引物长度是18．20bp，设定满足该条件的引物对个数为5个，最终通过实验，找到最好一对引物B口特异性好、不含引物二聚体和发夹结构。每个基因的最优引物对以及该引物对的扩增效率等信息见表2．2。本实验设计的引物均由上海生工生物工程有限公司合成，RT-qPCR引物的纯化方式选择为HPLC。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用表2．2小麦内参基因和病毒cP基因的RT-qPCR引物2．1．2．5反转录(Reversetranscription，RT)使用试剂盒FastQuantRTKit(withgDase)反转录得到5个内参基因和WDv．CP基因的cDNA第一条链。将模板RNA、5xgDNABuffer、FQ—RTPrimerMix、RTEnzymeMix和10XFastRTBuffer在冰上解冻之后，按照操作步骤进行反转录，具体如下：(1)整个实验的操作均需要在冰上完成，保证低温。首先将试剂盒中的试剂和模板总RNA在冰上解冻，解冻完毕之后，进行短暂离心。(2)根据以下步骤配制：5。gDNABuffer2ul总RNAX¨lRNase—FreeddH208-X“l本次实验所反转录的总RNA总量为1嵋，根据上面提取RNA的浓度计算出总RNA的体积，最后用RNase．FreeddH20将体积补齐到IOul。样品配制好之后，经过短暂离心，将离心管置于42℃，3min。(3)根据样品的个数，将以下试剂配制成混合液，之后进行分装到第2步反应之后的离心管：FQ．RTPrimerMiX10×FasII盯BufrerRTEnzymeMixRNase．FreeddH20分装结束之后，同样进行短暂的离心，之后42。C，16产链条一第A附n．一mⅥmmh2l5，℃59m5 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用物可以放在一20"(2保存或置于冰上等待后续实验。2．1．2．6PCR扩增以WDv-CP基因反转录得到的cDNA第一条链为模板扩增WDv．CP基因，扩增的上、下游引物是(F：TGACCAACAAGGACTCCCGAGGTR：CTGTCACCAGTAACACCACCACGAGT)，扩增片段为706bp。PCR体系配好之后在梯度PCR仪器上完成PCR反应，反应体系如下：cDNA模板0．5山正向引物(10gM)2ul反向引物(10gM)2LLIdNTPs2uJ10xPCRbuffer(M92+plus)2．5plTaKaRaTaq(5U／p1)O．3ulddH2015．7Ul总体积25山体系配好之后，PCR的反应程序为：94。C预变性5min；94。C变性45S，退火60"C，1min，退火结束之后在72℃延伸1rain30s；从变性到延伸的步骤进行30个循环，最后72"C总延伸10min。2．1．2．7qPCR(1)qPCR反应的模板是稀释后的cDNA(稀释倍数要根据建立相对标准曲线时候，选取保证每个内参基因的CT值在15．30个循环之间时的稀释倍数为最佳)或者RNase-FreeddH20(作为不含模板的空白对照)。所用的试剂盒为SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)kit，具体的配制方法和剂量如下：2×SuperRealPreMixPlus10山qPCR正向引物(10“M)0．6山qPCR反向引物(10gM)0．6u】50×ROXReferenceDye0．4ulcDNA(稀释后)／ddH203ulRNase-FreeddH205．4u1Total20ul(2)qPCR反应采取的两步法，程序具体如下：17 万方数据95℃15mih．。。一厂95。C10se。l扩增阶段40个循环L60"(232secJ“1“”860℃熔解阶段整个反应是在7500realtimePCR仪(AppliedBiosystems)完成，每个样品均设计为3个技术性重复，反应结束后，仪器会得到每个样品的CT(ThresholdcycJe)值即样品的扩增信号达到设定阈值时候的循环数。2，1．2．8建立每个基因的相对标准曲线将从健康小麦植株中提取的总RNA反转录得到eDNA之后，以4倍进行梯度稀释，即1：4、1：42、1：43、l：44和1：45。这5个稀释后eDNA作为qPCR扩增内参基因的模板，以此为模板，利用每个内参基因的正、反向引物进行qPCR，反应结束之后，程序会自动生成相对标准曲线、扩增曲线和熔解曲线，计算出扩增效率、决定系数。同时，带毒小麦植株提取的总RNA反转录后的cDNA进行5倍稀释，即1：5、1：52、1：53、l：54和1：55。WDV-CP的qPCR模板便是稀释之后的cDNA，同样利用WDV-CP的qPCR引物进行反应，得到相应的相对标准曲线、扩增曲线和熔解曲线，并计算出引物的扩增效率、相对标准曲线的决定系数。2．1．2．9绘制内参基因CT箱线分布图以每一棵植株的茎、叶组织的三个生物重复得到的RNA，反转录成相应的cDNA。同时，根据5个内参基因得到的相对标准曲线得到的最适稀释倍数，将所有样品的cDNA按照合适的稀释倍数进行稀释，之后作为模板进行qPCR，得到每个样品相应的CT(ThresholdCycle)值。使用软件SigmaPlot12．0(Systat，USA)绘制CT箱线分布图，见图2．1，从而进行统计学描述。1“一。e。UeSnS5，O5 万方数据耋星耋晋盏：盛翟：：竺鲨吝篓三茎!：童墓盘：：：考坠茎耋耋三二=：兰至旦兰j：：；喜旦2I210评估内参基因表达稳定性围2I箱缝结构图Fig2IBox-whiskerplotp位敛Medlan-50再分也f±句值Mca”r边缘L0、vcrkncc=10或5日分＆F##nL⋯rOutlier本实验选择三种经常被使用分析内参基因袭选稳定性的统计学软件：GeNorra35(Vandesompde等，2002)、NormFinder0．953(AndeHen等，2004)和BestKeeperverslonl(Pfaffi等，2004)。这三个软件的相同点和不同点介绍如下。相同点：三个软件在分析结果中都包含稳定性参数·M值(GeNorm)、稳定值(NormFinder)和标准差sD(或变异系数cv)(BestKeeper)，三个软件均是稳定参数越小．内参基因表达稳定性越好，反之亦然：不同点：(1)GcNorm和NormFinder在分析之前需螫将CT值进行转换，具体转换公式为Acm=minC'rm—sampleCTm(公式2I)-O。；(E+I)‘帆(公式2．2)，将转换之后的Q。输入软件进行数据分析。而用BestKoeper进行分析时候，直接将岛值输八即可，(2)GeNorm软件不仅可【2上分析内参基因表选稳定性，还可以计算出合适的内参基因数目来分析基因表达舍更好．具体为计算出标准化因子的配对差异(P删irwivⅢ[ati㈣betca1wosequentialnormMizatioafactor)Vn／n+l，程序设定的默认的取舍值是015．换而言之，当Vn／Vn+l>015时，表明第n+1个内参对稳定性有显著影响，当分析基因表达量的时候至少应该选择n+1个内参基因．反之亦然。同时，该软件还可以计算出内参基因的标准化园子(Normalizationfactor．NF)，用于计算基出的相对表达量。而另外两个软件NormFinder和BestKeeper没有这两个功能。19 万方数据：：：：：：望：：：鳖i；：：：馨2=：：：：：馨譬篮：2：：幽2l2II计算基凼相对表达量当GeNonn计算出最佳的内参基因数目，并计算出这些最佳内参基因的NF值之后，我们可以根据公式2I至公式2．5计算基因的相对表达量(RelativeQuantity，RQ)。21．212统计学分析方法AcT目Ⅲ=miⅡcTq_。QⅫ=(E+”1”RQ=Om蚪／NF(公式2．4)(公式2．5)SPSS20(IBMSPSSStatistics20CoreSystem，美国)是所使用的统计学分析软件，主要通过双因素方筹分析(two-wayanalysisofvariance，two·wayANOVA)用来分析cT值在不同组织(羊、叶)和WDV病毒侵染后的筹异。蒯时．利用该软件分别对小麦茎和叶组织中WDV-CP基凼的平均相对表选晕凼使用不同数日内参基阁进行标准化产生的燕异进行单凼幕方差分析(one-wayanalysisofvariancc，one-wayANOVA)·22结果与分析2．2l从健康小麦和带毒小麦中提取总RNA电泳图以健康小麦的总RNA作为5个内参基凼RT-qI：CR的起始摸扳；以带毒小麦的总RNA为WDV-CP基瑚RT-qPCR的起始模板。如图2．2．RNA均为三条带．代表RNA完整，A260／A280都在1．9．21之间．A260／A230都大丁2．0．■■■●●_⋯●●-一●-■-目2．2，J、壹RNA自泳目(MDL2000mark日,l健康小壹．2带毒小麦)Fig．22RNA“ZmⅢ～LMDI．2000markerllH∞Ithywheat：2ⅥmI_k—wheat) 万方数据：2：：：譬望：=暨：：i．：：：：：：：：=：：：：鲨：：叠：：些：鲨：2．22内参基因和WDV．cP基因扩增效率和特异性检测以健康小麦的总RNA为模板进行5个内参基因的RT-qPCR，以带毒小麦的总RNA为模板进行WDV-CP基因的RT-qPCR。所有基因的相对标准曲线具体参数见表2,3，相对标准曲线的决定系数(R2)都大干0980，每个基时所用的引物对的扩增效率为85-101％，都达到了理想的标准，可以用来进行后续实验。另外，如图2．3，每个基吲的熔解曲线呈现出单峰，说明所使用的引物特异性好，不存在圳物一聚体(在Tm值为75℃处会出现一个峰值)。同时，RT-qPCR的产物经过2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，结粜显水为单目的条带，这在另一个角度冉次验证了每个内参基斟的引物是特异性引物。国23十士内参基目目WDV-Cp基目qPCRBI‰特异性幢d【MDL500⋯ke：I空自对照：2-6稀释∞cDNAF镕23Specific如Iec“onforqPCRpNmorpalmofreferencegenesinfa∞“ⅧmLaTldWDV-Cpgeae(MDLS00markcr：LNTC+2-6dilutedeDNA) 万方数据中国农业科学院碰±学位论文第一章小麦件内WDV实时荧光定量PCR件系的建立与匮胃寰2．3小麦内参基目和WDV-CP基目的相对标准血线参数Table2．3Pa㈣nformlatJves忸n出maIr”sofWDV_cPgemandmkr一蚪sinr蝌tlvumLOc肿SLopeY-hlter时EH％DilutionfoId18SrRNA．35122l8240．995926474fold-4。-4’22_3检测健康对照小麦和处理组小麦茎和叶的总P,．NA将带毒的异沙叶蝉从在单株小麦饲毒4天，25天后．时候发现处理组小麦有发病症状．主要是叶尖发黄、叶片变硬．从处理的15株单株小麦中选取9株症状特别明显的植株，由于在以后实验中需要分析WDV侵染前后对每个内参基凼cT值的差异，为了消除健康对照组小麦和处理组小麦群体数目的差异，健康对照组的小麦个数同样为9株。如图2．4，9株健康对照小麦和9株处理组小麦苇、叶组织一个生物学重复(凼三个生物学重复的总样品数为108个．不易全部列山)的总R．NA均为三条带、带型清晰．这说明提取的RNA完齄性良好。利用NaaoDrop2000检测所有的RNA纯度和浓度．A260／A280都在1．9．21之间，A260／A230都太于2．0，说明没有蛋闩质和盐离子的残留．纯度良好，浓度都在500-2000q叫之间，满足实验要求。囝24小壹茎Ⅻ叶蛆织RNA电泳田A健糜小壹(MDL2000咐^∞1-9茎组织；10-14叶m织)；B带毒小麦(MDL2000mamr：[-9茎组织：lO．14叶组缎)CMDL2000marker：1-4健康小麦叶组织：5-8带毒小麦叶组织F1924ToeRNAfromI∞fandstemti％uesofr㈣LAHealthywheat(MDL2000mm{t-9Stemhswe：10-14Leaftlsme)．BⅥmIlf—swheat(MDL2000marker：I-9Stemtissue：10—14Leafti#ue)ICMDL加00m"ker：14Healthyl％rIl#u。；5-8Ⅵmli№⋯]caftis眦呻呻呻呻母!搴怕犏!搴舶=黧㈣蛳蜥§|州嘶0O0n娜州ism㈨加挣加”n饼讲m撕卅 万方数据：：：：篮：：：：：鳖i叠：：：：2=：：：：鉴：：：：：§：普：：=2．24检测处理组小麦茎、叶组织的普通RT-PCR产物如图2．5所示，9株处理组小麦的苇和叶组织中均扩增到目的条带，太小为706bp，即均含有VcDV病毒粒子。表明，这些样品可以用于以后荧光定量PCR反应。圈2,5WDV在小壹茎和叶组织的瞢通RT-PCR产物(MDL2000marker；1目性对照：2空白对照；3-4健康檀楫的姜和叶：5·229株发病小壹的茎和叶)Fig25PCRproductofWDVinthe㈣andl⋯sofZ∞tivumL(MDL2000mⅡkcr：l,P∞itivegOnIfo[：2NTC3-4Stemsand]eRV％ofhealthyWh∞t：5-22S#cmsandI⋯sofvimlifc@uswheat)25五个内参基因c丁值的箱线分布图以9株健康对照小麦和9株处理组小麦苇、叶组织的总RNA(1旭)为模板反转录得到eDNA第一条链．将所有的样品得到的cDNA第一条链用P【Nase．freeddH20稀释50倍之后作为RT-qPCR的模板．利用5个内参基因的RT-qPCR引物完成反应．得到CT值。由予5个内参基因具有相近的扩增效率，网此可以根据它们的cT值粗略地分析这些基闻的表达量·根据荧光定量值收集原理可知，cT值与基凶的表达量呈负相关，换言之，cT值越小．所对应的基因表达景最高，反之亦然。如图2．6．18SrRNA和28SrRNA的cT值在图最下方14，16之问·说明五个基因中18SrRNA和28SrRNA的表达量最高：UBC的cT值悬大，表选量最小：巾TEF-1吨和GAPDH的CT值不相上下．位1中间。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PcR体系6鱼壁立与应旦图2．6健康和带毒小麦茎、叶组织中五个内参基因的cT值的箱线分布图Fig．2．6BoxandwhiskerplotsofvaluesofCTfOrthe5referencegenesintheleafandstemtissuesofhealthy(H)andviruliferous(V)raestivumL2．2．6统计学分析内参基因的CT值差异5个内参基因cT值在病毒侵染前后和在茎、叶两种不同组织中的差异分析见表2．4。病毒侵染前后除了18SrRNA内参基因的CT值差异为显著(P0．05)。同时，对这两个因素同时影响下5个内参基因C。值的差异性也进行了双因素方差分析，结果显示为所有内参基因都是极显著差异。如上所说，本实验中cT值可以反映相应内参基因的表达情况，通过对C，值的差异进行统计学分析可以粗略地反应出内参基因的稳定性，分析结果验证了内参基因并不是一直处于稳定状态，而会受到实验条件等影响(Bustin，2002；Bustin等，2005)。为了进一步确定内参基因的表达稳定性，我们需要利用另外的统计学分析软件和方法进行分析。24 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PcR体系的建立与应用表2．4内参基因C，值在不同实验条件下的差异分析Table2．4VarianceanalysisofCTvaluesunderthedifferentexperimentconditionsTwo．wayANOVA：ns，不显著，P>0．05；‘显著，P‘0．05：¨非常显著，p‘0．01；¨‘极其显著，p<00012．2．7分析内参基因的表达稳定性我们分别利用三种统计学分析软件GeNorm、NormFinder和BestKeepe分析内参基因在小麦茎(表2．5)和叶(表2．6)两种组织中病毒侵染前后的稳定性。小麦茎中内参基因稳定性分析结果：Genorm软件的分析结果：5个内参基因的稳定性排序为：TEF一1一ct>GAPDH>18SrRNA>UBC>28SrRNA；NormFinder分析后根据稳定性大小进行排序的结果是TEF．1．d>GAPDH>UBC>18SrRNA>28SrRNA；13estkeeper分析结果，18SrRNA>28SrRNA>TEF．1一a>GAPDH>UBC。根据前两个软件的分析结果可以一致得知小麦茎中5个内参基因中TEF—1．旺稳定性最好，GAPDH的稳定性次之，28SrRNA稳定最差，而其余两个内参基因的稳定性结果不一致。另外，利用GeNorm软件逐步排除稳定性差的内参基因，最后剩余两个最稳定的内参基因组合为TEF．1一a和GAPDH，见图2．7(A)。同时，由结果可以看出Beskeeper软件分析的结果与前两个软件分析的结果很不一致，这可能是因为前两个软件输入的数据均是将ct值进行转换，而后者则是直接输入CT值进行分析，这个结果与3．5中CT值箱线分布图的结果是一致的。小麦叶中内参基因稳定性分析结果：Genorm软件分析结果：5个内参基因的稳定性排序是：TEF-1一a>18SrRNA>GAPDH>28SrRNA>UBC，NormFinder分析稳定性的结果是GAPDH>18SrRNA>TEF一1一旺>UBC>28SrRNA，Bestkeeper分析后的结果为18SrRNA>28SrRNA>TEF．1．ct>GAPDH>UBC。根据前两个软件结果难以得出某一个基因是最稳定的和最不稳定的，但是当GeNorm软件逐步排除稳定性差的内参基因(Vandesompele等，2002)，可以得出最后剩余两个最稳定的内参基因组合同样为TEF。1．cc和GAPDH，见图2．7(B)。另外，Beskeeper的分析结果与小麦茎中的一致，原因如上所说。利用NormFinder软件，可以获得不用组织或条件下的多个内参基因的最稳定组合的筛选(Andersen等，2004)，在该研究中，再将茎和叶分别设为Groupl和Group2，得出5个内参基因中两个最稳定内参基因的组合是TEF．1．a和GAPDH。同时综合我们使用软件分析的研究结果(特别是前两个软件)也可以得出这个结论。 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用表2．5三个软件对5个内参基因在小麦茎组织中的表达稳定性分析结果Table2．5AnalysisresultsofstabilityrankingsofreferencegenesinthestemtissueofT．aestivumL表2．6三个软件对5个内参基因在小麦叶组织中的表达稳定性分析结果Table2．6AnalysisresultsofstabilityrankingsofreferencegenesintheleaftissueofT．aestivumLTEF．1．aGAPDHUBC18SrRNAl0571．136l2881．1070．199010】0．2450．1670．951．121．260．234．435．034．841．5328SrRNA1．241O．3010．372．30AB图2．7小麦茎(A)、叶(B)组织中剩余内参基因稳定性Fig．2。7AverageexpressionstabilityvaluesofremainingreferencegenesintheleafandstemtissuesofZaestiv“坍L2．2．8选择合适的内参基因数目如图2．8(A)，这是Genorm软件计算出来小麦茎中相邻数目内参基因配对差异vn／n+l(n代表内参基因的数目，n>2)，V2／3=0．176，V3／4=0．227，V4／5=0．216。三个都大于设定的阈值0．15，说明如果利用这个五个内参基因进行分析目标基因在小麦茎中的相对表达量，则至少要选择5个26 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第二章小麦体内WDV实时荧光定量PcR体系的建立与应用内参基因，因为第5个内参基因的加入对稳定性有显著影响。如图2．8(B)，图为Genorm软件分析小麦叶中相邻数目内参基因配对差异Vn／n+l，与小麦茎中的内参基因的分析结果一致，V2／3=0．410，V3／4=0．292，V4／5=0．214，三个数值均大于0．15，同样如果利用这个五个内参基因进行分析目标基因在小麦叶中的相对表达量，则至少要选择5个内参基因。¨旧雾～图2．8选择小麦茎(A)、叶(B)组织中最优数目的内参基因Fig．28DeterminationoftheoptimalnumberofcontrolgenesfornormalizationintheleafandstemtissuesofraestivurnL2．2．9WDV．CP基因在小麦茎、叶中的相对表达量为了进一步说明内参基因的选择对实验结果的影响，本实验利用Genorm软件计算出这5个内参基因在小麦茎、叶中的稳定性，并且逐步排除最不稳定的内参基因，计算出剩余内参基因的标准化因子(Normalizationfactor，NF)。根据剩余不同数目内参基因的NF值计算WDV-CP基因在小麦茎、叶中的相对表达量。小麦茎中：剩余4个最稳定的内参基因是TEF．1．or,、GAPDH、18SrRNA和UBC，剩余3个最稳定的内参基因是TEF．1一a、GAPDH和UBC，剩余2个内参基因的组合是TEF．1．13,、GAPDH，最后选择一个最稳定的内参TEF．1．Ⅱ，一个内参基因的时候Genorm软件不能计算NF。小麦叶中：剩余4个最稳定的内参基因是TEF．1一a、GAPDH、18SrRNA和28SrRNA，剩余3个最稳定的内参基因是TEF．1．or．、GAPDH和18SrRNA，剩余2个内参基因的组合是TEF．1．Ⅱ、GAPDH，最后选择～个最稳定的内参同样是TEF．1．c【。根据公式2．1—2．5以及Genorm计算出的NF值计算WDV衣壳蛋白基因在9株处理组小麦茎和叶组织中的平均相对表达量，标准误差sE是指每个样品所对应的三个生物学重复之间。计算结果如图2-9所示，从整体趋势上看，WDv_CP基因在小麦茎中的平均相对表达量高于叶组织，原因可能是因为叶蝉所属的半翅目昆虫介体在传播病毒时候吸食植物的韧皮部(Ng等，2006)，进入植物体内的病毒主要通过胞间连丝完成细胞间的运输也就是短距离运输，而病毒在植物体内的长距离运输主要通过与韧皮部的有机物一起运输(Scholthof，2005)。因此，推测由异沙叶蝉介体传播的WDV病毒粒子进入小麦植株的韧皮部中，运输方向是由叶片顶端向茎和根部组织运输，所以才导致茎组织中WDV-CP基因的平均相对表达量高于叶组织。 万方数据中目农nl}学院碰l学位论女第一帝小麦体自WDV实H荧光定量PCR体系的建m‘，』Ⅲ用另外，如图所示．当使用不用内参基I扫数目分析WDV-CP基凼的平均相对量时，使用1个内参基W时候的标准误差E最大，而使用5个内参基斟的标准误差最小，这也符合了2．28分析该实验最适选择内参基硼数目的结粜。I司时，在统计学方面利用SPSS软什对不l司内参基出数目对WDV-CP基州在小麦摹和叶组织中的相对表达量进行了单崮囊古差分析。分析结果显示．在小麦的苇和叶组织中都是P<0001，差异为极显著性。说明在进行RTUBC>Beta-TUB>GAPDH>18SrRNA>ACT2，NormFinder分析后根据稳定性大小进行排序的结果是RPs23e>uBc>GAPDH>18srRNA>Beta-TuB>AcT2，Bestkeeper分杪i结果，RPs23e>GAPDH>UBC>Beta．TUB>ACT2>18SrRNA。三个软件分析后均可以得出最稳定的内参基因是RPS23e，而前两个软件分析的最不稳定内参基因是ACT2，Bestkeeper分析的结果则是18SrRNA。分析原因，可能是因为Genorm和NormFinder软件在分析数据之前需要将得到的c。值转换之后才能进行分析，而Bestkeeper软件则是直接将CT值输入进行分析。另外，GeNorm软件逐步排除稳定性差的内参基因，最后剩余两个最稳定的内参基因组合为Beta-TUB和UBC(图3．6)。表3．6三个软件对6个内参基因在异沙叶蝉中的表达稳定性分析结果Table3．6AnalysisresultsofstabilityrankingsofreferencegenesinPalienusL 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第三章异沙叶蝉体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用屯=¨幽¨}●__■‘州n棚e●__=净图3,6剩余内参基因稳定性Fig．3．6Averageexpressionstabilityvaluesofremainingreferencegenes3．2．8选择合适内参基因数目图3．7为Genorm软件计算出的异沙叶蝉体内的相邻数目内参基因配对差异Vrdn+l(n代表内参基因的数目，n>2)，V2／3=0．216，V3／4=0．191，V4／5=0．182，V5／6=0．191。四个数值均大于设定的阈值0．15，V2／3大于0．15即假如原来只选择两个内参基因来分析基因的相对表达量，当Genorm软件再将第三个内参基因加入重新来评定所选内参基因的稳定性时，发现第三个内参基因的加入对现有内参基因辅助分析基因相对表达量的稳定性有影响，因此在计算基因的相对表达时候推荐使用3个内参基因。以此类推，V5／6>0．15说明如果利用这6个内参基因进行分析目标基因在异沙叶蝉中的相对表达量，则至少要选择6个内参基因，因为第6个内参基因的加入对分析基因的相对表达量的稳定性有显著影响。因此研究表明当研究分析WDv．CP基因的相对表达量时，需要这6个基因同时使用。国3．7选择最优数目的内参基因Fig．3．7Determinationoftheoptimalnumberofcontrolgenesfornormalization 万方数据中国农业科学院硕士学位论文第三章异沙叶蝉体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用3．2．9不同取食时间点WDV—cP基因在异沙叶蝉体内的相对表达量为了进一步说明内参基因的选择对实验结果的影响和验证本实验在异沙叶蝉体内建立的实时荧光定量PCR体系的适用性，本实验利用Genorm软件计算出这6个内参基因在异沙叶蝉中的表达稳定性(M)，并且逐步排除最不稳定的内参基因，计算出剩余内参基因的标准化因子(Normalizationfactor，NF)。根据剩余不同数目内参基因的NF值计算WDv-CP基因的相对表达量。Genorm软件计算出来的结果：剩余5个最稳定的内参基因是RPS23e、UBC、Beta．TUB、GAPDH和18SrRNA，剩余4个最稳定的内参基因是RPS23e、UBC、Beta-TUB和GAPDH，剩余3个内参基因的组合是RPS23e、UBC和Beta-TUB，剩余2个内参基因的组合为UBC和Beta-TUB，Genorm软件不能计算两个以下的内参的NF值，因此当选择一个内参基因进行标准化时候，选择稳定性最好的RPS23e。综上所述，本实验分别用了1个内参基因，2个内参基因，3个内参基因，4个内参基因，5个内参基因和6个内参基因进行分析不同时间点WDv-CP基因在异沙叶蝉体内的平均相对表达量，计算公式参照第二章公式2．I至公式2．5，同时计算出每个时间点的三个生物学重复的标准误差SE。如图3．8所示，随着异沙叶蝉在带毒扬麦12上饲毒时问的延长。WDv_CP在异沙叶蝉中的表达量在12h．48h呈现出递减趋势，接着从48h．96h开始慢慢增加，到96h的时候WD％CP基因在异沙叶蝉体内的相对表达量达到最高值。随后，WDv．CP基因的表达量在96h．120h再一次出现递减趋势，120h-156h又再一次表现为递增趋势。分析原因如下：WDV在异沙叶蝉体内有两条循回路径，第一条路径是在异沙叶蝉获毒几分钟后WDV就可以直接从滤室通过血腔进入唾液腺，从而可以进行病毒的传播，但是这个路径下异沙叶蝉体内的WDV病毒只能保持几个小时，第二条途径异沙叶蝉获毒之后，WDV穿过前肠和中肠到达血腔，通过血腔到达唾液腙，这种方式与其他持久性传播的植物病毒在它们对应介体中的移动路径相似(Hogenhout等，2008)。同时，本实验室已经证明在异沙叶蝉获WDV病毒4h之后，病毒快速从滤室排出运输到唾液腺或者是前中肠和中中肠部分(wang等，2014)。因此，可以推测在12h之前WDV已经开始在异沙叶蝉体内进行累积，而到了12h的时候，中肠部分的病毒有可能也到达了唾液腺，存在唾液腺的病毒粒体可以通过异沙叶蝉的口器进入植物的韧皮部，故12h．48h出现了异沙叶蝉体内WDV_CP表达量下降的趋势。对于持久非增殖性病毒传播的病毒到达植物体内，病毒只能局限在植物的韧皮部组织中复制(Hogenhout等，2008)，而叶蝉所属的半翅目昆虫介体在传播病毒时候恰恰是吸食植物的韧皮部(Ng等，2006)。所以当异沙叶蝉介体继续取食带毒的小麦寄主，介体内的病毒的表达量再一次升高，如此反复，WDV_CP基因的表达量在异沙叶蝉体内呈现出一个动态过程。类似的现象已经在蚜虫可传播BYDV-PAV中得到验证(Gildow。1993；Chay等，1996；wu等，2014)另外，如图所示，当使用不用数目的内参基因分析WDv_CP基因的平均相对表达量时，使用1个内参基因时候的标准误差E最大，而使用6个内参基因的标准误差E最小，这也符合了3．2．8分析该实验最适选择内参基因数目的结果。同时，在统计学方面利用SPSS软件对选择不同数目内参基因时WDv-CP基因在异沙叶蝉中的相对表达量差异进行了单因素方差分析。分析结果显示，PPsammotettixstriatusisolate2010SXHC18SribosomaIRNAgene，partialsequence，1035bpCTCGCGGTGTCAACTGGCATGTCTTGTGGGACGTCCTGCCGGTGGTGGTCCGGTCCCTCGGGTATGTGTAGGTCCGCCGAAGCATCCCGTGGGTTCCGGCTGCCGATTCAATCCCGCCGCGGTGCTCTTGACTGAGTGTCGAGGTGGGCCGGCACGTTTACTTTGAACAAATTAGAGTGCTlAAAGCAGGCTGATTTCTGCCTGAArllACTGTGTGCATGGAATAATGGAATAGGACTTCGGTTClW丌TTGTTGGTTTTAAGAATCCGAAGTAATGATTAATAGGGACAGGCGGGGGCATTCGlATTGCGACGrrAGAGGTGAAATTCTTGGATCGTCGCAAGACGTACCTAAGCGAAAGCATIq'GCCAAGTATGTCCTCGTTAATCAAGAACGAAAGTTAGAGGTTCGAAGGCGATCAGATACCGCCCTAGTTCTAACCATAAACGATGCCAGCCAGCGATCCGCCGAAGTTCCTCCGATGACTCGGCGGGCAGCTTCCGGGAAACCAAAGCTTTTGGGTTCCGGGGGAAGTATGGTTGCAAAGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACCCAACACGGGAAACCTCACCAGGCCCGGACACCGGAAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTCGGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACTCTAGCCTGCTAACTAGGCGTTTCCGGTATCCACAATAGTGCTACCGGCGAATAAAATTCTTCTTAGAGGGACAGGCGGCTllCTAGCCGCACGAGACTGAGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGAAGGAATCAGCGTGTCTTCCCTGGCCGAAAGGTCCGGGTAACCCGTFGAACCTCCTTCGTGCTAGGGATTGGGGCTTGCAATTGTTCCCCATGAACGAGGAATTCCCAGTAAGCGCGAGTCATAAGCTC>Psammotettixstriatusisolate2010SXHCglyceraidehyde-3-phosphatedehydrogenasemRNA，partialcds，941bpATCGGTCGTCTGGTGCTGAGAGCTTCTCTGGAACGAGGTGGTCAGGTGGTCGCCATCAATGACCCGTTCATCGGGCTGGACTACATGGTCTACATGTTCAAGTACGACTCTACCCACGGCCGTTTCAAGGGCGAGGTCAAGGCCGAAGGCGACTTCCTCGTTGTCAACGGTAACAAGATCGCGGTGTTCTCCGAGCGAGACCCCAAAGCCATTCCCTGGGGCAAGGCTGGAGCCGAGTACGTCGTAGAGTCCACTGGTGTCTTCACCACCATAGACAAGGCCTCAGCCCATCTGGAGGGAGGCGCCAAAAAGGTGATCATCTCTGCGCCGAGCGCAGACGCACCGATGTTTGTCGTCGGCGTCAACCTGGACGCGTACGACCCGAGCTACAAGGTCGTCTCCAACGCCTCCTGCACCACCAACTGCCTGGCGCCGCTCGCCAAGGTCATCCACGACAACTTTGAGATCGTCGAGGGTCTGATGACCACCGTACACGCCACCACCGCCACACAGAAGACCGTCGACGGGCCTTCCGGCAAGCTGTGGCGTGACGGGCGTGGCGCCCAGCAGAACATCATCCCCGCTGCCACCGGAGCCGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCCGCTCTCAACGGCAAGTTGACTGGCATGGCCTTCCGAGTGCCCGTGCCCAACGTATCCGTCGTCGACCTCACCGTCAGGCTGGGCAAGGACGCCAGCTACGATGACATCAAGGCGAAGGTGAAGGAAGCGTCCGAGGGCCCGCTGAAGGGCATCCTCGGCTACACCGAGGACGACGTAGTCTCGTCCGACTTCATCGGCGACAACCATTCCTCCATCTTCGACGCCAAGGCGGGCATCCCGCTCAACGGCAAGTTCGTCAAGCTCATCTCATGGTATGACAATGAGTACGGTATTCCAGCAGAGTCATTGACCTCATC55 万方数据中国农业科学院硕士学位论文附录>PREDICTEDPsammotettixstriatusisolate20lOSXHCubiqnitin-gOnjugatingenzyme，462bpATGGCATTAAAACGAATTAATAAGGAACTGCAAGACCTGGGCCGTGATCCGCCAGCACAGTGTTCTGCAGGCCCTGTCGGGGATGATCTATTTCATTGGCAAGCCACAATTATGGGACCTCCTGACAGTCC√钳1ACCAAGGAGGAGl’A11TC‘兀’TTTAACAATTCATTTTCCTACAGACl、ATCCCTTCAAGCCTCCAAAGGTrGCATTCACAACTAGAATTTATCATCCAAACJ盯AAATAGCAATGGTAGCATTTGTCTTGACATCCTGAGATCCCAGTGGTCACCTGCATTAACAAIArCAAAAGTGCTGCTGTCAATTTGCTCGTTGCTCTGTGATCCGAACCCAGATGATCCACTAGTACCCGAGATTGCAAGGATATACAAAACAGATCGAGAGAAGlACAACGAACTGGCTCGAGAArGGACG>Psammotettixstriatusisolate2010SXHCactinmRNA，partialcds，906bpAGAGCAAGAGAGGTATCCTCACTCTCAAGTACCCCATCGAGCACGGCATCATCACCAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCl、ACAACGAGTTGCGAGTCGCCCCCGAGGAGCACCCCATCCTGCTCACTGAGGCCCCCCTCAACCCCAAGGCCAACAGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTGAGACCTTCAACACCCCCGCCATGTACGTCGCCATCCAGGCCGTGCTCTCCCTGTACGCTTCCGGTCGTACCACCGGTATCGTCCTGGACTCCGGCGACGGTGTCTCCCACACTGTCCCCATCTATGAAGGTTACGCTCTGCCCCACGCCATCCTCCGTCTGGACTTGGCTGGCCGAGACTTGACCGACTACCTGATGAAGATCCTGACTGAGCGCGGTTACTCTTTCACAACCACCGCTGAGCGAGAAATCGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTACGTCGCTCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGCCACCGCCGCCGCCTCCACCTCCCTGGAGAAGTCCTACGAGTTGCCCGACGGCCAGGTCATCACCATCGGCAACGAGAGGTTCAGGTGTCCCGAGGCCCTCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGTATGGAATCCTGCGGTATCCACGAGACCGTCTACAACTCCATCATGAAGTGCGACGTCGACATCCGTAAGGACCTGTACGCCAACACCGTCCTGTCCGGTGGTACCACCATGTACCCCGGTATCGCTGACAGGATGCAGAAGGAGATCACCGCCCTCGCGCCCTCCACCATCAAGATCAAGATCATCGCTCCCCCTGAGAGGAAGTACTCCGTATGGATCGGTGGATCCATCCTTGCCTCTCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCTCCAAGCAAG>Psammotettixstriatusisolate2010SXHCmRNAforbeta-tubulin，partialcds，532bpAAGATCAGAGAGGAATATCCCGACAGAATAATGAACACATACTCGGTAGTCCCCTCGCCCAAAGTATCTGACACCGTAGTAGAACCATACAACGCCACCCTCTCAGTCCACCAGCTTGTAGAGAACACCGACGAAACATACTGCATTGACAACGAAGCCCTGTACGACATCTGCTTCCGCACACTCAAACTGTCCACCCCCACATACGGAGACCTGAACCATCTCGTGTCTCTGACCATGTCCGGCGTCACCACCTGCCTGAGGTTCCCTGGTCAACTCAACGCGGACCTGCGTAAACTGGCCGTCAACATGGTGCCCTTCCCCCGCCTCCACTTCTTCATGCCCGGCTTCGCCCCTCTGACGTCGCGCGGCAGCCAACAGTACCGAGCGCTCACAGTGCCCGAGCTGACCCAACAGATGTTCGACGCCAAGAACATGATGGCCGCCTGCGACCCGCGTCACGGACGTTACCTCACCGTCGCCGCCATCTTCCGAGGCAGGATGTCAATGAAGGAAG"ITGATGAACAGATGC>Psammotettixstriatusisolate2010SXHC40SmRNAforribosomalprotein$23，partialcds，295bpGG'ITFGCGAACTGCACGTAAACATGTCAACCACCGTCGTGAACAACGGTGGGCTGACAAGGACTACAAGAAAGCTCACTTAGGTACAAGATGGAAGGCCAACCCTTTTGGTGGTGCCTCACACGCCAAGGGAATCGTTCTTGAAAAAGTAGGTGTTGAAGCTAAGCAGCCTAACTCAGCTATTCGTAAGTGTGTCCGAGTACAACTCATCAAAAATGGAAAGAAAATCACAGCCTTCGTTCCCA 万方数据中国农业科学院硕士学位论文附录GGGACGGTTGTTTGAACTACATCGAGGAAAACGACGAAGTTCTGGTCGCAGGATTCGGTCGTAAGGGTCATGCCGTrGGTGACA竹CCCGGTGTCAGGTTCAAGGTCGTGAAGGTTGCCAATGTTTCACTGCTTGCATTGTACAAAGAGAA57 万方数据中国农业科学院硕士学位论文致谢J致谢光阴似箭，岁月如梭，转眼间三年的读研生涯即将结束。回首三年前，当初自己刚从大学出来，带着稚气走进了农科院植保所的大家庭。很庆幸能在这里结识这么多优秀的老师，很庆幸自己在粮食作物病害组度过了我人生中最宝贵的年华，在这里不仅增加了自己的专业知识，更重要的是学会了更好的为人做事。衷心的感谢我的导师吴蓓蕾副研究员，感谢吴老师三年来对我实验上的指导和生活上的关心，感谢您在我实验遇到挫折时的鼓励和帮助，感谢您从最初的开题到最终的撰写论文和毕业答辩都付出了大量心血。吴老师，谢谢您!衷心的感谢王锡锋研究员，感谢您费心考虑为本实验如何选题，感谢您及时纠结不严谨的实验思路，感谢您在文章撰写方面提出宝贵的建议。每一次听完你的建议，总有一种醍醐灌顶的感觉，这些方方面面都体现了您的治学严谨，学术功底深厚。谢谢您，王老师!衷心的感谢和蔼可亲的周广和老师，平易近人的李莉老师和刘艳老师。感谢您们在生活上的关心和指导。尤其是在吴老师出国学习的一年时间里，感谢李老师对实验提出指导性的建议和实验实施方面的大力支持。谢谢您们!真诚的感谢本实验的刘文文师姐、武科科师姐、王彪师兄、李羽师姐、秦发亮师兄、金文师姐以及王亮、赵艺泽和JAMAL—U—DDIN等兄弟姐妹，感谢你们的陪伴和实验上的帮助。感谢JamesWinThan总是舍己为人的帮助我，总是帮助我灭土、种苗和接种到很晚，往往错过饭点，同时，你的乐观豁达是值得我一辈子学习的生活态度，谢谢你!感谢实验室刘贝贝、张宏波、王慧、简熠、冯耿等师弟师妹们，在实验上给予帮助，在生活上和我一块儿忘记所有的不快乐，大胆向前迈进。感谢武丽姐在实验材料上对我的大力帮助和生活上的关心，真的非常感谢你们，很庆幸我的人生轨迹能与你们相遇相交!真诚的感谢我的家人在生活上给予我悉心的照顾和呵护，感谢老爸时刻督促我不断开拓自己的知识面，感谢老妈叮嘱我吃好饭，穿好衣，不时地开导我!感谢男友刘海勋对我生活上的关心和精神上的理解、支持与呵护!真诚的感谢评阅老师在百忙之中对我的论文工作提出宝贵的建议，谢谢您们! 万方数据中国农业科学院硕士学位论文作者简历姓名：尚晓楠出生日期：1989年9月籍贯：河南三门峡最后学位：农学硕士毕业院校：中国农业科学院研究生院作者简历教育经历2012．09⋯．2015．06中国农业科学院植物保护研究所植物病理学攻读硕士学位2008．09⋯．2012．06河南科技大学植物保护专业获学士学位读研期间开展的研究工作1．为分析重组对小麦矮缩病毒群体遗传结构和寄主适应性的影响做了基础工作，协助分析了小麦矮缩病毒自然群体的重组特点与共进化位点；2．构建了马铃薯x病毒实时荧光定量PCR体系，为解析以侵染性克隆为基础的PVX病毒群体在不同寄主中的适应性进化机理奠定基础；3．小麦矮缩病毒实时荧光定量PCR体系在小麦和异沙叶蝉中的建立与应用。读研期间发表与待发表的文章1．WuB，ShangX，SchubegJ，eta1．Global—scalecomputationalanalysisofgenomicsequencesrevealstherecombinationpatcemandcoevotutiondynamicsofcereal·infectinggeminiviruses[J]。Scientificreports，2015，5：81532．《马铃薯x病毒实时荧光定量PCR体系建立及应用》在2015年5月被《植物保护》杂志录用。3．“IdentificationandvalidationofarelativequantitativeRT-PCRnormalizationforWheatdwarfvirusintheleafhopperandwheat”已投稿Viruses。