猪繁殖与呼吸综合征病毒（prrsv）调控nlrp3介导的炎症反应的分子机制研究

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分类号：S852.65学校代码：10712UDC：579.62研究生学号：2012060161密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究学科专业预防兽医学研究方向分子病原学与免疫学研究生王超指导教师张改平教授完成时间2015年10月中国陕西杨凌 Classificationcode:S852.65Universitycode:10712UDC:579.62Postgraduatenumber:2012060161Confidentialitylevel:OpenDissertationforDoctorDegreeNorthwestA&FUniversityin2015REGULATIONOFNLRP3-MEDIATEDINFLAMMATORYRESPONSESDURINGPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS(PRRSV)INFECTIONMajor:PreventiveVeterinaryMedicineResearchfield:MolecularEtiologyandImmunologyNameofPostgraduate:ChaoWangAdviser:Prof.Gai-PingZhangDateofsubmitted:October2015YanglingShaanxiChina 本研究由国家自然科学基金青年基金（31302073）；国家自然基金重大基础研究计划(31490600)；国家重点基础研究发展计划（973计划）（2014CB542700）；国家自然基金面上项目（31472177）；河南师范大学博士启动基金（5101049170153）ThisworkwasfundedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(grantno.31302073),thekeyprojectofNationalNaturalScienceFund(No.31490600),a973Program(No.2014CB542700),NationalFoundationofChina(grantno.31472177)，theDoctoralStartingUpFoundationofHenanNormalUniversity(5101049170153) 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博壬学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工《关于规范西北作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校此规定一初后果与法律责任均农林科技大学研究生学术道德的督行规定》，，如果违反由本人承担。■＾乂，论文尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外中不包含其他人色经发表或撰写过的研究结果，也不色含其他人和自己本人色获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已。与我在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签違；王＾时间：２却＞＞＇ｒ月呼目导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博去研究生所呈交的博去学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签若时间：年／方月日Ｉ 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归论属文西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存北或向国家有关部口或机构送交的纸质版和电子化，允许论文被查阅和借阅；壬同意西文农全林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博学位论文数据业库》进行出化，并享受相关权盖。位本人保证，在毕离开王（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学（毕业）论文及其相关的作成果时，将从西北农林科理技大学为第一署違单也否则，愿意按任何《收中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处并承担法律责任。存和保管本论文各种化本的其他单位改和个人（包括研究生本人）未经本论文行作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修、发行、出租、改编等侵犯著作权的。为；蛋则，术违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究课律赛任＜Ｖ，，（保密的学位论文在保密期限内，不得任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）￣研究生签名；王时间：ＺＰ年／〕－月曰／）签＾＾导师名：时间：年＇之月曰＾金＼ 猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究摘要猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是严重危害养猪业的重大病毒性传染病，其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应，引起机体免疫抑制，造成持续性感染，从而给该病的防控带来困难。PRRSV感染可以引起机体强烈的间质性肺炎，诱导肺部许多促炎性细胞因子的产生。最近的研究表明PRRSV可以激活NLRP3介导的炎症反应，诱导促炎性细胞因子IL-1β的分泌。炎症反应是机体天然免疫系统中抵抗病毒入侵的坚固防线，但是对PRRSV如何调控炎症反应从而实现免疫逃逸的研究还未见报道。因此，本篇论文对PRRSV调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制加以研究。其主要内容和结果如下：1.PRRSV激活NLRP3炎症小体的动态变化情况。用PRRSVBJ-4株在不同时间点（12h、24h、48h、72h）感染猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages,PAMs），利用荧光定量PCR和ELISA方法检测NLRP3介导的炎症反应信号通路中重要组分的mRNA水平和IL-1β的蛋白水平，发现NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平和细胞上清中的IL-1β在PRRSV感染早期都呈现上升趋势，并分别在24h和48h达到峰值，但是在感染晚期NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平急剧下降，并与空白对照组水平相当，IL-1β的蛋白水平在之后的阶段也呈现出下降趋势。而不同剂量PRRSV感染PAMs的实验发现，PRRSV上调的procaspase-1、pro-IL-1β的mRNA水平和IL-1β的蛋白水平呈明显的剂量依赖效应。这些实验结果表明PRRSV通过上调NLRP3信号通路蛋白而促进早期炎症反应，但在感染晚期，PRRSV可能通过某种机制而抑制了NLRP3介导的炎症反应。因此接下来本研究首先确证PRRSV激活的炎症反应是NLRP3炎症小体所依赖的，然后筛选鉴定PRRSV编码抑制炎症反应的组分，最后探究PRRSV感染早期促进炎症反应的分子机制。2.PRRSV诱导IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症小体。分别利用NLRP3的特异性抑制剂Glyburide以及针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs对NLRP3炎症小体进行抑制和干扰，结果发现，Glyburide能够显著抑制由PRRSVBJ-4株诱导的IL-1β的分泌，而且，针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs可以显著下调该基因的表达，并且也能够显著抑制由PRRSV诱导的IL-1β的分泌。3.PRRSV非结构蛋白nsp11和nsp1α是抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β分泌的病毒组分。分别将nsp11及其核酸内切酶活性缺失的突变体和nsp1α及其缺失或突变N 端锌指（ZF）结构的突变体转染PAMs细胞，结果发现，nsp11和nsp1α都能够抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高以及由LPS和尼日利亚菌素（Nigericin）引起的IL-1β蛋白水平的升高。进一步的突变实验结果显示nsp11的核酸内切酶活性以及nsp1α的N端锌指结构对于其抑制作用是必需的。然后，在已重构NLRP3炎症小体模型的HEK293T细胞上转染PRRSVnsp11和nsp1α及其突变体的真核表达质粒，得到与PAMs细胞上相一致的实验结果，进一步确定nsp11和nsp1α对NLRP3炎症小体介导的IL-1β表达的抑制作用。4.PRRSV上调的miR-373能促进炎症反应。我们的前期实验发现PRRSV感染MARC-145细胞后上调宿主miR-373的表达，而进一步的实验发现，在LPS和Nigericin共同刺激的PAMs细胞上过表达miR-373，可以显著增加NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌以及促进NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA水平的升高，从而促进炎症反应的发生。另外，PRRSV感染PAMs细胞后可以显著下调miR-373的靶基因TGFBR2（免疫抑制性受体）的表达。综上所述，PRRSV感染激活NLRP3炎症小体并产生IL-1β等促炎性细胞因子来抵御病毒入侵和保护机体的同时，病毒自身又编码能拮抗NLRP3炎症小体活化的蛋白——nsp11和nsp1α，抑制炎症反应的发生，从而使其能够在宿主体内持续增殖。另外，首次发现miR-373可以促进炎症反应的发生，可能参与调控PRRSV引起的天然免疫反应过程。PRRSV感染可以显著上调miR-373并下调其靶基因TGFBR2的表达，促进感染早期炎症反应的发生。因此，本研究进一步发现了PRRSV抵抗天然免疫的新机制——拮抗NLRP3炎症小体活化，为PRRSV的防控提供了潜在的分子靶点和理论基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；nsp11；nsp1α；NLRP3炎症小体；IL-1β REGULATIONOFNLRP3-MEDIATEDINFLAMMATORYRESPONSESDURINGPORCINEREPRODUCTIVEANDRESPIRATORYSYNDROMEVIRUS(PRRSV)INFECTIONABSTRACTPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)isanimportantviralinfectiousdiseaseinswineindustryworldwide.Thecausativeagentisporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),whichcaninhibithostinnateandadaptiveimmuneresponse,causeimmunosuppression,andleadtopersistentinfection.SoitisdifficulttocontrolanderadicatePRRS.PRRSVcancauseastronginterstitialpneumoniaininfectedpigs,andinduceproinflammatorycytokinesinlung.RecentstudieshaveshownthatPRRSVactivatedtheNLRP3inflammsomeandinducedIL-1βsecretion.Theinflammatoryresponseisthesolidlineinhostanti-viralimmunity;however,howPRRSVregulatetheinflammatoryresponsetoescapetheimmunologicsurveillanceremainsunknown.Therefore,thisstudyfocusedonthemolecularmechanismofhowPRRSVregulatedtheNLRP3-mediatedtheinflammatoryresponse.Theresultsofthisstudywereasfollows:1.ThedynamicchangesofNLRP3inflammasomeduringPRRSVinfection.PAMswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferenttimes(12h,24h,48h,72h),then,NLRP3,ASC,procaspase-1andpro-IL-1βmRNAexpressionandIL-1βproductionweredetectedbyqPCRandELISA.TheobtainedresultsshowedthatPRRSVcouldinduceNLRP3,ASC,procaspase-1andpro-IL-1βmRNAexpressionandsecretionofIL-1βinearlyinfectioninporcinealveolarmacrophages(PAMs),butthelevelsofpro-IL-1βmRNAandIL-1βproteindecreasedtoadegreethatwassimilartothelevelofthemock-infectedgroupinlaterinfection.AnddifferentdoseofPRRSVinfectioninducedprocaspase-1andpro-IL-1βmRNAexpressionandsecretionofIL-1βatadosedependentmanner.TheexperimentresultsshowedthatPRRSVpromotedearlyinflammatoryresponsethroughup-regulatingNLRP3signalingpathwayproteins,butinhibitedNLRP3-mediatedinflammatoryresponsethroughsomeunknownmechanismsinlaterinfection.SothefollowingstudiesfirstconfirmedwhethertheinflammatoryresponseinducedbyPRRSVwasdependentontheNLRP3signalingpathway,andthenscreenedthecomponentsofPRRSVwhichinhibitedtheinflammatoryresponse.Finally,thisstudyexploredthemolecularmechanismonhowPRRSVpromotedtheinflammatoryresponseinearlyinfection.2.ThesecretionofIL-1βinducedbyPRRSVisdependentontheNLRP3inflammasomepathway.NLRP3inhibitor-glyburideandspecificsiRNAtargetingNLRP3or ASCwereusedtoinhibittheNLRP3inflammasomeactivation.TheresultsshowedthatglyburidecouldinhibitthesecretionofIL-1βinducedbyPRRSVsignificantly.AndthesiRNAtargetingNLRP3orASCcoulddown-regulatedthegeneexpressionandtheIL-1βinduction.3.PRRSVnsp11andnsp1αarethecomponentstoinhibitNLRP3inflammasomemediatedIL-1βsecretion.PAMsweretransfectedwithPRRSVnsp11andtheinactivatedendoribonucleasemutantsornsp1αandthedeletionormutationofZinc-Finger(ZF)domainmutants.Theresultsshowedthatnsp11andnsp1αcouldinhibittheexpressionofpro-IL-1βmRNAinducedbylipopolysaccharide(LPS)andthesecretionofIL-1βinducedbyLPSplusnigericin.Furthermore,themutationstudiesshowedthattheendoribonucleaseactivityandZFdomainwereessentialfornsp11andnsp1αtoinhibitthesecretionofIL-1β.Then,theNLRP3inflammasomewasreconstructedinHEK293Tcellswhichwerethentransfectedwithexpressionplasmidencodingnsp11,nsp1αandthemutants.TheresultswereconsistentwiththatinPAMs,whichfurtherdeterminedtheinhibitionofnsp11andnsp1αtoNLRP3inflammasomemediatedIL-1βsecretion.4.MiR-373isup-regulatedbyPRRSVanditcanpromotetheinflammatoryresponse.OurpreviousstudyshowedthatPRRSVcouldup-regulatemiR-373expressioninMARC-145cells.AndfurtherstudyfoundoverexpressionofmiR-373inPAMsstimulatedbyLPSplusnigericincouldincreasesecretionofIL-1βandNLRP3,procaspase-1andpro-IL-1βmRNAexpression,whichcouldpromotetheinflammatoryresponse.Inaddition,PRRSVinfectioncoulddown-regulatedtheexpressionoftargetgeneTGFBR2(immuno-inhibitoryreceptor)ofmiR-373significantly.Inconclusion,PRRSVinfectioncouldactivatetheNLRP3inflammasomeandinducedtheproinflammatorycytokineIL-1βsecretionwhichcanprotecthostfromthevirusinvasion.Meanwhile,PRRSVcouldencodensp11andnsp1αtoantagonizetheactivationofNLRP3inflammasomeandinhibittheinflammatoryresponse,whichwereinfavorofthevirusproliferation.Inaddition,weforthefirsttimefoundthatmiR-373couldpromotetheinflammatoryresponseandregulatetheinnateimmuneresponseinducedbyPRRSV.PRRSVinfectioncouldup-regulatedmiR-373anddown-regulatedTGFBR2expressionsignificantly,whichpromotedtheinflammatoryresponseinearlyinfection.OurstudyrevealsanewmechanismthatPRRSVantagonizehostinnateimmuneresponsesandmayprovidesomeinsightsintotheresearchonmoleculartargetsofanti-PRRSVdrugsandpreventionofPRRS.KEYWORDS:Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,nsp11,nsp1α,NLRP3inflammasome,IL-1β 目录文献综述....................................................................................................................................1第一章PRRSV研究进展........................................................................................................11.1PRRSV概述................................................................................................................11.2PRRSV分子生物学研究进展....................................................................................21.2.1PRRSV非结构蛋白.............................................................................................31.2.2PRRSV结构蛋白.................................................................................................71.3PRRSV分子免疫学研究进展..................................................................................101.3.1PRRSV引起的天然免疫反应...........................................................................111.3.2PRRSV引起的体液免疫反应...........................................................................111.3.3PRRSV引起的细胞免疫反应...........................................................................121.4PRRSV致病机制研究进展......................................................................................121.5PRRSV诊断与预防研究进展..................................................................................14第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展....................................................................152.1NLRP3炎症小体.......................................................................................................152.1.1炎症小体的结构................................................................................................152.1.2炎症小体的类别................................................................................................162.1.3NLRP3炎症小体的活化....................................................................................172.1.4非经典的炎症小体活化途径............................................................................182.1.5炎症小体的抑制................................................................................................192.2PRRSV、miRNAS与IL-1β......................................................................................21试验研究..................................................................................................................................25第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究........................................................................253.1材料与方法...............................................................................................................253.1.1材料....................................................................................................................253.1.2方法....................................................................................................................273.2结果...........................................................................................................................333.2.1猪不同组织中NLRP3基因的鉴定..................................................................333.2.2PAM-CD163细胞中NLRP3基因的鉴定........................................................333.2.3PRRSV不同毒株在PAM-CD163细胞上感染力（毒力）的测定................343.2.4间接免疫荧光（IFA）检测PRRSV在PAM-CD163细胞上的感染情况...353.2.5PAM-CD163细胞上IL-1β表达情况的鉴定...................................................353.2.6PAMs细胞上IL-1β表达情况的初步鉴定.......................................................373.2.7PAMs细胞上NLRP3炎症小体的动态变化情况...........................................37 3.2.8PRRSV诱导的IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症小体..................................383.3讨论...........................................................................................................................393.4小结...........................................................................................................................41第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究..............................................424.1材料与方法...............................................................................................................424.1.1材料....................................................................................................................424.1.2方法....................................................................................................................434.2结果...........................................................................................................................494.2.1重组质粒的构建................................................................................................494.2.2nsp11的核酸内切酶活性是其抑制NLRP3炎症小体活化所必需的............504.2.3nsp1α的N端ZF结构是其抑制NLRP3炎症小体活化所必需的................564.3讨论...........................................................................................................................594.4小结...........................................................................................................................62第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应..................................................................635.1材料与方法...............................................................................................................645.1.1材料....................................................................................................................645.1.2方法....................................................................................................................645.2结果...........................................................................................................................685.2.1miR-382-5p和miR-541-3p可以促进PRRSV的复制....................................685.2.2miR-382-5p候选靶基因的筛选........................................................................695.2.3miR-382-5p通过直接靶向IFNAR1来降低其表达........................................705.2.4PRRSV上调MARC-145细胞中miR-373的表达..........................................725.2.5miR-373可以促进NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达............................725.2.6PRRSV下调TGFBR2在PAMs上的表达......................................................745.3讨论...........................................................................................................................755.4小结...........................................................................................................................76全文总结..................................................................................................................................77本论文创新点..........................................................................................................................78参考文献..................................................................................................................................79缩略词....................................................................................................................................101致谢....................................................................................................................................103作者简介................................................................................................................................105 第一章PRRSV研究进展1文献综述第一章PRRSV研究进展猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV）是一种导致现代养猪业损失严重的病毒病原体，该病毒是有嚢膜的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目动脉炎病毒科动脉炎病毒属。猪繁殖与呼吸综合征（PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS），又称蓝耳病，是由该病毒引起的一种母猪繁殖障碍以及仔猪和生长育肥猪呼吸困难的接触性传染病，可以感染不同年龄和品种的猪，以妊娠母猪及一月龄仔猪最为易感。临床特征包括了母猪的繁殖障碍以及仔猪严重的呼吸系统疾病和不良的生长状况导致的高病死率。然而，在生产系统中，PRRSV感染主要是以一种亚临床感染的形式存在，作为混合感染的一种因素参与到各种多微生物疾病综合征当中，比如猪呼吸道疾病综合征（PorcineRespiratoryDiseaseComplex,PRDC）和猪圆环病毒相关疾病（PorcineCircovirusAssociatedDisease,PCVAD）。PRRS最早于1987年在美国发现，很快就流行于美洲、欧洲和亚洲等养猪国家(Patonetal.1991;Russelletal.1980)。我国自1996年由郭宝清等首次分离到PRRSV（CH-1a株）（郭宝清1996），到目前为止，大部分省份都有PRRS疫情的报道。2006年，我国十几个省市广泛流行一种严重的生殖道疾病，称为无名高热，后经证实是一种由新型毒力更强的PRRSV毒株引起的。测序分析表明，这些分离毒株在Nsp2上均存在30个氨基酸的缺失，由此说明PRRSV正在不断变异，也正是这种变异对病毒的致病性产生了重要的影响，增强了该病的流行性，也对防制该病毒的流行增加了困难。目前对该病的预防主要依靠免疫接种，但是在弱毒疫苗和灭活疫苗的使用过程中，存在安全性和有效性不足的问题(Labarqueetal.2004;Nielsenetal.2001;Niluboletal.2004;Scorttietal.2007;Scorttietal.2006)。该病的流行给养猪业造成巨大的经济损失，占各类猪传染病总损失的1/3(Lewisetal.2007)，对肉食品安全及市场供应构成严重威胁。1.1PRRSV概述作为引起PRRS的病原，PRRSV于1991年在欧洲被分离到并命名为莱利斯塔德病毒（Lelystadvirus,LV）(Wensvoortetal.1991)，之后在美国也被分离到并命名为VR-2332(Benfieldetal.1992)。经过核苷酸序列比对后，将PRRSV分为基因1型和基因2型，分别为欧洲型和北美洲型。在所有非结构蛋白中，nsp1和nsp2是病毒中变化最大的部分，同源率分别在50.5%-54.3%和24.4%-28%；在这两种基因型中，nsp9的保守性最高，同源率达到73.2%-75%，而最保守的结构蛋白为M蛋白（75.2%-81.6%）(Darwichetal.2011)。我国的分离毒株大多数为北美洲型PRRSV，但也有少量的欧洲型。虽然这两种基因型的病毒几乎同时出现并且引起相似的临床症状，但是它们之间毒株的抗原性、 2猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究遗传性和致病性存在差异性，基因序列大概只有70%的同源率(Allendeetal.2000;Nelsenetal.1999;Woottonetal.2000)，不同基因型并且每个基因型的毒株之间也存在广泛的基因变异，其中美洲型毒株之间的变异性更大。2006年，我国南方爆发的高致病性蓝耳病，临床特征为高热（41℃-42℃）、高发病率以及高死亡率。仔猪发病率达100%，死亡率达50%以上，妊娠母猪流产率达30%以上，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。经证实其致病原为nsp2基因中有30个氨基酸的不连续缺失（童光志2007）的PRRSV变异株（HighlypathogenicPRRSV,HP-PRRSV）(Lietal.2007;Tianetal.2007;Zhouetal.2008)。然而，最近一项研究报道，高致病性PRRSV变异株毒力增强的原因并不是nsp2基因变异导致的，而是nsp9和nsp10共同作用导致了HP-PRRSV的高复制效率和毒力(Lietal.2014b)。PRRSV在环境中很不稳定，不会长久存活，对干燥、热、酸和碱敏感。在-70℃到-20℃的条件下可以存活数月到数年，在20℃到21℃条件下，病毒在1-6天内仍具有感染力，在37℃条件下，病毒在3-24小时内具有感染力，在56℃条件下，病毒仅能维持6-20分钟。PH值在6-7.5之外，病毒毒力迅速丧失，对PH条件特别敏感。所以，PRRSV的这种理化特性导致了在其流行期间，并不能被持续的从流产胎儿以及死胎中分离出来。PRRSV很容易被消毒剂、洗涤剂、乙醚和氯仿等脂溶剂灭活。PRRSV具有典型的嗜单核细胞/巨噬细胞特性，在体内，PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞（Porcinealveolarmacrophages,PAMs），在体外，主要感染非洲绿猴肾细胞系MA-104及其衍生物MARC-145。PRRSV呈杀细胞式复制，可以引起细胞变圆、皱缩、聚集成堆和核固缩。PAMs作为PRRSV的天然靶细胞，其各种毒株在PAMs上都有很强的适应性，一旦PRRSV感染，PAMs就会被激活并产生广泛的炎症反应，而且会引起肺部和胎盘等组织的损伤(Thanawongnuwechetal.2004)，增加继发感染的敏感性甚至引起死亡。然而，其作用机制并不清楚。1.2PRRSV分子生物学研究进展PRRSV为有嚢膜且表面有纤突的单股正链RNA病毒，与马动脉炎病毒（equinearteritisvirus,EAV）、小鼠乳酸脱氢酶病毒（lactatedehydrogenase-elevatingvirus,LDV）和猴出血热病毒（simianhemorrhagicfevervirus,SHFV）同属尼多病毒目动脉炎病毒科(Meulenbergetal.1993)。PRRSV基因组全长约15kb，包含至少10个开放阅读框（openreadingframes,ORFs），两侧是5’和3’非翻译区（UntranslatedRegions,UTR）。其中，ORF1a和ORF1b占据整个基因组75%的区域，编码两个大的多聚蛋白（polypeptides,pp）pp1a和pp1ab，经过酶水解为至少16个非结构蛋白（nonstructuralproteins,nsps），其中14个nsps主要参与病毒基因组的复制和转录(Snijderetal.2013)，另外2个非结构蛋白nsp2TF和nsp2N为核糖体移码的产物(Fangetal.2012b;Lietal.2014a)。整个蛋白的水解过程主要由病毒的4个非结构蛋白来完成，分别是nsp1α、nsp1β、nsp2和nsp4。 第一章PRRSV研究进展3ORF2-ORF7在基因组的3’端，编码8个结构蛋白，分别是GP2、E、GP3、GP4、GP5、ORF5a蛋白、非糖基化膜蛋白（M蛋白）和核衣壳蛋白（N蛋白）(Allendeetal.1999;Firthetal.2011;Johnsonetal.2011;vanDintenetal.1999)，GP5和N蛋白是PRRSV的主要结构蛋白，而N蛋白具有很多抗原表位且能够刺激机体最早产生抗体，虽然这些抗体并不具有中和作用，但在血清学调查和诊断上有很大应用价值。GP5和GP3以及GP4都含有中和表位，但GP5上的抗原表位并不是PRRSV的免疫优势表位。PRRSV基因变异和持续性感染是当前研究PRRSV防控策略的关键难题，GP5和nsp2则是病毒最易发生变异的蛋白，GP5的变异性表现在氨基酸缺失和序列变化以及糖基化位点缺失和修饰等方面。而2006年我国发现的高致病性变异株正是由于nsp2两个位点上共30个氨基酸的不连续缺失导致的，分别为482位亮氨酸和534-562位共29个氨基酸的缺失。PRRSV基因组结构见图1-1。图1-1PRRSV基因组结构(Rascon-Casteloetal.2015)Fig.1-1PRRSVgenomeorganizationPRRSV的非结构蛋白是在病毒感染后首先表达出来的一批蛋白质，在参与病毒的复制（nsp9-nsp12）和毒力（nsp3-nsp8）方面发挥重要的作用(Kwonetal.2008)。特别是nsp9-RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRp）和nsp10-RNA解旋酶（Hel）主要参与了病毒RNA的合成，连同假定的“附属子单元”组成膜相关的病毒复制转录复合体（ReplicationandTranscriptionComplex,RTC）(Pedersenetal.1999)。这个复合体主要负责病毒基因组的复制和一系列嵌套式亚基因组（subgenomic,sg）mRNAs的合成，这些亚基因组是尼多病毒的遗传标记，它们具有共同的5’和3’末端(deVriesetal.1990)，负责结构蛋白的合成(Pasternaketal.2006;Snijderetal.1998)。最近的研究表明这些非结构蛋白在调控猪感染PRRSV后的免疫反应和发病机制等方面起着至关重要的作用，比如nsp1α/β、nsp2、nsp4、nsp7和nsp11。PRRSVnsps在病毒与宿主相互作用方面的研究以及利用反向遗传学研究病毒基因组等技术手段的进步都为PRRSV的疫苗研发和诊断试剂的开发提供了很好的理论依据。1.2.1PRRSV非结构蛋白nsp1是一个含有383个氨基酸的多功能蛋白质，在pp1a的氨基端，包括了nsp1α（180个氨基酸）和nsp1β（203个氨基酸）两部分，nsp1属于自我催化剪切且位点发生在Met或His180处（北美洲型或欧洲型）。nsp1α相对保守而nsp1β高度变异(Darwichetal.2011)。nsp1已经被确定的几个重要的结构功能域分别是Papain-like半胱氨酸蛋白酶 4猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究（Papain-likecysteineprotease,PCP）、2个锌指结构功能域（Zincfinger,ZF）和一个核酸酶功能域(Fangetal.2010;Sunetal.2009;Xueetal.2010)。PCP结构域在很多正链RNA病毒多聚蛋白的N端，包括了小核糖核酸病毒、冠状病毒、动脉炎病毒和瘟病毒，对于多聚蛋白的加工是必需的(Chenetal.1996;denBoonetal.1995;Gorbalenyaetal.1991;Guarneetal.2000;Harcourtetal.2004;Karpeetal.2011;Limetal.2000;Mielechetal.2014;Snijderetal.1994)。动脉炎病毒的PCP结构域主要负责将nsp1从pp1a和pp1ab上水解下来，同时也负责将nsp1水解为nsp1α和nsp1β。基于nsp1中PCP的数量，可以将其分为PCP1α、PCP1β或PCP1γ。见图1-2。PCP1的正确加工处理过程对于病毒基因组RNA和mRNA的合成是必需的，一旦发生功能性的损伤就会对PRRSV的复制产生极大的影响(Kroeseetal.2008)。PRRSVnsp1αPCP的活性位点主要是Cys76和His146或147，而nsp1β则是Cys276和His345(Kroeseetal.2008)。图1-2动脉炎病毒非结构蛋白nsp1示意图(Hanetal.2014)Fig.1-2Schematicpresentationofnsp1ofarteriviruses通过对不同动脉炎病毒的nsp1序列进行分析，发现其N端的ZF结构域比较保守，nsp1α的晶体结构显示其N端ZF的拓扑结构在超过1000个已知的转录因子ββαZF家族 第一章PRRSV研究进展5中是相似的(Sunetal.2009;Tijmsetal.2001)。然而，PRRSVnsp1αC末端的锌离子功能域的生物学功能还不是很清楚，突变其M180（C70-C76-H146-M180）位氨基酸并不影响nsp1α对于β干扰素（IFN-β）的抑制(Shietal.2012)，提示C末端的ZF结构域可能并没有参与到抑制IFN-β的过程中，而突变N末端的ZF结构域（C8-C10-C25-C28）则使nsp1α完全失去对IFN-β的抑制(Shietal.2013)，同时也会影响到病毒的转录过程(Tijmsetal.2007;Tijmsetal.2001)，提示N末端的ZF结构在nsp1α发挥其免疫抑制活性的过程中是必需的。PRRSVnsp1β的晶体结构显示其并不存在ZF结构，然而其具有的核酸酶活性可以降解双链DNA或单链RNA(Xueetal.2010)。在PRRSV的感染过程中，促炎性细胞因子和I型干扰素的产生会被不同程度的抑制，PRRSV可以逃避宿主的免疫监控从而持续存在。目前为止，已经发现至少6个蛋白可以作为IFN的拮抗剂来调节天然免疫信号通路：nsp1α/β、nsp2、nsp4、nsp11和N蛋白，在这些蛋白中，nsp1α/β拮抗IFN产生的作用最强烈。nsp1α可以抑制I型干扰素的产生以及破坏IFN启动子的活性，抑制NF-κB的激活，引起CREB(cyclicAMPresponsiveelementbinding)-bindingprotein（CBP）的降解，抑制TNF-α启动子的活性；nsp1β可以抑制I型干扰素的产生以及破坏IFN启动子的活性，干扰干扰素调节因子3（Interferonregulatoryfactor3,IRF3）的磷酸化以及IRF3的核定位，影响IFN-α的产生和干扰素刺激基因（Interferon-stimulatedgene,ISG）的表达，通过降解核转运蛋白（Karyopherin-α1,KPNA1）来阻止ISGF3的核转移，抑制TNF-α启动子的活性(Beuraetal.2010;Chenetal.2010a;Hanetal.2013;Kimetal.2010;Pateletal.2010;Songetal.2010a;Subramaniametal.2010;Wangetal.2013b)。动脉炎病毒在与宿主相互作用的过程过程中进化出能够逃避宿主天然免疫系统的策略使其自身能够在宿主体内长期存在并增殖。PRRSVnsp1在天然免疫调控和影响促炎性细胞因子以及I型干扰素的产生等方面的作用已经被广泛地研究。无论是在天然免疫还是特异性免疫方面I型干扰素是宿主抗病毒反应强有力的工具，然而，在猪体内PRRSV却能够抑制干扰素的产生，这也许可以解释PRRSV引起机体持续性感染的机制。nsp11是一个含有223个氨基酸且比较保守的蛋白质，由动脉炎病毒的ORF1b区域编码，具有尿嘧啶核苷酸特异性的核糖核酸内切酶活性（Nidovirusendonucleasespecificforuridylate,NendoU）(Ivanovetal.2004;Snijderetal.2003)。迄今为止，在其他RNA病毒中并没有发现和NendoU相对应的部分，是尼多病毒特有的遗传标记。通过反向遗传学基因定点突变技术证明了NendoU在动脉炎病毒的复制周期中具有重要作用(Posthumaetal.2006)，但NendoU具体的功能，特别是在其感染细胞中的天然底物仍不清楚。体外重组马动脉炎病毒（Equinearteritisvirus,EAV）和PRRSV的nsp11可以表现出广泛的底物特异性，裂解单链RNA和双链RNA底物3’端的嘧啶类化合物(Nedialkovaetal.2009)。过表达nsp11通常是具有毒性的，其在感染细胞中对于病毒RNA底物具有相似且广泛的活性使得NendoU呈现“自杀式”的表达，所以被称为尼多病毒 6猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究的自杀酶。这就暗示了其对于RNA底物在感染过程中的处理是受到严格调控的，也许是由nsp11在复指结构中的位置决定的。PRRSVnsp11、EAVnsp11和非典型性肺炎病毒（SARS-CoV）nsp15同属于XendoU家族且都具有核糖核酸内切酶活性(Snijderetal.2003)。值得注意的是，突变EAVNendoU的三个关键位点中的任意一个（His-126、His-141、Lys-170）并没有对其自身产生特别大的影响，对于亚基因组mRNA的合成表现出较弱且特异性的功能性缺失，但至少减少了5个病毒滴度，提示sp11可能参与到了动脉炎病毒复制的多个环节中。体外实验表明，替换EAVNendoU的三个关键位点中的任意一个可以显著降低NendoU的活性，和其他尼多病毒缺失核酸内切酶活性的实验结果相一致(Guarinoetal.2005;Ivanovetal.2004;Nedialkovaetal.2009;Xuetal.2006)。冠状病毒上的突变实验也证明病毒感染需要其核酸内切酶活性来发挥作用(Ivanovetal.2004;Kangetal.2007)。同样，本实验室前期研究表明，突变PRRSVnsp11NendoU的三个关键位点中的任意一个（His-129、His-144、Lys-173）都不能抑制IFN-β的产生，nsp11的核糖核酸内切酶活性在病毒抵抗宿主防御系统中发挥着重要作用(Shietal.2011)，见图1-3，这和其他实验室之前的研究结果相一致，PRRSVnsp11利用其核酸内切酶活性来抑制IRF-3和IFN-β的产生(Yooetal.2010)。对于核酸内切酶活性在单股正链RNA病毒生命周期中的了解为评估NendoU成为抗病毒药物的靶标提供了充分的理论依据。图1-3PRRSVnsp11、EAVnsp11和SARS-CoVnsp15序列比对示意图(Shietal.2011)Fig.1-3SequencealignmentsofPRRSVnsp11,EAVnsp11andSARS-CoVnsp15最近一项研究表明，利用构建成功的MARC-nsp11细胞系，发现IFN-β、IRF-3和NF-κB的活性受到抑制，更加佐证了nsp11作为病毒的干扰素拮抗剂的作用。另外，利用Affymetrix外显子芯片技术发现受到nsp11调控的基因根据它们在信号通路中的作用可以划分为5个大组：组蛋白相关、细胞周期和DNA复制、丝裂原激活的蛋白激酶（Mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）信号、补体和泛素蛋白酶体通路。流式细胞术实验结果显示，nsp11可以引起在S期的细胞周期延迟，溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine,BrdU）染色后更加确定了在nsp11过表达的细胞中发现的细胞周期停滞现象(Sunetal.2014)。病毒介导的细胞周期调控比较常见且有利于病毒自身的增殖。PRRSVN蛋白通过调节核糖体RNA在细胞核中的合成来影响细胞周期的进程(Yooetal.2003)，而现在的研究结果表明nsp11在细胞质中发挥其调控细胞周期的作用。nsp2是PRRSV非结构蛋白中分子量最大且最易变异的蛋白，不同基因型和不同毒株之间同源性都很低，包含至少4个独立的区域：N端的papain-like蛋白酶区、中间的 第一章PRRSV研究进展7高变区、假定的跨膜区、C端的富含保守半胱氨酸残基但功能未知的区域(Fangetal.2006;Snijderetal.2013;Ziebuhretal.2000)。nsp2在被感染细胞中大量表达，与nsp3和nsp5一同调节被感染细胞的细胞膜，使其利于病毒复制过程中多蛋白复合物的组装。完全裂解的nsp2作为nsp4的辅助因子，在裂解nsp4/5的过程中发挥作用(Wassenaaretal.1997)。最近的研究表明，nsp2可能与病毒粒子的组成有关(Kappesetal.2013)，这就可能解释了为什么nsp2抗体在感染猪群中具有免疫优势，能够引起强烈的体液免疫反应(deLimaetal.2006;Oleksiewiczetal.2001)。nsp2具有顺式（181-323aa）和反式（47-240aa）两种切割活性，病毒的包装与反式切割活性密切相关(Hanetal.2009)。另外，nsp2可以通过其泛素降解活性来抑制干扰素的产生(Sunetal.2010)，在调控天然免疫反应方面具有重要的作用。nsp2还含有一些线性B细胞免疫优势表位，如ES2-ES7(Oleksiewiczetal.2001)。突变体病毒缺失在高变区中的ES3表位可以增加细胞毒活性和病毒感染滴度，在巨噬细胞中，可以降低诱导IL-1β和TNF-α的表达潜力(Chenetal.2010b)。2006年，我国南方爆发的HP-PRRSV在nsp2中缺失的30个氨基酸正是位于B细胞表位区(Tianetal.2007)。在Hela细胞中，nsp2可以激活NF-κB通路，和其高变区有关，所以在不同的毒株上这种作用可能会有所不同(Fangetal.2012a)。nsp2可以阻止IκBα的降解以及ISG15的产生和ISG化(Sunetal.2012b)。nsp4是糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，是病毒中最重要的蛋白酶，因为其催化活性（His-1103、Asp-1129、Ser-1184）可以将病毒多聚蛋白水解为非结构蛋白nsp3-nsp12(vanDintenetal.1996;Wassenaaretal.1997)。最近研究报道，HP-PRRSV毒株JXwn06的nsp4可以抑制IFN-β、NF-κB和IRF-3(Chenetal.2014;Maetal.2013)，且nsp4通过靶向NF-κB的必需调节因子（NEMO）来抑制IFN-β的产生(Huangetal.2014a)。nsp9和nsp10是动脉炎病毒RNA合成中的关键蛋白酶，其保守性最高。nsp9又称为RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRp），nsp10又称为解旋酶。nsp9的C端为复制功能区，上游为未知功能的区域。从大肠杆菌中纯化出来的具有酶活性的EAVnsp9可以启动RNA的从头合成(Beerensetal.2007)。通过对动脉炎病毒nsp9功能的研究可以为尼多病毒RNA合成机制和抗病毒药物的研发提供帮助。nsp10可以利用ATP水解释放出来的能量使RNA解螺旋，同nsp9一样，它也是病毒复制酶单元的一部分，其N端为预测的锌离子结合域。这个结构域在所有尼多病毒的解旋酶当中是比较保守的，包括了13个保守的半胱氨酸和组蛋白残基(vanDintenetal.2000)，对于nsp10在体外发挥ATP酶和解旋酶活性也是很重要的(Seybertetal.2005)。1.2.2PRRSV结构蛋白PRRSV的主要结构蛋白包括GP5、M和N蛋白，组成PRRSV的主要结构，并且参与到病毒的免疫逃避和抗体生成等方面，次要结构蛋白包括GP2a、GP2b（E）、GP3、GP4，这些结构蛋白在病毒感染和产生子代病毒的过程中是必需的，但只有GP5、M和 8猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究N蛋白可以组装成病毒样颗粒(Wissinketal.2005)。图1-4PRRSV囊膜蛋白拓扑结构示意图(Dokland2010)Fig.1-4TopologyofPRRSVenvelopeproteinsGP2糖蛋白又称GP2a糖蛋白，含有256个氨基酸（PRRSV基因I型含有253个），在N端的信号肽序列位于1-40位氨基酸，之后是一段168个氨基酸的胞外区，一个单独的TM螺旋和一个20个氨基酸的胞内区(Wissinketal.2004)。见图1-4。GP2含有2个保守的糖基化位点，分别是Asn-171和Asn-178（基因I型）、Asn-173和Asn-179（基因II型），但是这些糖基化位点至少在基因I型病毒中并不是感染所必需的(Meulenbergetal.1995b;Wissinketal.2004)。GP2可以与PRRSV的细胞受体CD163分子相结合，介导PRRSV的吸附、脱衣壳和基因组释放，所以GP2可能与中和抗体的产生有关(Dasetal.2011)。GP2b糖蛋白又称E蛋白，由ORF2b编码产生，完全包含在ORF2a中(Wuetal.2001)。E蛋白是一个非糖基化蛋白，由70-73个氨基酸组成(Wuetal.2001)，EAV的E蛋白和其感染性有关但并不参与病毒颗粒的组装(Snijderetal.1999;Wieringaetal.2004)。E蛋白包括了一个单独的TM螺旋并会形成一个低聚物的离子通道(Leeetal.2006)。见图1.4。E蛋白和病毒融合以及内吞的过程密切相关，和其相似的蛋白也在其他病毒中有所发现，比如流感病毒的M2蛋白(Pintoetal.1992)和甲病毒的6K蛋白(Meltonetal.2002)。因为病毒会融合到低PH值的内涵体中，所以这些蛋白形成离子通道需要较低的PH值(Gonzalezetal.2003)。最近的一项研究报道，PRRSV的E蛋白可以激活PAMs中的炎症小体(Zhangetal.2013)，提示病毒中的离子通道蛋白在诱发机体免疫反应方面具有重要作用。GP3糖蛋白是PRRSV中糖基化程度最高的囊膜蛋白，含有254个氨基酸（基因I型含有265个氨基酸）(Goninetal.1998;Wieringaetal.2002)。GP3的拓扑结构不是很清楚，预测显示在1-27位氨基酸有一个跨膜（TM）结构，在183-200位氨基酸有一个TM结构。见图1-4。2个基因型之间的同源性仅为58%，但是变异程度最高的区域在C末端30-50位氨基酸，基因I型病毒含有一个额外的11个氨基酸的延伸。两个基因型之间胞外区具有70%的同源性。在PRRSV和EAV中第一个TM结构包含了信号肽序列，但是研究发现EAV的信号肽并没有裂解开(Wieringaetal.2002)，表明该蛋白的N端和C 第一章PRRSV研究进展9端同时锚定在膜表面。GP3还可以引起机体很强的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫。GP4糖蛋白含有178个氨基酸（基因I型含有183个氨基酸）(Meulenbergetal.1997;vanNieuwstadtetal.1996)，包括了1-21位的信号肽，156-177位的TM螺旋结构。GP4含有4个糖基化位点，分别在37、84、120和130位，至少3个糖基化位点在发挥作用，而EAV缺少第4个糖基化位点(Wieringaetal.2002)。GP4蛋白同时含有B细胞和T细胞表位，参与病毒引起的免疫反应。GP2、GP3和GP4相互结合在嚢膜表面形成多聚复合物(Dasetal.2010;Wissinketal.2005)，见图1-5。至少在基因I型病毒中，E蛋白也构成了复合物的一部分，缺少任何一个蛋白都不能使复合物形成(Wieringaetal.2003b)。在EAV中，GP2-GP3-GP4由二硫键相互连接而成(Dasetal.2010;Wieringaetal.2003a;Wieringaetal.2004)，而PRRSV中并没有，该复合物可以通过GP4和GP5进行相互作用。这些蛋白都和病毒的感染性有关，但并不参与病毒粒子的组装(Wissinketal.2005)。目前为止，这些次要结构蛋白还没有直接的晶体结构信息。图1-5PRRSV囊膜蛋白相互作用示意图(Dokland2010)Fig.1-5Mapofprotein–proteininteractionsinthePRRSVenvelopeGP5和M蛋白构成了PRRSV嚢膜的主要部分，包括了几乎一半的病毒蛋白，在病毒结构中形成异源二聚体(Deaetal.2000;Mardassietal.1996;Meulenbergetal.1995b;Wissinketal.2005)。在感染性克隆上缺失这2个ORF中的任何一个都会导致病毒粒子组装失败，而缺失次要结构蛋白并不会引起这种现象(Wissinketal.2005)。然而，共表达GP5、M和N蛋白并不足以使EAV形成病毒样颗粒（Virus-likeparticles,VLPs），还需要其他蛋白来辅助病毒粒子的组装和释放(Wieringaetal.2004)。基于序列信息的拓扑结构预测显示，M蛋白的174位氨基酸是非糖基化的，包括了一个N端含有16个氨基酸残基的胞外区、3个跨膜区和C端含有84个氨基酸残基的胞内区。见图1-4。M蛋白是PRRSV中最保守的结构蛋白(Mengetal.1995)，与EAV之间仅有22%的同源性。GP5糖蛋白含有200个氨基酸（基因I型含有201个氨基酸），是PRRSV中变异性 10猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究较高的蛋白，2个基因型之间有51-55%的同源性(Kapuretal.1996;Murtaughetal.1995)。GP5蛋白的高度变异性使得针对GP5的中和抗体不能为同种病毒提供交叉保护(Meng2000)。GP5包括了N端1-31位的信号肽区，然后是一段胞外区并含有2个糖基化位点Asn-44和Asn-51（LV中为Asn-46和Asn-53）(Wissinketal.2004;Wissinketal.2005;Wissinketal.2003)。见图1-4。M和GP5之间的二硫键位于M蛋白的第9位半胱氨酸和GP5蛋白的第48位半胱氨酸。GP5第60-125位氨基酸疏水区包括了1个或3个跨膜螺旋，PRRSV中预测到的最后一个跨膜螺旋，在第107-125位氨基酸之间，第二个跨膜区在63-82位，而胞外区只含有30个氨基酸，所以观察到的病毒粒子表面非常光滑。GP5还含有一个非常大的胞内区，从130-200位氨基酸，是尼多病毒特征，关于GP5和M蛋白较大胞内区的功能仍需要进一步的研究。GP5和M蛋白的主要功能是构成病毒粒子的结构，可能参与病毒组装和出芽。GP5还可能参与到了病毒与宿主接触时的相互作用和与宿主细胞膜的融合方面。另外，GP5也能够刺激机体产生中和抗体，为PRRSV的防制提供了切入点。N蛋白又称核衣壳蛋白，与病毒RNA一起组成病毒的核衣壳，包含123个氨基酸（基因I型包含128个氨基酸）。N蛋白是感染细胞中表达最丰富的蛋白质，由ORF7编码产生，ORF7是由病毒中最小的亚基因组mRNA表达而来(Deaetal.2000;Meulenbergetal.1995b)。N蛋白具有最强的免疫原性，但是抗N蛋白的抗体并不能起到免疫保护和中和的作用(Murtaughetal.2002)。N蛋白被划分为N端的RNA结合域和C端的二聚体化功能域。N端序列的第1-57位氨基酸被认为是无序的而且包含了大量的正电荷，负责RNA的结合作用(Yooetal.2003)。PRRSV不同毒株之间以及PRRSV与其他动脉炎病毒之间序列最大的不同就在这个区域(Meulenbergetal.1995a)，可能是因为较宽松的结构限制导致的。在N端区域的疏水序列是第21-33位氨基酸构成的一个α-螺旋，可能与其它N蛋白形成卷曲螺旋结构。N蛋白是以二硫键连接成的二聚体组装在病毒粒子上，这种二聚化作用存在于N端螺旋中的第23位半胱氨酸(Mardassietal.1996;Woottonetal.2003)。据报道，N蛋白在MARC-145细胞中可以激活NF-κB，并且第30-73位氨基酸对于其激活作用是必需的，为更好的理解PRRSV感染和炎症反应的机制提供了基础(Luoetal.2011)。1.3PRRSV分子免疫学研究进展PRRSV感染不能够引起有效的天然免疫反应，从而使适应性免疫反应也较弱。特异性IgM于感染后7天出现而IgG则于感染后14天出现，但是中和抗体的产生具有延迟现象，约4-5周的时间。细胞免疫方面，PRRSV感染树突状细胞和巨噬细胞，会引起巨噬细胞聚集从而导致病毒在体内长期持续性感染。这种感染可使部分猪终生带毒并不断排毒，进而导致整个猪群发生循环感染。此外，PRRSV感染极易引发细菌或病毒的二次感染，加剧宿主的组织损伤。PRRSV具有较高的遗传变异性，因此针对PRRSV免 第一章PRRSV研究进展11疫力不足的问题一直存在着。1.3.1PRRSV引起的天然免疫反应天然免疫系统，特别是I型干扰素信号通路是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线。然而，PRRSV也相应的进化出能够逃避宿主免疫监测的策略，最终可以持续存在于宿主体内引起慢性感染。干扰素是一类多功能的细胞因子，在抗病毒防御反应和介导适应性免疫方面发挥着巨大的作用。干扰素通常被划分为I型和II型，I型干扰素是抗病毒天然免疫反应主要的细胞因子，根据动物种类分为不同的亚型。在PRRSV感染的猪体内，病毒能够以较低的水平持续存在并复制。病毒在动物体内首先引起急性感染并持续3-4周，然后造成持续性感染。在持续性感染时期，病毒血症消失并且在主要的淋巴组织和其他免疫优势区域如扁桃体和淋巴结，病毒的复制受到限制(Beyeretal.2000;Rowlandetal.2003)。病毒的持续存在也许是由较弱的免疫反应导致的，比如中和抗体出现较晚以及天然免疫系统被抑制等。在PRRSV感染的猪体内，肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactorα,TNF-α）被下调而白介素-10（Interleukin-10,IL-10）被上调表达，并且I型干扰素的产生被抑制，虽然PRRSV对I型干扰素是极其敏感的。在PRRSV感染的MARC-145细胞中，IFN-α和IFN-β的转录水平并没有升高，且病毒是通过RIG-I信号通路介导的这种抑制作用(Luoetal.2008)，PRRSV激活NF-κB和AP-1但却抑制了IRF-3的表达。PRRSV非结构蛋白中被报道可以抑制I型干扰素表达的有nsp1、nsp2、nsp4和nsp11(Kimetal.2010)。研究显示PRRSV的非结构蛋白nsp1α和nsp2都可以抑制NF-κB的激活，nsp1α通过抑制IκBα的磷酸化来阻止NF-κB核转移，而nsp2可以从底物上解离出泛素或ISG15(Frias-Stahelietal.2007)。PRRSV不仅抑制干扰素的产生过程，在其分泌之后也有抑制效应。在IFN-α处理的MARC-145细胞中，感染24h后，JAK-STAT通路被抑制，ISGF3的核转移也被阻止(Pateletal.2010)。PRRSV可以引起细胞凋亡，干扰素启动刺激因子-1（IFNpromoterstimulator-1,IPS-1）的干扰就是很有利的证据。研究表明IPS-1可以作为I型干扰素和细胞凋亡之间的桥梁，nsp11可以降解IPS-1mRNA的表达，从而抑制I型干扰素的产生(Leietal.2009)。抑制IPS-1从而抑制细胞凋亡可以作为PRRSV免疫逃避的策略之一。在PRRSV感染过程中，Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）也参与其中，比如TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9。在未成熟的树突状细胞中，感染后6h，TLR3、TLR7和TLR8被下调表达，24h除了TLR7其余的都恢复到正常水平(Chaungetal.2010)。TLR3的激活可以增加对PRRSV的抗病毒反应，减少病毒的复制(Sangetal.2008)。PRRSV感染PAMs细胞后可以通过TLR4信号通路诱导炎症反应(Bietal.2014)。1.3.2PRRSV引起的体液免疫反应在PRRSV感染过程中，抗体的出现比较迅速，特别是针对N蛋白的抗体，但是这些抗体并没有起到保护作用，而且会引起抗体依赖性增强效应（Antibody-dependent 12猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究enhancement,ADE）(Tiradoetal.2003)。即在抗体水平较低的时候，其并不能阻止病毒的感染，反而会帮助病毒进入靶细胞，增强病毒复制并增加疾病的严重程度，是一种在病毒感染过程中由病毒和抗体的复合物来增强病毒感染的想象。特异性中和抗体出现较晚，在感染后的4-5周，主要是针对GP5、GP4、GP3，特别是GP2的中和抗体(Batistaetal.2004;Goninetal.1999;Kwangetal.1999;Weilandetal.1999)，GP2b蛋白可能在病毒感染晚期诱导产生中和抗体，而针对GP5蛋白产生的中和抗体的保护力最强，在感染后的6-7周出现病毒血症。抗PRRSV的IgM抗体在病毒感染后5-7天出现，2-3周后消失，IgG抗体在病毒感染后7-10天出现，2-4周后达到顶峰且持续数月，约300天后下降到较低水平，IgA抗体在病毒感染后14天出现，25天达到峰值，35天后消失。在临床上，针对PRRSV的抗体水平很高，但是中和抗体出现较晚，机体长期处于PRRSV持续性感染状态中，并且ADE现象的存在也会促进PRRSV的感染。研究报道，非免疫母猪产下的仔猪被动获得抗PRRSV抗体后并不能对仔猪产生保护，而免疫母猪产下的仔猪则能够被保护(Molitoretal.1997)，另外，被动获得抗体的猪体中，PRRSV的感染和复制反而会增强(Yoonetal.1997)，提示单独的抗体免疫并不能有效的保护猪群，还需要细胞免疫等的共同作用。通过噬菌体展示技术发现，PRRSV的nsp1、nsp2和nsp4中存在线性的B细胞表位，特别是nsp2中的表位具有很强的免疫优势(Oleksiewiczetal.2001)。1.3.3PRRSV引起的细胞免疫反应针对PRRSV细胞免疫的机制的研究尚不完全，但是细胞免疫对于抗PRRSV的感染是极其重要的，能够诱导猪只产生较好的细胞免疫反应的疫苗对于其保护效果也较好(Zuckermannetal.2007)。PRRSV在感染后约28天出现T淋巴细胞增殖，49天达到峰值，77天反应下降，二次感染后T淋巴细胞的增殖效率明显加大，然而这种作用可以被MHCII类和CD4阳性抗体所阻断(Rossowetal.1995)。PRRSV引起的T细胞免疫反应短暂且不稳定，由于PRRSV毒株的来源和毒力的差异以及与继发感染的关系，导致了PRRSV诱导产生的变化不一致(DeBruinetal.1998)。PRRSV感染巨噬细胞或单核细胞，主要引起IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α的释放，IL-1可以引起机体产生严重的炎症反应和免疫应答。PRRSV感染早期可以诱导IFN-γ的大量表达，研究表明nsp9和nsp10可以增加IFN-γ的产生，并且在nsp9和nsp10中鉴定出了T细胞表位(Paridaetal.2012)。最近的研究报道，nsp2、nsp5、nsp9和nsp11中的某些肽段可以诱导IL-10的产生(Burgara-Estrellaetal.2013)，而IL-10有利于PRRSV逃避IL-2介导的细胞免疫反应(Meieretal.2003)。PRRSV的结构蛋白（GP4、GP5、M和N）被证实也可以引起强烈的细胞免疫反应，并且也有一些T细胞表位被鉴定出来(Darwichetal.2010)。研究证实，IL-1β、IL-8和IFN-γ与PRRSV的持续性感染有密切关系(Lunneyetal.2010)。 第一章PRRSV研究进展131.4PRRSV致病机制研究进展PRRSV可以通过呼吸道、摄食、咬伤、注射和精液等水平传播途径进入机体，在肺部、粘膜和局部巨噬细胞中进行复制，还可以通过生殖道进行垂直传播。PRRSV感染12h内即可达到局部淋巴结并形成病毒血症，进而扩散至全身的单核细胞及组织巨噬细胞中引起临床症状。PRRSV在感染动物的肺部、淋巴结、扁桃体、脾脏、胸腺以及派亚氏腺中都能被分离到，在巨噬细胞内持续复制增殖长达数月，但并没有明显的临床症状。各种年龄阶段的猪均会发生持续感染，母猪感染后99d仍可以传播PRRSV至易感猪群，母猪妊娠90d后子宫内感染，可以通过胎盘感染胎儿，分娩后132d仍能从仔猪的淋巴结和扁桃体中分离出该病毒。PRRSV可以促进其他病毒的感染以及与其他病原体发生混合感染(Mengelingetal.2000)。PRRSV的细胞嗜性是由细胞表面表达的细胞受体水平决定的，目前已经证实的细胞受体有：CD163（Clusterofdifferentiation163）分子、唾液酸粘附素（Sialoadhesin,Sn）、硫酸乙酰肝素（Heparinsulphate,HS）、CD151分子、波形蛋白（Vimentin）和非肌肉肌球蛋白重链IIA（NMMHCIIA）分子(Calvertetal.2007;Delputteetal.2005;Delputteetal.2002;Duanetal.1998;Kimetal.2006;Shanmukhappaetal.2007;VanGorpetal.2010)。其中，HS主要起到帮助病毒吸附到细胞表面的作用，然后Sn与唾液酸同GP5/M异源二聚体形成网格蛋白小体进行内吞作用，CD163协助进行内吞，并同GP2/3/4异源三聚体结合在核内体的酸化环境中释放病毒基因组，波形蛋白可以将病毒转运到细胞质中，CD151的作用是同RNA的3’UTR相结合，将病毒嚢膜和核内体进行融合。见图1-6。最近研究表明，通过转染CD163分子可以使对PRRSV非易感的细胞变成易感细胞(Wangetal.2013c)，对于PRRSV细胞受体的研究非常有助于阐明病毒与宿主之间的相互作用机制以及研发新型疫苗，对于PRRSV的致病机制仍需要进一步的研究。图1-6PRRSV的吸附、内吞和脱衣壳(Pratheretal.2013)Fig.1-6Proposedstepsintheattachment,internalization,anduncoatingofPRRSV 14猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究1.5PRRSV诊断与预防研究进展怀疑猪感染PRRSV的条件判定（荷兰）有：母猪厌食后出现产死胎率达20%、流产率达8%、仔猪断奶前死亡率达26%以及严重的呼吸道症状。PRRSV的实验室诊断方法常用的有免疫组织化学法、病毒的分离鉴定、间接免疫荧光法检测血清或组织样本。血清学中，IDEXX的酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）被广泛的用来检测抗体的水平，此外，还有间接免疫荧光和中和实验。血清学ELISA检测到的抗体水平不能完全说明猪群的免疫保护力，只是反应PRRS的感染状态、大概的感染时间和可能产生的影响。反转录-聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）以及荧光定量RT-PCR可以用来检测血清、精液和组织样本中的病毒RNA的含量，也可以用来区分野毒和疫苗毒。对于ORF5的序列分析可以作为病毒的鉴定和区分，相关的数据库也已经建立起来。尽管传统的实验室检测具有良好的敏感性和特异性，但仍然需要不断的改进和补充。为了预防猪群感染PRRSV，需要采取饲养管理、生物安全措施和主动让猪群产生免疫力（疫苗免疫）等综合方法。如果发现可疑感染，需立刻隔离猪群，带猪消毒并在饲料中添加黄芪多糖和电解多维来提高机体的免疫力和降低猪群的应激反应，同时进行血清学ELISA检测和病原学PCR检测，尽早采取免疫预防措施。对于PRRS的治疗没有特别有效的方法，应加强免疫预防，做好消毒工作，尽快消灭疫情和传染源，严格防控疫情的扩散并最大程度的减少经济损失。自从1994年勃林格殷格翰公司的PRRSV减毒活疫苗（RespRRS/IngelvacPRRSMLV）上市以来，在美国和欧洲也有很多减毒活疫苗和灭活疫苗被研制出来，同综合管理措施一同控制着PRRS的爆发。然而，这些疫苗也有其局限性，它们来自单一的病毒株并且不能有效的防止病毒的再次感染和传播。另外，安全性问题上，减毒活疫苗存在毒力返强以及疫苗毒和野毒重组的问题都是不可忽视的(Botneretal.1997;Lietal.2009;Storgaardetal.1999)。灭活疫苗虽然安全但是产生的保护力很有限，这就为研制既安全有效又能提供广泛保护力的疫苗带来了巨大的挑战。近年来，广大科研工作者利用基因工程的手段在不断的尝试一些基因亚单位疫苗、病毒载体疫苗和嵌合疫苗等，例如利用病毒载体携带PRRSV结构蛋白GP3、M和GP5的疫苗(Huangetal.2010b;Kimmanetal.2009)，但是其效果是否比传统疫苗好仍需要确定。因此，传统的减毒活疫苗仍然是比较有效的预防PRRSV感染的措施，对其安全性和有效性方面的改进仍需要继续进行。 第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展15第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展研究表明，由巨噬细胞介导的组织炎症与炎症小体（inflammasomes）多聚蛋白复合物密切相关(Kanneganti2010;McIntireetal.2009;Rathinametal.2012a)。炎症小体是由胞浆内的模式识别受体（patternrecognitionreceptors,PRRs）参与并招募其他蛋白组装而成的复合物，是天然免疫系统重要的组成部分。天然免疫系统是一个庞大而复杂的系统，并不像之前认为的只是排除异己的第一道防线而已，该系统识别危险信号如致病微生物或宿主来源的细胞压力信号等，同时对非危险的信号如正常的宿主分子、食物抗原或共生的肠道菌群等是不敏感的，该系统还可以诱导和激活适应性免疫反应(Medzhitov2008)。天然免疫系统通过招募模式识别受体来发挥作用，所以这些模式识别受体通常表达于巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞和上皮细胞中。PRRs通常包括定位于膜表面的Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）和C型凝集素受体（C-typelectins,CLRs），以及位于细胞内负责胞浆监测的视黄酸诱导基因I解旋酶样受体（RIG-I-likereceptors,RLRs）、NOD样受体（Nod-likereceptors,NLRs）和AIM2（Absentinmelanoma2）等(Takeuchietal.2010)。PRRs能够识别病原相关分子模式（pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs）和宿主来源的危险信号分子（dangerassociatedmolecularpatterns,DAMPs）进而激活一系列通用的信号分子如转录因子NF-κB、AP-1和IRF，从而导致促炎性细胞因子和趋化因子的产生以及I型干扰素介导的抗病毒反应。另外，炎症小体的活化还可以招募和激活胱天蛋白酶Caspase-1，从而切割IL-1β和IL-18无活性的前体，产生成熟的细胞因子，同时，诱导细胞发生炎症性坏死，称之为细胞焦亡（pyroptosis）。目前已经确定了多种炎症小体参与针对多种病原体的宿主防御反应，而病原体也已经进化出多种相应的机制来抑制炎症小体的活化。2.1NLRP3炎症小体2.1.1炎症小体的结构NLR家族分子是由22个人源基因和和更多的鼠源基因组成，在结构上与抗病因子R蛋白以及凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）类似，具有特别明显的特征：其N端是效应结构域，由CARD（caspaserecruitment）、pyrin（PYD）、BIR或转录激活结构域构成，主要介导蛋白与蛋白之间的相互作用；中间是NACHT（nucleotide-bindingandoligomerization）结构域，是所有NLR家族成员中唯一一个都具有的部分，主要通过ATP依赖的自身寡聚化激活信号转导复合物；C端是亮氨酸富集的结构域（leucine-richrepeats,LRRs），介导配体识别和自身调控(Tschoppetal.2003)。根据NACHT结构域进行系统发育分析，可以将NLR家族分子分为3个亚家族：NODs（NOD1-2、NOD3/NLRC3、NOD4/NLRC5、NOD5/NLRX1、CIITA），NLRPs（NLRP1-14，又称为NALPs）和IPAF， 16猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究包括了IPAF（NLRC4）和NAIP。除此之外，NLRX1分子与任何一个亚家族分子都没有明显的同源性，而且该分子定位于线粒体并能够调控炎症信号通路(Allenetal.2011)。见图2-1。图2-1人和小鼠NLR家族成员(Schroderetal.2010a)A：人和小鼠NOD样受体蛋白中NACHT结构域的系统发育关系显示NLRs有NOD、NLRP和IPAF3个亚家族；B：人NLRs家族域结构中的异同Fig.2-1HumanandMouseNLRFamilyMembersA:PhylogeneticrelationshipsbetweenNACHTdomainsofeachhuman(uppercase)andmouse(lowercase)NLR(NOD-likereceptor)proteinshow3distinctsubfamilieswithintheNLRs:theNOD,NLRP,andIPAFsubfamilies.B:DomainstructuresforhumanNLRsrevealcommonalitieswithinthesubfamilies2.1.2炎症小体的类别炎症小体是通过自我寡聚化组装而成的支架蛋白，至今已经有许多NLR家族分子被报道在体外具有炎症小体活性，然而，只有少数几个在体内的生理功能是清晰的。NLRP1、NLRP3和IPAF可以监测危险信号，通过NACHT结构域的相互作用发生自身寡聚化从而形成较大分子量的复合物（六聚物或七聚物），促使caspase-1的激活。HIN-200蛋白家族成员AIM2也可以介导炎症小体的组装，同NLRP3和RIG-I一样都需要凋亡相关点状蛋白（apoptosis-associatedspeck-likeprotein,ASC）的参与，而ASC在NLRP1和IPAF炎症小体中的作用仍不清楚(Schroderetal.2010a)。NLRC5和NLRP6也需要ASC构成炎症小体来发挥作用，但其配体激动剂还不是很清楚(Davisetal.2011;Kempsteretal.2011)。炎症小体活化后会形成一个发热凋亡小体，进而会促使caspase-1活化 第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展17(Fernandes-Alnemrietal.2007)，一旦某些组分发生突变或失调则会引起一系列自主炎症性疾病发生(Kastneretal.2010;Mengetal.2009)。2.1.3NLRP3炎症小体的活化NLRP3炎症小体是目前研究得最清楚的炎症小体，由NLRP3支架、接头蛋白ASC和效应分子caspase-1构成。NLRP3炎症小体可以被多种病原体如细菌、病毒、真菌、原虫感染所激活，也能够被各种不同结构的PAMPs、DAMPs和环境因素所刺激。真菌中如白色念珠菌和酿酒酵母可以通过Syk将信号转导到炎症小体(Grossetal.2009)，单核细胞增多性李斯特氏菌和金黄色酿脓葡萄球菌可以产生穿孔毒素(Mariathasanetal.2006)；病毒中如仙台病毒、流感病毒和腺病毒都可以激活炎症小体(Kannegantietal.2006;Muruveetal.2008)。另外，微生物的某些组分也可以激活炎症小体，比如金黄色葡萄球菌的α毒素(Cravenetal.2009)和流感病毒的M2离子通道蛋白(Ichinoheetal.2010)。一些宿主来源的危险信号分子如受损细胞释放出来的ATP(Mariathasanetal.2006)和透明质酸(Yamasakietal.2009)，阿尔茨海默症在脑部斑块的组成成分纤维状β样淀粉蛋白也可以激活NLRP3炎症小体(Halleetal.2008)。NLRP3炎症小体还可以被代谢应激包括代谢综合征中高浓度的葡萄糖(Zhouetal.2010)和引起自身免疫性疾病痛风中的尿酸盐结晶(Martinonetal.2006)所激活。环境因素中如二氧化硅(Casseletal.2008;Dostertetal.2008;Hornungetal.2008)、石棉(Casseletal.2008;Dostertetal.2008)、紫外照射(Feldmeyeretal.2007)和皮肤刺激剂(Sutterwalaetal.2006;Watanabeetal.2007)等也都可以引起NLRP3炎症小体的激活。NLRP3炎症小体可以被广泛的刺激物所激活，这些损伤也会引起相应的病理学现象，如矽肺、石棉肺、晒伤和接触性过敏反应。NLRP3炎症小体在没有被激活时，LRR结构域是通过与IPAF相似的方式实现自我抑制的(Poyetetal.2001)。一旦被激活，NLRP3的寡聚化会导致PYD结构域聚集并与下游接头蛋白ASC的PYD结构域发生结合，ASC的CARD结构域会招募procaspase-1的CARD结构域，使procaspase-1发生聚集并导致自我切割形成有活性的caspase-1p10/p20四聚体，caspase-1进而处理促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的前体，使其成熟并分泌到胞外。促炎性细胞因子IL-1β和IL-18可以被多种类型的细胞所分泌，并且在宿主的天然免疫和获得性免疫方面发挥着重要的作用。不同于其它的促炎性细胞因子如TNF-α，IL-1β和IL-18的分泌受到转录水平（信号1）和翻译后水平（信号2）这两个信号的共同调节。一旦被PRRs转录诱导（信号1），IL-1β和IL-18会形成无生物活性的前体形式，之后会被经上述过程活化的半胱氨酸蛋白酶Caspase-1（信号2）切割并形成有活性的成熟体。见图2.2(Atianandetal.2013)。导致NLRP3炎症小体激活的机制尚不完全清楚，已经被广泛认可的有3种激活模型。第一种是胞外ATP激活受体P2X7，使之介导的ATP门控离子通道打开，引起钾离子外流(Kahlenbergetal.2004)，进而逐步招募半通道蛋白pannexin-1形成膜孔，最后使 18猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究NLRP3的刺激剂进入胞质直接激活NLRP3炎症小体(Kannegantietal.2007)。然而，NLRP3刺激剂的结构多样性导致了并不是所有的刺激剂都能直接和NLRP3进行结合。第二种模型是由结晶或颗粒状的刺激剂如尿酸盐结晶、二氧化硅、石棉、β样淀粉蛋白和明矾等被吞噬细胞吞噬后导致溶酶体破坏，然后释放出某些溶酶体成分如溶酶体内组织蛋白酶cathepsinB到细胞质中引起NLRP3炎症小体激活(Halleetal.2008;Hornungetal.2008)。第三种是活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）模型，所有NLRP3的刺激剂都可以引起ROS的产生(Casseletal.2008;Cruzetal.2007;Dostertetal.2008)，它代表了机体针对感染和损伤的一种保守的进化途径。比如ROS的浓度变化可以指导斑马鱼的伤口愈合以及ROS在植物中是抗微生物感染的效应分子(Bolwell1999;Niethammeretal.2009)。而且，一旦ROS被清除后就会抑制炎症小体的激活(Casseletal.2008;Cruzetal.2007;Dostertetal.2008;Grossetal.2009;Petrillietal.2007;Shioetal.2009)。然而，ROS依赖的NLRP3炎症小体激活具体机制还有待进一步研究。另外，最近有研究报道表明鼠源的钙敏感受体CASR在NLRP3炎症小体通路的上游发挥作用，CASR通过PLC的催化促使InsP3产生，InsP3可以导致Ca2+从内质网上释放出来从而激活NLRP3炎症小体(Atianandetal.2013)。见图2-2。图2-2NLRP3炎症小体激活途径(Atianandetal.2013)Fig.2-2BasicmechanismsofactivationofNLRP3flammasome2.1.4非经典的炎症小体活化途径IL-1β和IL-18的分泌是通过经典的信号通路（信号1和信号2）共同作用产生的。 第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展19最新的研究表明，在革兰氏阴性菌的感染过程中还存在着一个非经典的信号通路，除了信号1和2之外，还依赖于信号3(Rathinametal.2012b)和TLR4非依赖的细胞内LPS活化炎症小体信号通路(Kayagakietal.2013)。信号3也就是TLR4-TRIF-typeIIFN依赖的caspase-11途径，它在caspase-1活化NLRP3炎症小体并分泌IL-1β的上游发挥作用。在巨噬细胞中，TLR4非依赖的识别LPS的信号通路是通过激活caspase-11的前体来发挥作用的，这个新的识别胞内LPS的受体最近已经被确定下来，即人源的caspase-4/5和鼠源的caspase-11可以直接识别LPS并与其结合从而激活炎症小体并引起细胞焦亡(Shietal.2014)。见图2-3(Hagaretal.2015)。这些发现直接颠覆了传统所认为的炎症小体激活途径，极大的扩展了人们对于炎症小体在整个细胞信号通路中的认识，并为后续更深入全面的研究炎症小体信号通路奠定了坚实的基础。图2-3经典和非经典炎症小体活化途径(Hagaretal.2015)Fig.2-3Schematicofcanonicalandnoncanonicalinflammasomepathwaysforinflammatorycaspaseactivation2.1.5炎症小体的抑制炎症小体在宿主抗感染以及IL-1β、IL-18和细胞焦亡在清除病原微生物的过程中发挥着巨大的作用，然而，宿主自身也进化出一套相应的机制来抑制过度炎症的发生，防止自身组织和器官的损伤。见图2-4。小鼠的CD4+和记忆性T细胞可以抑制NLRP1和NLRP3炎症小体介导的caspase-1的活化和IL-1β的分泌(Guardaetal.2009)；大量的CARD-和PYD-结构域蛋白可以通过干扰炎症小体组分的招募来抑制其活化，如PYD结构域蛋白pyrin，包括POP1（PYDC1）和POP2（PYDC2）可以与ASC结合而抑制炎症小体的活化(Chaeetal.2003)。而CARD-结构域蛋白，如人的COP、INCA、iceberg 20猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究和caspase-12也可以通过阻止caspase-1的聚集而抑制炎症小体的活化(Salehetal.2006)，但caspase-12在大多数人当中是没有功能的(Xueetal.2006)；抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL可以与NLRP1相互结合来抑制caspase-1的活化和IL-1β的分泌(Brueyetal.2007)；最近的研究报道，ω-3脂肪酸（omega-3fattyacids,ω-3FAs），包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoicacid,EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid,DHA）以及家族的其他成员都能够抑制NLRP3炎症小体的激活从而抑制caspase-1的活化、IL-1β的分泌以及高脂饮食诱导的2型糖尿病模型中的代谢紊乱(Yanetal.2013)；另外，一氧化氮（nitricoxide,NO）也在最近被证明是NLRP3炎症小体重要的负调控因子，可以保护小鼠免受LPS诱导的感染性休克(Maoetal.2013;Mishraetal.2013)；Trim30（tripartitemotifprotein30）蛋白可以通过调节ROS的产生而抑制NLRP3炎症小体的活化(Huetal.2010)；I型干扰素可以通过Stat-1依赖的方式抑制NLRP3炎症小体，在外源1000U/mL的IFN-β处理下，pro-IL-1β的转录水平明显下降，而且也不能引起肠出血性大肠杆菌（EHEC）和枸橼酸杆菌（C.rodentium）分泌IL-1β(Guardaetal.2011)。但是，用25-200U/mL的IFN-β处理TRIF（TIR-domain-containingadaptor-inducinginterferon-β）缺失的巨噬细胞却可以活化caspase-1并诱导IL-1β的分泌(Rathinametal.2012b)。细菌病原体似乎并不能表达抗炎症分子，但却可以通过干扰炎症小体配体的产生和识别来抑制其活化。Yersiniapseudotuberculosis的YopK可以和T3SS转位子结合来抑制炎症小体对病原体的识别(Brodskyetal.2010)；Salmonellae可以通过下调鞭毛蛋白和SPI-1T3SS的表达，同时上调SPI-2T3SS的表达来逃避NLRC4的识别(Brozetal.2011)；Pseudomonasaeruginosa表达的磷酸酶ExoU可以抑制caspase-1，RhoGTP酶激活蛋白ExoS可以抑制IL-1β的产生(Galleetal.2008;Sutterwalaetal.2007)；Yersiniaenterocolitica表达的YopE和YopT蛋白以及M.tuberculosis表达的锌离子金属蛋白酶Zmp1可以调控caspase-1的寡聚化来抑制炎症小体的激活(Masteretal.2008;Schotteetal.2004)；F.tularensis表达的LipidII磷酸转移酶mviN和胞质膜蛋白ripA也可以抑制炎症小体的活化(Huangetal.2010a;Ullandetal.2010)；L.pneumophila可以干扰ASC的转录阻止ASC的表达来抑制炎症小体复合物的形成(Abdelazizetal.2011)；S.pneumoniae表达的穿孔毒素pneumolysin既可以激活炎症小体(Fangetal.2011;McNeelaetal.2010;Witzenrathetal.2011)，也可以在人的树突状细胞中抑制炎症小体的活化(Littmannetal.2009)。病毒可以利用与宿主炎症小体抑制剂同源的蛋白来抵抗炎症小体信号通路的激活。痘病毒（poxvirus）表达的M013（来自粘液瘤病毒）和gp013L（来自兔纤维瘤病毒）蛋白可以和ASC结合抑制炎症小体的激活(Dorfleutneretal.2007;Johnstonetal.2005)，痘病毒还可以表达丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine-proteaseinhibitors,serpins）来抑制蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶caspase-1的催化活性，例如CrmA（cytokine-responsemodifierA）蛋白、牛痘病毒的B13R蛋白、粘液瘤病毒的Serp2蛋白和鼠痘病毒的SPI-2蛋白(Kettle 第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展21etal.1997;Petitetal.1996;Rayetal.1992;Youngetal.2000)；流感病毒（influenzavirus）和杆状病毒（baculoviruses）利用其自身编码的NS1和p35蛋白来抑制炎症小体的活化(Bumpetal.1995;Stasakovaetal.2005)；卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（kaposiSarcoma-associatedHerpesVirus,KSHV）表达与NLRP1同源的蛋白Orf63，可以和NLRP1以及NLRP3相结合来抑制炎症小体的激活，使病毒逃避宿主的免疫监控进而造成免疫延迟(Gregoryetal.2011)；麻疹病毒（measlesvirus,MV）的V蛋白可以和NLRP3的C末端相结合从而抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌(Komuneetal.2011)；另外，本研究的实验数据表明，PRRSV的非结构蛋白nsp1α和nsp11也可以抑制NLRP3炎症小体依赖的IL-1β的分泌，并且，nsp1α的ZF结构和nsp11的核酸内切酶活性在此过程中发挥了重要作用(Wangetal.2015)。图2-4微生物和宿主内源性产物调控炎症小体示意图(Rathinametal.2012a)Fig.2-4Regulationofinflammasomesbymicrobialandendogenousproducts2.2PRRSV、miRNAs与IL-1βPRRS主要引起发育中以及发育完成的猪表现出呼吸困难的临床症状，诱发间质性肺炎并增加混合感染的可能(Rossow1998)。作为其致病原，PRRSV抑制猪体的天然免疫和特异性免疫反应，产生极低水平的细胞因子，引起机体免疫抑制以及广泛的组织炎症和损伤，从而给该病的防控带来困难。PRRSV感染后，炎性细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8能够在被感染的猪体内检测到(Aastedetal.2002;Bassaganya-Rieraetal.2004;Lunneyetal.2010;Suradhatetal.2003a;Suradhatetal.2003b;Thanawongnuwechetal.2004;Thanawongnuwechetal.2003)。在高致病性PRRSV感染的仔猪中，IL-1β、IL-6和 22猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究TNF-α表达量在感染早期明显上升，之后有所下降，然后又升高并在血清病毒载量最高时达到峰值(Liuetal.2010b)。此外，当LPS与HP-PRRSV共感染猪只时，能够诱导产生更高水平的IL-1β和TNF-α(Qiaoetal.2011)。在LPS刺激的肺泡巨噬细胞中，PRRSV和囊膜蛋白E可以极大的促进IL-1β的产生，在这个过程中，E蛋白起到了激活炎症小体的作用(Zhangetal.2013)。最近的研究进一步表明，PRRSV诱导IL-1β的产生是通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路并激活NLRP3炎症小体信号通路共同作用的(Bietal.2014)，并且判断DDX19A蛋白可能在NLRP3炎症小体的激活中发挥了重要作用（刘圆圆2014），丰富了人们对于PRRSV激活炎症小体通路的认识。另外，基因2型PRRSV毒株VR-2385可以引起STAT1（signaltransducerandactivatoroftranscription1）第727位丝氨酸的磷酸化以及促炎性细胞因子IL-1β、IL-8和趋化因子CCL2、CXCL10的表达，并证明PRRSV非结构蛋白nsp12可以促进丝氨酸的磷酸化水平以及IL-1β和IL-8的产生(Yuetal.2013)。研究表明，除了PRRSV的基因组RNAs，其自身的结构蛋白如N蛋白也能够激活NF-κB从而增加促炎性细胞因子的分泌(Luoetal.2011)。本研究的实验数据也充分证明了PRRSV感染PAMs细胞后，可以通过激活NLRP3炎症小体，增加促炎性细胞因子IL-1β的分泌(Wangetal.2015)。近期大量研究表明，高度活跃的促炎性细胞因子IL-1β在宿主的抗病毒防御反应中是必需的(Sergerieetal.2007)。IL-1β基因缺失小鼠对于单纯疱疹病毒1型（herpessimplexvirus1,HSV1）引起的脑炎更敏感，而且可以减低免疫细胞浸润到脑部的频率和细胞因子及趋化因子的水平。IL-1受体1型缺失的小鼠不能够很好的清除病毒，并且在流感病毒感染后，其死亡率显著增加(Schmitzetal.2005)。另外，乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）、西尼罗河病毒（westnilevirus,WNV）和呼吸道合胞体病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV）也能够引起IL-1β的产生(Kanneganti2010)。尽管在宿主的防御反应中发挥着重要作用，但是过高水平的IL-1β仍会引起一些不必要的反应，包括发热、血管舒张、血压过低或者积液引起的急性肺损伤(Dinarello2009;Martinonetal.2009)，同样，还可以通过引起过量的炎症反应增加病毒的发病程度。因此，IL-1β的表达必须被严格的控制，包括转录水平和翻译后水平，且至少需要2个信号通路的共同作用。一个是NF-κB介导的基因转录产生IL-1β的前体pro-IL-1β；另一个是炎症小体激活并活化caspase-1，从而将无活性的pro-IL-1β切割成有活性的成熟体IL-1β(Martinonetal.2009;Schroderetal.2010b)。在抵抗RNA病毒感染的过程中，RIG和NLRP3炎症小体介导的IL-1β发挥了不可或缺的作用。MicroRNAs（miRNAs）是一类小的非编码RNA分子，长度约为21-23nt，它们通过与靶基因的mRNAs结合来调控基因的表达，降低靶基因的稳定性或抑制其翻译(Guoetal.2014;Hiddinghetal.2014)。miRNAs参与介导病毒与宿主之间的相互作用，细胞表达的miRNAs可以通过与病毒或宿主靶基因的结合来调控病毒的感染(Joplingetal.2005;Tribouletetal.2007;Wangetal.2012)。例如：miR-26a可以通过与PB1基因的保守区域 第二章PRRSV与NLRP3炎症小体研究进展23相结合来抑制H1N1甲型流感病毒（influenzaAvirus,IAV）复制(Liuetal.2010a)；另两项新的研究报道，miR-26a还可以通过上调抗病毒反应，包括激活I型干扰素信号通路和促进干扰素刺激基因的产生而不是通过与病毒基因组的相互结合来抑制PRRSV的复制(Jiaetal.2015;Lietal.2015)；miR-24-3p可以通过抑制血红素加氧酶（hemeoxygenase-1,HO-1）的表达来促进PRRSV的复制(Xiaoetal.2015)；miR-181可以通过与病毒基因组RNA和CD163的3’UTR（untranslatedregion）区域的相互结合来抑制PRRSV的复制(Gaoetal.2013;Guoetal.2013)；miR-125b可以通过负向调控NF-κB的激活来抑制PRRSV的复制(Wangetal.2013a)；miR-23、miR-378和miR-505可以通过与病毒基因组的结合来抑制PRRSV的复制，特别是miR-23还可以通过激活IRF3/IRF7来增加I型干扰素的表达，从而抑制病毒的复制(Zhangetal.2014)。miRNAs作为调控分子在正常的免疫反应、癌症的发生和炎症及自身免疫性疾病中都发挥着重要的作用(Carissimietal.2009;Iborraetal.2012;Scrivoetal.2011;Weietal.2011)，比如类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis,RA）、多发性硬化症（rheumatoidarthritis,MS）和全身性红斑狼疮（systemiclupuserythematosus,SLE）。在正常的生理条件下，miRNAs参与了细胞分化、增殖、凋亡、造血、脂肪代谢和肢体形态发生等过程，而在病理条件下，异常表达的miRNAs可以通过调控不同基因的表达来保持这种病理状态。尽管miRNAs只占人类基因组总量的3%，但它们却调控了大约90%的基因(Pauleyetal.2009)。一个miRNA可以调控成百上千个靶基因，在很多基因的表达过程中发挥作用，比如调控天然免疫和适应性免疫反应。研究报道，LongnoncodingRNARP5-833A20.1可以通过上调miR-382-5p来下调靶基因NFIA的表达，过表达NFIA可以增加高密度脂蛋白胆固醇，减少低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白胆固醇的产生，还可以减少炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的产生，表明RP5-833A20.1/hsa-miR-382-5p/NFIA途径对于调控体内胆固醇平衡和炎症反应是必需的(Huetal.2015)；miR-223作为NLRP3重要的调控因子，可以和NLRP3的3’UTR相结合来抑制其表达，并导致IL-1β的分泌减少(Bauernfeindetal.2012;Haneklausetal.2012)；miR-132可以结合IRAK4从而抑制IL-1β和IL-6的表达(Kongetal.2015)；miR-146a可以通过结合IRAK1、IRAK2和TRAF6来抑制IL-1β的分泌以及炎症反应(Iyeretal.2012)；miR-133a-1通过抑制靶基因UCP2（mitochondrialuncouplingprotein2）的表达来抑制炎症小体的活化和IL-1β的产生(Bandyopadhyayetal.2013)；另外，miR-149在发生骨关节炎的软骨细胞中的下调会促使IL-1β、IL-6和TNF-α的上调表达(Santinietal.2014)。然而，关于PRRSV感染宿主细胞诱导产生的miRNAs在调控炎症反应及IL-1β的表达方面还鲜有报道。本研究在此切入并初步证明miR-373可以显著增加PAMs细胞中IL-1β的分泌，并且可以上调NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平，其靶基因在此过程中发挥的作用还有待进一步验证。这些结果表明miR-373可能对于调控PAMs细胞中的炎症反应起着重要作用，但是其具体机制还需要更深入的探索。 24猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究25试验研究第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究PRRS是严重危害养猪业的病毒性传染病，其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应，引起机体免疫抑制，造成持续性感染，从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体抗病毒中发挥重要作用。NLRP3炎症小体由支架蛋白NLRP3、接头蛋白ASC和效应分子procaspase-1相互结合而形成，主要介导procaspase-1的活化和促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的分泌。前期的研究发现PRRSV能够诱导机体产生促炎性细胞因子IL-1β的分泌，但是否依赖于NLRP3炎症小体还不是很清楚。所以，本研究为了更加清晰地了解NLRP3炎症小体在PRRSV感染后的变化情况，首先选取了可传代的PAM-CD163细胞作为模型。该细胞系是由西北农林科技大学周恩民教授课题组将CD163基因克隆到对PRRSV非易感的永生化的PAM细胞系（CRL-2843）中，成功构建好的稳定表达CD163基因的PAM细胞系。本章经过一系列的鉴定实验，发现该细胞系虽然能够感染PRRSV，但是并不能分泌IL-1β，不能够作为研究NLRP3炎症小体的模型。接下来，我们使用PRRSV的天然宿主细胞PAMs，在PRRSV感染PAMs后研究NLRP3炎症小体的动态变化情况以及明确IL-1β的分泌是否依赖于NLRP3炎症小体。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1毒株、菌株和细胞PRRSV美洲型经典毒株BJ-4株（GenBank:AF331831）由中国农业大学杨汉春教授惠赠，本实验室保存；高致病性PRRSV毒株HN07-1由本实验室分离保存。MARC-145细胞由本实验室保存；永生化PAM细胞系（3D4/21，ATCC：CRL-2843）以及稳定表达CD163的永生化PAM细胞系（PAM-CD163）由西北农林科技大学周恩民教授惠赠，本实验室保存；原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）分离自新鲜猪肺。E.coliDH5α和JM109感受态细胞购自TaKaRa公司。3.1.1.2主要试剂DMEM、PRMI-1640细胞培养基和胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，青链霉素（双抗）购自Hyclone公司；PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒和SYBRGreenreal-timePCRMasterMix均购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自LifeTechnologies公司；转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；LPS（O55：B5）购自Sigma公司；NLRP3特异性抑制剂Glyburide购自InvivoGen公司；猪IL-1βELISA 26猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究检测试剂盒购自R&DSystems公司；鼠抗猪PRRSVN蛋白单克隆抗体购自VMRD公司，PE标记的羊抗鼠IgG抗体购自博奥森公司；其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。3.1.1.3主要仪器PCR仪美国Bio-Rad公司荧光定量PCR仪（7500Fast）美国ABI公司梯度PCR仪美国基因公司超净工作台日本SANYO公司CO2细胞培养箱美国Thermo公司生物安全柜美国Thermo公司倒置显微镜德国LEICA公司细胞计数板上海精密仪器厂数显恒温水浴锅上海精宏公司凝胶自动成像系统美国基因公司电泳仪北京六一仪器厂垂直电泳仪美国Bio-Rad公司半干转膜仪美国Bio-Rad公司小型高速离心机美国Thermo公司台式高速冷冻离心机德国Eppendorf公司-20℃冰箱德国BOSCH公司-40℃冰箱青岛Haier公司超低温冰箱日本SANYO公司微量移液器德国Eppendorf公司全波长分光光度计美国Thermo公司电子分析天平瑞士METTLERTOLEDO公司CLARIOstar全功能酶标仪德国BMGLABTECH公司3.1.1.4自行配制试剂部分参考《分子克隆实验指南》第三版。1.PBS缓冲液：先后称取NaCl8g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g和KCl0.2g，加适量双蒸水充分溶解后调节pH至7.4，补加双蒸水，定容至1L，高压灭菌后常温保存备用。2.LB培养基：分别称取NaCl10g、酵母提取物5g和蛋白胨10g（固体培养基需额外称取15g琼脂粉），加适量去离子水充分溶解，定容至1L。高压灭菌后，4℃保存。3.50×TAE：分别称取Tris141g和Na2EDTA2H2O37.2g，加800mL去离子水充分 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究27溶解，加入57.1mL醋酸，定容至1L，室温保存。4.DMEM培养基：将1L量DMEM粉剂加入至900mL高压灭菌的双蒸水中，加入约3.7gNaHCO3，充分溶解后调pH至7.0补加双蒸水至1L，使用高压灭菌的装有0.22μm滤膜的滤器过滤除菌后分装并于4℃保存。5.RPMI1640培养基：将1L量DMEM粉剂加入至900mL高压灭菌的双蒸水中，加入约2.0gNaHCO3，充分溶解后调pH至7.0，加双蒸水至1L，使用高压灭菌的装有0.22μm滤膜的滤器过滤除菌后分装并于4℃保存。6.细胞生长液：将胎牛血清在56℃水浴中灭活30min，按照10%的比例加入到DMEM或RPMI1640中，混匀后4℃保存。7.细胞维持液：将胎牛血清在56℃水浴中灭活30min，按照2%的比例加入到DMEM或RPMI1640中，混匀后4℃保存。8.细胞冻存液：将胎牛血清在56℃水浴中灭活30min，与DMSO按照9:1的比例混合，现用现配。9.1%琼脂糖凝胶：称取琼脂糖粉1.0g倒入三角瓶中，加入1×TAE缓冲液至100mL，微波炉中加热1-2min至琼脂糖完全溶解，冷却至60℃左右，加入EB溶液至终浓度为0.5μg/mL，最后将琼脂糖凝胶倒入胶槽中待冷却后使用。3.1.2方法3.1.2.1猪肺泡巨噬细胞（PAMs）的制备挑选6周龄左右，健康且PRRSV抗原抗体双阴性猪。臂动脉丛放血致死，剖开胸腔，将气管上下两端结扎后，取出肺脏，用无菌PBS缓冲液充分漂洗肺脏表面，然后，沿气管内壁注入约100mL含双抗的无菌PBS缓冲液，轻轻拍打肺脏表面1-2min，回收灌洗液，重复该步骤2-3次，直至灌洗液变清亮为止；将灌洗液用移液管轻轻吹打并用单层无菌滤网过滤，将收集到的灌洗液按照1000r/min离心8min，用20mLPBS重悬沉淀，重复2次，弃上清；用含双抗的10%胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，6个/mL，接种到24孔培养板中，37℃、5%CO调节细胞浓度至1x102培养箱中培养6h后，弃上清，更换培养基继续培养。3.1.2.2PAM-CD163和MARC-145细胞的复苏、传代和冻存1.复苏：从液氮罐中取出细胞冻存管，待液氮挥发后立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冻存管，使其完全融化。在超净工作台中打开管盖，将冻存管中的细胞悬液吸出，直接加入到已经装有预热过的细胞生长液的培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中静置培养。或者也可以将冻存管中的细胞悬液吸出后加入到已经装有预热过的细胞生长液的离心瓶中，1000r/min离心5min，弃去培养液，加入10mL细胞生长液重悬，铺于细胞瓶或培养板中，37℃、5%CO2培养箱中静置培养。6-8小时或次日，吸弃或倒掉培养液，换新鲜的细胞生长液继续培养，待细胞长成单层后再传代。 28猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究2.传代：吸弃或倒掉细胞培养瓶中旧的培养液，加入PBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶后吸弃或倒掉，以清洗掉残留的旧培养液。用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化（加入量以能覆盖瓶底细胞为宜），室温或37℃放置2-5min，置显微镜下观察细胞形态，待细胞间隙增大，细胞质回缩，细胞变圆甚至脱落，吸弃或倒掉消化液，加入少量细胞生长液，轻轻吹打细胞瓶壁，待细胞脱离细胞瓶壁形成细胞悬液后按照1:2-1:5的比例分种于新的细胞培养瓶或细胞培养板中，或者将吹打下来的细胞悬液放入离心瓶中，1000r/min离心5min，弃去培养液后重悬，再按照1:2-1:5的比例分种于新的细胞培养瓶或细胞培养板中，于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。3.换液和观察：每日或隔日观察细胞一次，当发现细胞的量很少且未能铺满整个瓶底，但培养液的PH值已经发生很大变化或者细胞形态很差等状况时，需要给细胞换液，倒去旧的细胞培养液后加入足量新鲜的细胞生长液继续培养。肉眼观察时，正常培养液的颜色应为桃红色，颜色变黄或者变浅时说明PH值已经下降；若培养液的颜色变成紫红色，说明细胞生长状况不良或者已经死亡；若培养液出现浑浊，说明细胞可能有微生物污染。显微镜观察时，生长状态良好的细胞，透明度大、折光性强、胞膜清晰；生长状态不好的细胞，折光性弱，胞质出现空泡、脂滴或颗粒样物质，严重时从细胞瓶壁上脱落；有微生物污染时，培养液中会漂浮有菌丝或细菌。4.冻存：为了防止细胞因污染或传代次数太多而造成的细胞绝种或者细胞衰老，选取对数生长期的细胞，常规传代将细胞制成悬液并计数，1000r/min离心5min，弃上清。加入细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至106-107个/mL，分装于冻存管中，写明细胞名称、代次和冻存日期。将冻存管于4℃放置30min，-20℃放置30min，然后移至-80℃过夜后再放入液氮罐中长期保存。3.1.2.3组织匀浆的制备手工匀浆：将新鲜猪肝、脾、肺、食管和骨髓各100mg剪碎并倒入玻璃匀浆管中，加入1mLTRIzol试剂，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6-8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。将制备好的匀浆按照3000r/min离心10-15分钟，取上清准备提取RNA。3.1.2.4PRRSV的增殖及TCID50的测定按常规方法传代，待细胞的融合度达到70%-80%时，弃去旧的培养液。接种病毒的量以覆盖瓶底为宜，置37℃、5%CO2培养箱吸附1h，每过15min轻轻晃动细胞培养瓶，使病毒液均匀地接触细胞，之后吸弃病毒液再加入适量的细胞维持液，置培养箱继续培养。或者将病毒液在37℃吸附15min，不需要吸弃病毒液，直接加入细胞维持液，置37℃、5%CO2培养箱继续培养。24h-72h观察细胞的病变情况，若50%左右的细胞出现病变，如细胞皱缩、聚合、变圆等现象时，进行收毒，将病毒液反复冻融三次，4000r/min离心5min，收集上清并分装到EP管中，放置于-70℃超低温冰箱保存备用。TCID50即半数细胞培养物感染量的测定，首先按照常规传代方法将MARC-145细 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究29胞稀释至1.0×105个/mL，每孔100μL接种于96孔细胞培养板中，过夜后待细胞融合度达到70%-80%，弃去培养液。同时，在离心管中将病毒作连续10倍的稀释从10-1-10-10，然后将稀释好的病毒接种到96孔细胞培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100μL。最后两纵排设为正常细胞对照，即只加无血清的DMEM。置于37℃、5%CO2培养箱1h后，补加100μL4%DMEM，继续培养并逐日观察和记录结果，一般需要观察5-7天。结果按照Karber法计算病毒的TCID50。MOI即感染复数，感染时病毒与细胞数量的比值。在细胞上接种PRRSV时，一般按照MOI为1.0、0.5、0.1或0.01的量来接毒。3.1.2.5LPS刺激实验取制备好的在24孔板中的PAMs和按常规方法传代后的PAM-CD163细胞，将LPS按照不同浓度（0-10000ng/mL）刺激6h或LPS浓度为200ng/mL时按照不同时间点（0-24h）来刺激细胞。收集样品时，弃掉上清，每孔细胞加入250μLTRIzolReagent进行裂解，-40℃冻存，以备提取RNA并做荧光定量PCR检测。3.1.2.6间接免疫荧光实验（IFA）检测PRRSV感染情况按常规方法将PAM-CD163细胞铺至24孔板中，分别用PRRSVHN07-1和BJ-4株感染48h后，吸弃细胞上清液，用PBS清洗3遍，加入75%预冷乙醇在4℃固定20min；PBS清洗3遍，加入5%脱脂奶，200μL/孔，在37℃封闭30min；PBS清洗5遍，加入一抗，一抗为鼠抗PRRSVN蛋白单克隆抗体，1:1000稀释后使用，37℃孵育1h；PBS清洗5遍，加入二抗，二抗为藻红蛋白（PE）标记的羊抗鼠IgG，1:100稀释后使用，37℃孵育30min；PBS清洗5遍，荧光显微镜观察并照相记录结果。3.1.2.7NLRP3炎症小体相关基因表达情况检测取制备好的在24孔板中的PAMs细胞，将PRRSVBJ-4株按照不同MOI（0.01、0.1和1.0）感染PAMs24h，同时，将PRRSVBJ-4株按照MOI为0.5时不同时间点（12h、24h、48h、72h）感染PAMs并设立空白对照，随时观察细胞状态。收集样品时，细胞上清液冻存至-40℃，用猪IL-1βELISA试剂盒检测IL-1β表达情况；细胞按照250μLTRIzolReagent/孔进行裂解，-40℃冻存，准备提取RNA并做荧光定量PCR检测。3.1.2.8NLRP3抑制和干扰实验取制备好的在24孔板中的PAMs细胞，将PRRSVBJ-4株按照不同MOI（0.1、0.5和1.0）感染PAMs，同时加入NLRP3的特异性抑制剂Glyburide（400μM）或对照试剂DMSO，48h后收集细胞上清液，-40℃冻存，用猪IL-1βELISA试剂盒检测IL-1β表达情况。用于猪的NLRP3和ASC基因的小干扰RNA（SmallinterferingRNA,siRNA）由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，同时合成一条阴性对照。siRNA序列如下：siNLRP3sense（5’-3’）：GCCUUAAGUUGUGUGAAAUTTsiASCsense（5’-3’）：CCUGAAAGCAGACAACAAATT 30猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究NegativecontrolforsiRNAsense（5’-3’）：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT合成好的siRNA按照说明书进行稀释，先离心后再慢慢打开管盖，加入125μLDEPC水，漩涡震荡溶解后离心，对照siRNA加入62.5μLDEPC水，浓度为20μM。转染siRNA之前，先将PAMs上清弃掉，加入无血清1640培养液400μL，然后用100μL无血清1640培养液稀释siRNA（100nM）和Lipofectamine20003μL，混合后室温静置孵育10min。最后将混合液逐滴缓慢地加入到细胞孔中，轻轻摇晃培养板使混合液均匀分布。转染6h后换成细胞生长液，24h后感染PRRSVBJ-4株（MOI：1.0），36h后收集细胞上清，用猪IL-1βELISA试剂盒检测IL-1β表达情况；细胞孔中的细胞加入250μLTRIzolReagent进行裂解，-40℃冻存，准备提取RNA并做荧光定量PCR检测。3.1.2.9细胞和猪组织的总RNA提取及cDNA的合成按照TRIzolreagent说明书进行总RNA的提取：1.在通风橱中，加入1mLTRIzol（组织0.1g或细胞六孔培养板中的一孔），颠倒混匀10下，室温放置5min（30℃孵育）；加入1/5TRIzol体积（0.2mL）的氯仿，颠倒混匀15s，室温放置2-5min，4℃、12,000r/min离心15min；转移上层水相（约400μL）于另一EP管中，加等体积异丙醇（约400-500μL），混匀，室温放置10min，4℃、12,000r/min离心10min，弃掉上清后加冰预冷75%乙醇（DEPC水配置）1mL，4℃、7,500r/min离心5min，弃掉上清，空气干燥5-10min；加入DEPC水或无RNA酶的水20-50μL溶解，55-60℃水浴助溶10-15min；测定RNA的浓度并进行RNA电泳鉴定纯度和带型，然后反转录合成cDNA。2.根据TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒说明书进行反转录反应：反转录体系（20μL），以下反应混合液需在冰上配制。组分加入量5×gDNAEraserBuffer2μLgDNAEraser1μLTotalRNA1μgRNAasefreeH2OUpto10μL42℃水浴2min，放置于4℃。配制反转录试剂混合液。组分加入量5×PrimeScriptBuffer4μLPrimeScriptRTEnzymeMixI1μLRTPrimeMix1μLRNAasefreeH2O4μL37℃水浴15min，85℃水浴5s终止反应。 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究313.1.2.10荧光定量PCR荧光定量PCR跨内含子引物是根据NCBI中GenBank上发表的猪NLRP3（GenBank：JQ219660.1）、ASC（GenBank：XM_003124468.2）、procaspase-1（GenBank：NM_214162.1）和pro-IL-1β（GenBank：M86725.1）的序列设计，由上海生工合成后使用。表3-1PCR扩增引物序列Table3-1PCRamplificationprimersequence引物名称引物序列产物大小PrimerSequence(5’3’)SizeofproductsNLRP3RTForGAGCCAGAATGGGACAATGCAAAT118bpNLRP3RTRevCTTTCTTTTTCTTACAAATAGAGprocaspase-1RTForATCTCACCGCTTCGGACATGGCTAT131bpprocaspase-1RTRevGTATTTCTTCCCACAAATGCCAGCCpro-IL-1βRTForCTTGAAGAGAGAAGTGGTGTTCTG114bppro-IL-1βRTRevATCACACAAGACAGGTACAGATTCTASCRTForGACAACAAACCAGCACTGCACTTCG128bpASCRTRevACTGCCTGGTACTGCTCTTCCGTGAPDHForTGACAACAGCCTCAAGATCG141bpGAPDHRevGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT将3.1.2.9中得到的cDNA样品进行实时荧光定量PCR反应。qPCR反应体系如下，以下反应混合液需在冰上配制：组分加入量cDNA模板1μL上游引物0.4μL下游引物0.4μLROXdyeII0.4μLSYBRPremixExTaq(2x)10μLRNAasefreeH2O7.8μL反应程序：预变性：95℃，10min；扩增程序：95℃，3s，60℃34s，40个循环；溶解曲线：95℃，15s，60℃15s，1.75℃/min升温至95℃，维持15s。最后，根据qPCR反应的扩增曲线、溶解曲线以及CT值来确定反应是否成功并根据相对定量qPCR反应计算公式2-ΔΔCT（ΔΔCT=ΔCTsample-ΔCTcontrol）来计算结果。3.1.2.11鉴定猪不同组织中NLRP3基因的表达情况 32猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究根据NCBI中GenBank上发表的猪NLRP3（GenBank：JQ219660.1）序列，设计鉴定引物并由上海生工合成。扩增的目的片段长度为467bp，引物序列为NLRP3-JDFor（5’-3’）：ATGGATAGCGGCAAGAGT；NLRP3-JDRev（5’-3’）：AGGAAACGGACAACAAAA。将合成后的引物按照说明书用水进行稀释，PCR反应体系为20μL并设立阴性和阳性对照，反应混合液需在冰上配制。组分加入量cDNA模板1μL上游引物1μL下游引物1μLPremixExTaq10μLRNAasefreeH2OμL反应程序：1.预变性：94℃，1min；2.扩增程序：94℃，30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；3.最后：72℃10min。将PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，照相并保存图片。3.1.2.12ELISA检测细胞上清液中IL-1β的表达情况按照猪IL-1βELISA检测试剂盒说明书进行以下操作，所有4℃保存的组分在室温平衡后方可使用：1.样品处理：取收集好的细胞上清液按照3,000r/min离心5min，将样品用CalibratorDiluentRD6-31按照0×、10×、30×和50×稀释后使用。后续检测时，O.D.值不能太高也不能太低，最好全部落在标准曲线所做的O.D.值范围之内。2.猪IL-1β标准曲线的制作：将猪IL-1β标准品粉末用2.0mLCalibratorDiluentRD6-31进行稀释，储存浓度为2,500pg/mL，轻轻摇晃5min使其溶解。然后，在每个EP管中加入200μLCalibratorDiluentRD6-31，共6个EP管。将储存浓度为2,500pg/mL的标准品进行倍比稀释，稀释液CalibratorDiluentRD6-31作为空白对照（0pg/mL）。3.检测：加入50μLAssayDiluentRD-14到每孔中，使用前需将其混匀；加入50μLControl或者稀释好的样品，贴上薄膜，室温下水平摇床孵育2h，转速为500±50rpm；吸弃液体，加入WashBuffer清洗5遍，400μL/孔，吸水纸上拍打干净；加入100μLPorcineIL-1βConjugate到每孔中，贴上薄膜，室温水平摇床继续孵育2h；吸弃液体，加入WashBuffer清洗5遍，400μL/孔，吸水纸上拍打干净；加入100μLSubstrateSolution到每孔中，室温避光孵育30min，SubstrateSolution由ColorReagentsA和B等量混合；加入100μLStopSolution到每孔中，轻轻敲击平板是液体混合均匀；尽量在30min以内测量O.D.值，设置检测波长为450nm，校正波长为570nm；制作标准曲线，计算浓度，计 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究33算好的浓度需要乘以样品的稀释倍数得到样品最终的浓度。3.1.2.13数据处理及分析每个实验数据来自至少三次独立重复实验，数据统计分析采用T检验法或单因素方差分析，当P<0.05时，数据之间具有显著性差异，用“*”表示。本文所有图表均使用GraphPadPrism6.0软件完成。3.2结果3.2.1猪不同组织中NLRP3基因的鉴定将新鲜猪肝、脾、肺、食管和骨髓匀浆后提取RNA并反转录出cDNA后，用PCR进行扩增，鉴定NLRP3基因的表达情况，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察，均可见特异性条带，与预期大小相符，条带亮度在肝脏中较其他组织中稍弱（NLRP3鉴定产物：467bp、GAPDH：141bp）。见图3-1。M1234567500100图3-1猪不同组织中NLRP3基因的鉴定M：DL2000DNAMarker；1.肝脏；2.脾脏；3.肺脏；4.食管；5骨髓；6.脾脏；7.H2OFig.3-1IdentificationofNLRP3inporcinedifferentorganizationsM:DL2000DNAMarker;1.Liver;2.Spleen;3.Lungs;4.Esophagus;5.Marrow;6.Spleen;7.H2O3.2.2PAM-CD163细胞中NLRP3基因的鉴定利用LPS不同浓度和不同时间刺激PAM-CD163细胞以及PRRSVHN07-1和BJ-4感染后，PCR鉴定NLRP3基因的表达情况，扩增产物经2%或1%琼脂糖凝胶电泳观察，均可见特异性条带，与预期大小相符（NLRP3鉴定产物：467bp、NLRP3定量产物：118bp、NLRP3全长：3111bp、GAPDH：141bp）。见图3-2。 34猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究M1234567891011121314151650010010040002000图3-2PAM-CD163中NLRP3基因的鉴定M：DL2,000DNAMarker；1.LPS（0ng/mL）；2.LPS（5ng/mL）；3.LPS（50ng/mL）；4.LPS（100ng/mL）；5.LPS（1,000ng/mL）；6.LPS（10,000ng/mL）；7.LPS0h；8.LPS1h；9.LPS3h；10.LPS6h；11.LPS12h；12.H2O；13.HN07-1；14.BJ-4；15-17：未加反转录酶的阴性对照Fig.3-2IdentificationofNLRP3inPAM-CD163cellsM：DL2,000DNAMarker；1.LPS（0ng/mL）；2.LPS（5ng/mL）；3.LPS（50ng/mL）；4.LPS（100ng/mL）；5.LPS（1,000ng/mL）；6.LPS（10,000ng/mL）；7.LPS0h；8.LPS1h；9.LPS3h；10.LPS6h；11.LPS12h；12.HN07-1；13.BJ-4；14-16：Noreversetranscriptasenegativecontrol3.2.3PRRSV不同毒株在PAM-CD163细胞上感染力（毒力）的测定按常规方法传代MARC-145细胞，取生长状态较好的细胞进行PRRSVHN07-1株和BJ-4株的TCID50测定实验，逐日观察细胞病变情况并记录病变孔数。24h，BJ-4组的部分细胞出现皱缩变圆的现象，而HN07-1组没有明显变化；54h，两组每个稀释度的部分细胞都出现病变，但是，HN07-1组出现病变的速度明显比BJ-4组慢；70h，接毒组的细胞大部分已经死亡，基本无法判断病变情况，对照组细胞仍贴壁但也有少量细胞聚集。以上说明PRRSVHN07-1株和BJ-4株可以在PAM-CD163细胞上增殖，但是两者的增殖特点有所差异。按照Karber法计算病毒的TCID50。见图3-3。 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究35图3-3PRRSV在PAM-CD163细胞上的毒力测定Fig.3-3VirustiterofPRRSVinPAM-CD163cells3.2.4间接免疫荧光（IFA）检测PRRSV在PAM-CD163细胞上的感染情况按常规方法传代PAM-CD163细胞至24孔板中，接毒48h后弃去细胞上清液，固定细胞后进行IFA的检测。结果显示，PRRSVHN07-1和BJ-4株感染的PAM-CD163细胞可见红色荧光，且主要分布在细胞质中，两株病毒的感染情况差异不明显，对照细胞红色荧光较弱且弥撒分布。该结果进一步确定了HN07-1和BJ-4株可以感染可传代的PAM-CD163细胞系。见图3-4。图3-4间接免疫荧光实验检测PRRSV在PAM-CD163细胞上的感染情况A：PRRSVHN07-1；B：PRRSVBJ-4；C：空白对照Fig.3-4IndirectimmunofluorescenceassaydetectionofPRRSVinfectioninPAM-CD163cellsA:PRRSVHN07-1;B:PRRSVBJ-4;C:MOCK3.2.5PAM-CD163细胞上IL-1β表达情况的鉴定LPS不同浓度和不同时间刺激PAM-CD163细胞以及PRRSVHN07-1和BJ-4株感染后，用IL-1β的跨内含子定量引物进行PCR鉴定，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察，发现在LPS为50ng/mL、0h、3h以及HN07-1和BJ-4感染时的特异性条带较亮，且与预期大小相符（IL-1β定量产物：114bp）。见图3-5。 36猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究图3-5PAM-CD163中IL-1β基因的鉴定M：DL2,000DNAMarker；1.LPS（0ng/mL）；2.LPS（5ng/mL）；3.LPS（50ng/mL）；4.LPS（100ng/mL）；5.LPS（1,000ng/mL）；6.LPS（10,000ng/mL）；7.LPS0h；8.LPS1h；9.LPS3h；10.LPS6h；11.LPS12h；12.HN07-1；13.BJ-4；14.H2OFig.3-5IdentificationofIL-1βinPAM-CD163cellsM：DL2,000DNAMarker；1.LPS（0ng/mL）；2.LPS（5ng/mL）；3.LPS（50ng/mL）；4.LPS（100ng/mL）；5.LPS（1,000ng/mL）；6.LPS（10,000ng/mL）；7.LPS0h；8.LPS1h；9.LPS3h；10.LPS6h；11.LPS12h；12.HN07-1；13.BJ-4；14.H2OPRRSVHN07-1和BJ-4株感染PAM-CD163细胞48h以及LPS（200ng/mL）刺激PAM-CD163细胞6h后，取细胞上清液，ELISA检测IL-1β蛋白水平的表达情况。结果表明，HN07-1、BJ-4和LPS均不能引起PAM-CD163细胞分泌IL-1β。见图3-6。即使前期实验结果表明PAM-CD163细胞系中有NLRP3和IL-1β等基因的表达，并且该细胞系能够感染PRRSVHN07-1和BJ-4株，但是，ELISA结果却说明了该细胞系并不能够作为后期研究NLRP3炎症小体的良好模型，所以，后续实验使用原代PAMs细胞，该细胞能够更加真实和准确地反应PRRSV感染机体后炎症反应的变化情况。图3-6ELISA检测PAM-CD163细胞上IL-1β的分泌情况Fig.3-6ELISAdetectionofIL-1βinPAM-CD163cells 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究373.2.6PAMs细胞上IL-1β表达情况的初步鉴定分别用PRRSVHN07-1和BJ-4株感染PAMs细胞24h和48h以及LPS（10μg/mL）刺激PAMs细胞6h和12h后，贴壁细胞用IL-1β的跨内含子定量引物进行PCR鉴定，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳观察，均可见特异性条带，与预期大小相符（IL-1β定量产物：114bp）。见图3-7。细胞上清液稀释30倍后用ELISA初步鉴定IL-1β蛋白水平的表达情况，结果表明，PRRSV感染和LPS刺激均能引起IL-1β的表达。见图3-8。图3-7PAMs细胞中IL-1β基因的鉴定M：DL2,000DNAMarker；1.LPS6h；2.LPS12h；3.HN07-148h；4.BJ-448h；5.未接毒对照；6.空白对照；7.HN07-124h；8.BJ-424h；9.HN07-148h；10.BJ-448h；11.H2OFig.3-7IdentificationofIL-1βinPAMsM：DL2,000DNAMarker；1.LPS6h；2.LPS12h；3.HN07-148h；4.BJ-448h；5.Noviruscontrol；6.Mock；7.HN07-124h；8.BJ-424h；9.HN07-148h；10.BJ-448h；11.H2O图3-8ELISA检测PAMs细胞上IL-1β的分泌情况Fig.3-8ELISAdetectionofIL-1βinPAMs3.2.7PAMs细胞上NLRP3炎症小体的动态变化情况为了明确PRRSV感染后IL-1β的动态变化情况，将PRRSVBJ-4株以不同MOI和不同时间点来感染PAMs细胞，收获的细胞用qRT-PCR的方法检测NLRP3、ASC、 38猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究procaspase-1和pro-IL-1β的表达情况。细胞上清液则用ELISA的方法检测成熟体IL-1β的分泌情况。结果表明，procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平和细胞上清中的IL-1β在感染后24h呈剂量依赖的方式显著上调，可见图3-9A和3-9B。并且，NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA表达水平和细胞上清中的IL-1β蛋白含量随着时间的变化也受到明显的影响，在PRRSV感染早期，都呈现上升的趋势，NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平在24h达到峰值而IL-1β的蛋白水平在48h达到峰值。然而，在48h时NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平急剧下降到和空白组水平相当。相应地，IL-1β的蛋白水平在之后的阶段也呈现出下降趋势。见图3-9C和3-9D。图3-9PAMs细胞上NLRP3炎症小体的动态变化情况A：BJ-4不同MOI（0.01、0.1、1.0）感染PAMs细胞后，NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平变化情况；B：BJ-4不同MOI（0.01、0.1、1.0）感染PAMs细胞后，IL-1β蛋白水平变化情况；C：BJ-4（MOI：0.5）不同时间点（12h、24h、48h、72h）感染PAMs细胞后，NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平变化情况；D：BJ-4（MOI：0.5）不同时间点（12h、24h、48h、72h）感染PAMs细胞后，IL-1β蛋白水平变化情况Fig.3-9ThedynamicchangesofNLRP3inflammasomeinPAMsA:PAMswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferentMOI(0.01,0.1,1.0),NLRP3,ASC,procaspase-1andpro-IL-1βmRNAexpressionweredetectedbyqRT-PCR;B:PAMswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferentMOI(0.01,0.1,1.0),thechangesofIL-1βprotein;C:PAMswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4(MOI:0.5)atdifferenttimes(12h,24h,48h,72h),thechangesofNLRP3,ASC,procaspase-1andpro-IL-1βmRNA;D:PAMswereinfectedwiththePRRSVstrainstrainBJ-4(MOI:0.5)atdifferenttimes(12h,24h,48h,72h),thechangesofIL-1βprotein3.2.8PRRSV诱导的IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症小体为了确定PRRSV诱导的IL-1β的分泌是否依赖于NLRP3炎症小体，利用PRRSVBJ-4株以不同MOI来感染PAMs细胞，之后加入NLRP3的特异性抑制剂Glyburide（400 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究39μM），结果显示，该抑制剂可以显著地抑制由PRRSV诱导的IL-1β的分泌。见图3-10A。为了进一步该结果，设计并合成了针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs，对这两个基因进行RNA干扰，结果显示，针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs可以显著下调该基因的表达，并且能够显著抑制由PRRSV诱导的IL-1β的分泌。见图3-10B、3-10C和3-10D。图3-10PRRSV诱导的IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症小体A：BJ-4不同MOI（0、0.1、0.5、1.0）感染PAMs细胞后，加入Glyburide（400μM）或对照DMSO，48h后ELISA检测IL-1β分泌情况；B：转染siNLRP3或者对照siRNA，qRT-PCR检测NLRP3的表达量；C：转染siASC或者对照siRNA，qRT-PCR检测ASC的表达量；D：转染siNLRP3、siASC或者对照siRNA，24h后，BJ-4（MOI：1.0）感染12h，检测IL-1β分泌情况Fig.3-10SecretionofIL-1βinducedbyPRRSVwasdepentontheNLRP3inflammasomeA:PAMswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferentMOI(0,0.1,0.5,1.0),followedbytreatmentwithGlyburide(400μM)orDMSOvehiclefor48h,thesupernantswerethenanalyzedbyELISAtodetectIL-1βsecretion;B:PAMsweretransfectedwithspecificsiRNAtargetingNLRP3orcontrolsiRNA,cellswereharvestedandanalyzedforthelevelofNLRP3byreal-timeRT-PCR;C:PAMsweretransfectedwithspecificsiRNAtargetingASCorcontrolsiRNA,cellswereharvestedandanalyzedforthelevelofASCbyreal-timeRT-PCR;D:PAMsweretransfectedwithspecificsiRNAtargetingNLRP3orASCorcontrolsiRNA,24hlater,cellswereinfectedwithBJ-4ataMOIof1.0,12hlater,thesupernantswerecollectedandanalyzedforIL-1βbyELISA3.3讨论天然免疫系统在抵抗致病性和非致病性感染的方面发挥着重要作用，并且可以引起有效的适应性免疫反应(Ciracietal.2012)。而由caspase-1依赖的NLRP3炎症小体介导的促炎性细胞因子IL-1β则在引起有效的天然免疫反应中扮演着不可或缺的角色(Thomasetal.2009;Yamazakietal.2014)。本章实验为了研究PRRSV是否激活NLRP3炎症小体并诱导IL-1β的分泌，首先选取了PAM-CD163细胞为模型，该细胞可传代且不易被污染等特点可以为后续实验提供很多便利。通过摸索该细胞的生长特性、传代特点以及嘌呤霉素的添加浓度等，调整好细胞状态进行接毒实验和LPS刺激实验，首先检测PRRSV对PAM-CD163细胞的易感 40猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究性，然后，通过RT-PCR的方法鉴定该细胞中NLRP3炎症小体相关基因的表达情况，并用ELISA的方法鉴定该细胞是否分泌成熟的IL-1β。一系列的研究结果表明，PAM-CD163细胞可以感染PRRSVHN07-1和BJ-4株，并且，在该细胞中可以检测到NLRP3和IL-1β等基因表达。但是，ELISA检测结果却明确表示该细胞不能够分泌成熟的IL-1β，推测可能是由于在该细胞系的构建过程中缺失了某些关键基因或者某些关键蛋白的表达被抑制造成的。PAMs细胞作为PRRSV感染的天然宿主细胞，其优点是可以更加真实的反应体内的变化情况，但是，在寻找PAMs细胞来源且制备PAMs细胞的过程中稍显麻烦，并且特别容易污染。在本实验进行猪支气管肺泡灌洗及肺泡巨噬细胞的获取过程中，需要特别注意的有下几点：一是健康猪只的选取，最好选用4-6周龄的各种抗原均为阴性的健康猪为实验对象，本实验中选取的猪只，通过血液和肺脏的PRRSV抗原抗体检测，结果显示均为阴性，并且肺部肉眼观察均健康完好，无病理变化等异常表现；二是在灌洗的过程中，一定要防止血液污物等进入到肺部造成污染，并且，轻轻拍打肺部表面不可用力过猛；三是在细胞铺板的过程中需要计数并配合经验进行，避免细胞过多过密造成浪费或因为细胞过少而无法进行后续实验；四是所有在细胞上使用的液体均需加入双抗，且操作过程需要严格进行以避免细胞污染。在进行qRT-PCR实验的过程中，所有引物都需要设计成跨内含子引物以保证排除基因组的干扰，然后在NCBI上确定各个参数是否合适，比如GC含量在40-60%，上下游引物的Tm值需比较接近且在50-60℃以及扩增产物长度在100-150bp等。反转录时需要加入DNA酶进一步去除基因组DNA的干扰，保证所得cDNA全部是由提取出来的RNA反转录得到的，为后续实验结果的准确性提供保证。如果掺杂了基因组DNA的污染，所得结果在mRNA水平上的比较则失去了意义。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）现象是由在进化过程中高度保守的双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此，本实验选择针对NLRP3和ASC的特异性siRNA为工具，将基因敲低表达之后，发现PRRSV感染PAMs细胞诱导的IL-1β的分泌也受到抑制，该结果与NLRP3特异性抑制剂Glyburide抑制PRRSV诱导的IL-1β的分泌相一致，共同证明了PRRSV感染PAMs细胞诱导IL-1β的分泌是通过NLRP3炎症小体途径介导的，与前人的研究结果相吻合(Bietal.2014;Lunneyetal.2010)。在PAMs细胞上研究NLRP3炎症小体相关基因mRNA的转录动态情况时，发现procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平呈现PRRSV的剂量依赖效应且变化比较明显，但是，NLRP3和ASC的变化并不明显，而且在PRRSV不同MOI情况下只有微弱的升高。Jing等（2014）报道在MARC-145细胞上，高致病性PRRSV可以引起NLRP3mRNA水平的显著升高且呈现出时间依赖效应，在48h达到峰值(Jingetal.2014)；Bi等（2014） 第三章PRRSV激活NLRP3炎症小体研究41报道在PAMs细胞上，高致病性PRRSV可以引起NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA水平的显著升高(Bietal.2014)。虽然前期的这些研究结果和本实验所得到的部分结果是一致的，但是也有部分结果有差异，可能是由于实验所选用的材料不同，比如细胞系，原代细胞的来源和处理方式以及所用毒株的不同导致了部分结果的差异。另外，NLRP3的表达水平是该炎症小体激活的一个限制性因素且受到TLR介导的NF-ߢB信号的严格调控(Bauernfeindetal.2009)，所以，当PRRSVBJ-4株感染PAMs时，虽然激活了NLRP3炎症小体诱导IL-1β的分泌，但推测NLRP3的表达水平仍然处于一个受限制的状态以避免过高的炎症反应引起机体自身的免疫损伤。本章实验结果还表明了NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平呈现PRRSV感染的时间依赖效应且变化比较明显，感染早期呈现上升趋势且在24h达到峰值，但在48h却下降到最低值，那么，这种现象是由什么原因引起的还不是很清楚。所以，本文推测是否PRRSV本身存在某些抑制因素（如编码某些蛋白来发挥抑制作用）拮抗了NLRP3炎症小体的活化而使其自身能够在宿主体内持续增殖。接下来，本研究将重点放在了筛选抑制NLRP3炎症小体的病毒组分上，以期为进一步的抗病毒治疗提供潜在分子靶点和理论基础，并且为更深入地探讨NLRP3炎症小体在PRRSV免疫学中的作用打下基础。3.4小结本章实验证实PRRSVHN07-1和BJ-4株可以感染PAM-CD163细胞系，并且能够很好的在该细胞系上增殖，发现PRRSVHN07-1和BJ-4株感染及LPS刺激PAM-CD163细胞后能够诱导NLRP3和IL-1β的表达，但是，ELISA结果显示该细胞系并不能够产生成熟的IL-1β。在原代PAMs细胞中，PRRSV感染可以激活NLRP3炎症小体，并且，procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平呈现PRRSV的剂量依赖效应，而NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平则呈现PRRSV感染的时间依赖效应，在24h达到峰值，48h下降到最低值。另外，通过利用NLRP3特异性抑制剂和针对NLRP3及ASC的特异性siRNA等工具，共同证实了PRRSV是通过NLRP3炎症小体信号通路途径诱导的IL-1β的分泌。 42猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究越来越多的研究表明NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用。在巨噬细胞和树突状细胞中，由NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达和分泌至少需要两个信号刺激，一是如内毒素（LPS）等病原相关分子模式被细胞模式识别受体识别，从而使机体上调表达IL-1β的前体mRNA，另一信号是如ATP和Nigericin等引起NLRP3招募和激活促炎症蛋白酶Caspase-1，活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18前体，产生成熟的IL-1β和IL-18(Atianandetal.2013;Schroderetal.2010a)。前期实验报道流感病毒（influenzaAvirus,IAV）、腺病毒（adenovirus）、仙台病毒（sendaivirus,Sev）以及PRRSV等都可以激活NLRP3炎症小体(Allenetal.2009;Bietal.2014;Kannegantietal.2006;Muruveetal.2008;Thomasetal.2009)，而IAV的缺陷小鼠实验表明，NLRP3、ASC和Caspase-1缺陷的小鼠在IAV感染中其呼吸道炎症状明显削弱且死亡率显著提高(Allenetal.2009;Ichinoheetal.2009;Kannegantietal.2006;Thomasetal.2009)，提示NLRP3炎症小体可能在抗病毒感染中起重要作用。而相应的，病毒也表达抑制NLRP3炎症小体的组分从而拮抗NLRP3先天性免疫(Komuneetal.2011;Stasakovaetal.2005)，因此筛选抑制NLRP3炎症小体的病毒组分将会为进一步阐明PRRSV引起机体免疫抑制和持续性感染的机制提供理论基础(Mateuetal.2008)。所以，本实验拟以PRRSV为研究对象，筛选可能抑制NLRP3炎症小体活化的病毒组分，为进一步探讨病毒拮抗天然免疫的机制以及为PRRSV的预防研究奠定基础。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1毒株、菌株和细胞HEK293T细胞由本实验室保存，其它所用病毒毒株、菌株和细胞同3.1.1.1。4.1.1.2主要试剂限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、ExTaqDNA聚合酶、LATaqDNA聚合酶、2×GCBufferII、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)primer、dNTPmixture（10mM）、pMDTM18-T载体均购自TaKaRa公司；DNA纯化回收试剂盒以及质粒抽提和纯化试剂盒购自AxyGen公司；NLRP3刺激剂Nigericin购自InvivoGen公司；鼠抗FLAG标签单克隆抗体购自Sigma公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体和鼠抗内参基因Actin抗体购自Abbkine公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore公司；脱脂奶粉购自BD公司；ECL化学发光试剂购自CellSignalingTechnology公司；其它试剂同3.1.1.2。 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究434.1.1.3主要仪器主要仪器设备同3.1.1.3。4.1.1.4自行配制试剂部分参考《分子克隆实验指南》第三版。1.1.0mol/LTris-HCL(pH6.8)：称取Tris粉末15.14g，加入去离子水200mL充分溶解后加入浓盐酸调节pH值到6.8，定容至250mL，4℃保存。2.1.5mol/LTris-HCL(pH8.8)：称取Tris粉末45.43g，加入去离子水200mL充分溶解后加入浓盐酸调节pH值到8.8，定容至250mL，4℃保存。3.5×SDS-PAGE上样缓冲液：分别称取SDS5g和溴酚蓝2.5g，并吸取12.5mL1MTris-HCL(pH6.8)和25mL甘油，加去离子水溶解后定容至50mL，按照1mL/份分装于EP管中，-20℃保存。使用前加入50μLβ-巯基乙醇（2-ME），4℃保存。4.5×SDS-PAGE电泳缓冲液：分别称取Tris15.1g、Glycine94g、SDS5g，加入800mL去离子水搅拌使其充分溶解后定容至1L，室温保存。5.膜转移缓冲液：分别称取Tris5.8g、Glycine2.9g、SDS0.37g，加入去离子水搅拌使其充分溶解后定容至800mL，再加入200mL甲醇，室温保存。6.封闭液：称取脱脂奶粉5g，加入100mLPBST，充分溶解后使用，现用现配，4℃保存。7.10%十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）：称取SDS10g，加入去离子水100mL，在37℃水浴中使其充分溶解，室温保存。8.10%过硫酸铵（ammoniumpersulphate,APS）：称取APS0.1g，加入去离子水1mL，充分溶解后使用，4℃保存。现用现配，在4℃可保存2周左右。9.30%丙烯酰胺：分别称取丙烯酰胺29g、双丙烯酰胺1g，加入去离子水100mL，充分溶解后用0.45μm滤膜过滤，4℃保存。其它配制试剂同3.1.1.4。4.1.2方法4.1.2.1已有质粒简介pcDNA3.1-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-nsp11及其核酸内切酶催化活性缺失的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A(nsp11H129A)和pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A(nsp11H144A)、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α及其缺失N端锌指（ZF）结构或只有N端ZF结构的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp1αZF和pcDNA3.1-FLAG-nsp1αDZF以及突变ZF结构的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp1αC8A、pcDNA3.1-FLAG-nsp1αC10A、pcDNA3.1-FLAG-nsp1αC25A和pcDNA3.1-FLAG-nsp1αC28A均由本实验室前期构建(Shietal.2011;Shietal.2013)。 44猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究4.1.2.2真核表达质粒的构建1.以LPS刺激过的PAMs细胞为模板，按照3.1.2.9中的方法提取细胞总RNA，并以此为模板，进行反转录反应。反转录体系（50μL），以下反应混合液需在冰上配制。组分加入量Oligo(dT)primer5μLTotalRNA2.5μgRNAasefreeH2OUpto35μL70℃水浴10min，冰上急冷2min，瞬时离心。配制反转录试剂混合液。组分加入量5×M-MLVBuffer10μLdNTPMixture2.5μLRNaseInhibitor1.25μLRTaseM-MLV1.25μL42℃水浴1h，70℃水浴15min终止反应，得到的cDNA于-20℃冻存。2.聚合酶链式反应（PCR）克隆基因全长的特异性引物是根据NCBI中GenBank上发表的猪NLRP3（GenBank：JQ219660.1）、ASC（GenBank：XM_003124468.2）、procaspase-1（GenBank：NM_214162.1）、pro-IL-1β（GenBank：M86725.1）和PRRSVBJ-4（GenBank：AF331831.1）的序列进行设计，并由上海生工合成后使用。表4-1PCR扩增引物序列Table4-1PCRamplificationprimersequence引物名称引物序列产物大小PrimerSequence(5’3’)SizeofproductsNLRP3ForGATATCCATGAGCATGGCAAGCGTCCGCT3111bpNLRP3RevCTCGAGCTACTGGGAAGGCTCAAAGACAATprocaspase-1ForGGTACCCATGGCCGATAAGGTGCTGAAGGA1215bpprocaspase-1RevCTCGAGTTAATGTCCTGGGAAGAGATAApro-IL-1βForAAGCTTCATGGCCATAGTACCTGAACCCGC804bppro-IL-1βRevCTCGAGTTAGGGAGAGAGGACTTCCATGGTASCForAAGCTTCATGGGGTGCACGCGTGACGCCAT591bpASCRevCTCGAGTCAGCTCTGCTCCAGGTCGGCCACGP2aForATAGGTACCCATGAAATGGGGTCCATGCAAAGC771bpGP2aRevCCGCTCGAGTCACTGTGAGTTCGAAAGAAAAAT 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究45GP2bForAATAAGCTTCATGGGGTCCATGCAAAGCCTTTT222bpGP2bRevCCGTCTAGATCATAAGATCTTCTGTAATTGCTCGP3ForGCGAAGCTTCATGGTTAATAGCTGTACATTCCT765bpGP3RevATATCTAGACTATCGCCGTACGGCACTGAGGP4ForAATAAGCTTCATGGCTTCGTCCCTTCTTTTCCT537bpGP4RevCGCTCTAGATCAAATTGCCAACAGAATGGCAAA将反转录得到的cDNA样品进行PCR反应。PCR反应体系（50μL）如下，以下反应混合液需在冰上配制：组分加入量cDNA模板2μL上游引物1μL下游引物1μLdNTPMixture8μL10×LATaqBuffer5μLLATaq0.5μLRNAasefreeH2O32.5μL反应程序：1）预变性：94℃，1min；2）扩增程序：94℃，30s，55℃30s，72℃（NLRP34min、ASC1min、procaspase-11.5min、pro-IL-1β1min），共30个循环。3）最后延伸：72℃10min。4）保存：4℃。ASC的PCR反应液中LATaqBuffer应换用2×GCBufferII。3.DNA凝胶回收将上一步所得PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，鉴定是否有特异性目的条带。1）在紫外灯下将含有目的DNA的凝胶切下，尽可能切下最小体积的凝胶并切碎（尽量减少凝胶暴露在紫外线下的时间，避免紫外线对DNA造成的损伤），计算凝胶重量（提前记录EP管的重量），该重量作为一个凝胶体积（例如100mg=100μL）；2）加入3倍凝胶体积的BufferDE-A，混合均匀，75℃水浴放置约15min，期间每2-3min混合一次，直至凝胶完全熔化；3）加入0.5个BufferDE-A体积的BufferDE-B，混合均匀后转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，12,000×g离心1min，弃掉滤液；4）将制备管放回2mL离心管，加入500μLBufferW1，12,000×g离心30s，弃掉滤液； 46猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究5）将制备管放回2mL离心管，加入700μLBufferW2，12,000×g离心30s，弃掉滤液，重复一次（BufferW2在使用前需加入制定体积的无水乙醇）；6）将制备管放回2mL离心管中，12,000×g离心1min；7）将制备管置于新的EP管中，在制备膜中央加入20-30μL加热至65℃的双蒸水，静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA，-20℃保存。4.连接T载体连接体系（10μL），以下反应混合液需在冰上配制。组分加入量pMDTM18-T0.5μLDNA回收产物4.5μLSolutionI5μL16℃水浴连接过夜。5.转化1）从-70℃超低温冰箱取出感受态细胞DH5α或JM109，冰上缓慢融化；2）待感受态细胞融化后，轻柔混合均匀，将连接产物加入到感受态细胞中；3）冰上放置30min，42℃水浴90s，冰上急冷2min；4）加入200μL无抗生素的LB培养基（使用前在37℃温育），37℃摇床摇菌1h，同时，将4℃保存的平板放入37℃恒温培养箱；5）轻柔混匀后，涂布到相应抗性的平板上，37℃恒温培养箱倒置培养至少12h。6.阳性单克隆鉴定1）挑取单克隆菌落（每个平板挑取5个）接种到含有相应抗生素的4mLLB培养基中，37℃摇床振荡过夜，一般不超过15h；2）取1μL菌液作为模板，进行菌液PCR反应鉴定阳性克隆；3）琼脂糖凝胶电泳，记录结果。4）将上述鉴定为阳性的菌液取出700μL并加入300μL50%高压灭菌后的甘油混合均匀，-20℃冻存，其余的提取质粒。7.提取质粒DNA首次使用时，将试剂盒携带的RNaseA全部加入到BufferS1中，混合均匀后于4℃保存。1）取剩余菌液放入EP管中，12,000×g离心1min，弃尽上清，在吸水纸上吸干净；2）加入250μLBufferS1，重悬菌体沉淀，尽量混匀不留有菌块；3）加入250μLBufferS2，充分并温和的上下翻转4-6次，使菌体充分裂解后形成透亮的溶液，此过程不超过5min；4）加入350μLBufferS3，充分并温和的上下翻转6-8次，12,000×g离心10min； 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究475）将离心上清转移到制备管（置于2mL离心管中），12,000×g离心2min，弃滤液；6）将制备管放回离心管中，加入500μLBufferW1，12,000×g离心1min，弃滤液；7）将制备管放回离心管中，加入700μLBufferW2，12,000×g离心1min，弃滤液，重复一次；8）将制备管放回离心管中，12,000×g离心2min；9）将制备管放入新的EP管中，开盖静置10min，在制备管膜中央加入60-80μL加热到65℃的去离子水，室温静置1min，12,000×g离心2min；10）紫外分光光度计检测质粒浓度。8.酶切鉴定将上述提取出来的质粒DNA按照如下反应体系（20μL）进行酶切鉴定：组分加入量质粒DNA2μg限制性内切酶10.5μL限制性内切酶20.5μL10×缓冲液2μL双蒸水至20μL将PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的质粒送上海生工公司测序，并将测序得到的结果与GenBank上发表的进行比对，检查是否有碱基的突变或缺失。9.重组质粒的构建及鉴定将阳性T载体克隆与目的载体pcDNA3.1-FLAG，经双酶切和胶回收各自的目的片段后，按适当比例进行连接、转化，菌液PCR和酶切鉴定后送上海生工公司测序，验证阅读框架的正确性。将构建正确的真核表达重组质粒分别命名为pcDNA3.1-FLAG-NLRP3、pcDNA3.1-FLAG-ASC、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β、pcDNA3.1-FLAG-GP2a、pcDNA3.1-FLAG-GP2b、pcDNA3.1-FLAG-GP3、pcDNA3.1-FLAG-GP4、pcDNA3.1-GFP-ASC和pcDNA3.1-GFP-GP2b。4.1.2.3真核表达质粒的转染取制备好的在24孔板中的PAMs细胞，按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行质粒转染。1.将Lipofectamine2000和质粒DNA分别用opti-MEM培养基稀释至50μL，混合均匀，室温静置5min;2.将质粒DNA加到Lipofectamine2000的混合液里，轻轻混匀，室温静置10-20min；3.弃去培养板中的培养基，加入400μL无血清1640培养基，再将上述混合液逐滴轻柔地加入到每孔细胞中，37℃、5%CO2培养箱继续培养； 48猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究4.6h后换液，并用LPS（1μg/mL）进行刺激，48h后TRIzol裂解细胞，并用qRT-PCR检测细胞中IL-1βmRNA的表达水平；或者6h后换液，并用LPS（1μg/mL）进行刺激，24h后再加入Nigericin（10μM）共同刺激，48h后收集细胞上清液并用ELISA试剂盒检测IL-1β蛋白的表达水平。5.最后，将所有收获的细胞用TRIzol裂解，并用qRT-PCR的方法检测转染到PAMs细胞中的各个质粒的表达情况，判断其表达水平是否一致。4.1.2.4炎症小体模型重构将HEK293T细胞用含10%FBS的DMEM培养基调至细胞浓度为3.5×105个/mL，按每孔500μL铺于24孔板中，待细胞密度达80%-90%时，用Lipofectamine2000转染pcDNA3.1-FLAG-NLRP3（150ng）、pcDNA3.1-FLAG-ASC（50ng）、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1（50ng）、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β（300ng）和对照质粒pcDNA3.1-FLAG（600ng）或pcDNA3.1-FLAG-nsp1α（600ng）或pcDNA3.1-FLAG-nsp11（600ng）及其突变体至HEK293T细胞。24h后收集细胞上清液并用ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量，同时，将收获的细胞进行WesternBlot检测。4.1.2.5WesternBlot1.样品制备24孔板中每孔细胞加入70μL左右1×SDS-PAGE上样缓冲液进行裂解，反复吹打后移入EP管中，煮沸10min，12,000r/min4℃离心10min。2.聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）将玻璃板清洗干净并烘干，架好胶板，根据待检蛋白质分子量的大小配制分离胶，混匀后加入到两玻璃板的夹缝中，并小心在胶面上加入去离子水，约30min，待胶自然凝固后倾倒出上层的去离子水，用滤纸将玻璃板上的水珠吸干净。加入浓缩胶至顶端后迅速插入相应梳子，约30min，待胶自然凝固后，放入电泳槽中，并加入1×SDS-PAGE电泳缓冲液至没过低玻璃板，拔去梳子，每孔加入20-30μL制备好的蛋白样品，80V电泳进行约20min，进入分离胶后换120V电泳约80min，当溴酚蓝移动到底部时，停止电泳。将玻璃板撬开后，切下分离胶并在分离胶的左上角切掉一小块，标记样品顺序。3.半干转膜根据切下的分离胶的大小裁好滤纸和PVDF膜，将PVDF膜用甲醇活化约5s左右，去离子水清洗后放入膜转移缓冲液中，滤纸也许用膜转移缓冲液浸湿。在转膜仪中，从下到上依次叠放滤纸、PVDF膜、分离胶、滤纸，操作过程中避免气泡产生，15V转膜1h左右。4.封闭将转好的膜放入封闭液中进行封闭，室温1-2h，摇床上缓慢晃动。5.一抗杂交按照抗体说明书用封闭液进行稀释，膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗，抗Flag 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究49标签的抗体以1:1000进行稀释，于缓慢摇床上4℃过夜。回收一抗，4℃保存，一周内可重复使用，膜用PBST漂洗5遍，每遍5min。6.二抗杂交按照抗体说明书用封闭液稀释至合适浓度，室温缓慢摇床孵育1h。膜用PBST漂洗5遍，每遍5min。7.ECL显影配制好发光底物混合液，将底物加到膜上静置1min，去掉多余液体，在暗盒中压片10min左右后取出，依次放入显影液、水、定影液中，最后将胶片冲洗干净并晾干，照相保存并记录实验结果。4.1.2.6数据处理及分析每个实验数据来自至少三次独立重复实验，数据统计分析采用T检验法或单因素方差分析，当P<0.05时，数据之间具有显著性差异，用“*”表示。本文所有图表均使用GraphPadPrism6.0软件完成。4.2结果4.2.1重组质粒的构建通过RT-PCR的方法从LPS刺激过的PAMs细胞和PRRSV的病毒液中克隆出NLRP3（3111bp）、ASC（591bp）、procaspase-1（1215bp）、pro-IL-1β（804bp）和GP2a（771bp）、GP2b（222bp）、GP3（765bp）、GP4（537bp）基因的编码区序列，酶切后将其连接至pcDNA3.1-FLAG和pcDNA3.1-GFP载体中，测序确证得到NLRP3、ASC、procaspase-1、pro-IL-1β和GP2a、GP2b、GP3、GP4基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FLAG-NLRP3、pcDNA3.1-FLAG-ASC、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β、pcDNA3.1-FLAG-GP2a、pcDNA3.1-FLAG-GP2b、pcDNA3.1-FLAG-GP3、pcDNA3.1-FLAG-GP4和pcDNA3.1-GFP-GP2b。见图4-1。 50猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究图4-1PCR扩增结果A：M：DL10,000DNAMarker；1：NLRP3；B：M：DL2000DNAMarker；1：ASC；C：M：DL2000DNAMarker；1：procaspase-1；D：M：DL2000DNAMarker；1：pro-IL-1β；E：M：DL2000DNAMarker；1：GP2a；F：M：DL2000DNAMarker；1：GP2b；G：M：DL2000DNAMarker；1：GP3；H：M：DL2000DNAMarker；1：GP4Fig.4-1PCRproductsA:M:DL10,000DNAMarker;1:NLRP3;B:M:DL2000DNAMarker;1:ASC;C:M:DL2000DNAMarker;1:procaspase-1;D:M:DL2000DNAMarker;1:pro-IL-1β;E:M:DL2000DNAMarker;1:GP2a;F:M:DL2000DNAMarker;1:GP2b;G:M:DL2000DNAMarker;1:GP3;H:M:DL2000DNAMarker;1:GP44.2.2nsp11的核酸内切酶活性是其抑制NLRP3炎症小体活化所必需的4.2.2.1nsp11可以抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高本文之前的研究结果表明，PRRSV可以在感染早期引起IL-1β的表达升高，但在感染晚期降低，我们推测PRRSV的某些组分可能抑制了IL-1β的升高。前期研究表明PRRSVnsp11是PRRSV的重要免疫抑制蛋白，具有抑制IFN-β产生等作用(Luoetal.2008;Shietal.2010)。因此，为了研究nsp11是否抑制了IL-1β的表达，本实验选取PAMs细胞为模型，并用nsp11的真核表达质粒及其对照质粒进行转染实验，qRT-PCR方法检测pro-IL-1βmRNA的表达水平。结果显示，pro-IL-1β的mRNA水平与对照质粒组相比，下降约60%，具有显著性差异。见图4-2。 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究51图4-2nsp11抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高PAMs转染pcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11)及其对照质粒pcDNA3.1-FLAG(Vector)，6h后加入LPS(1μg/mL)，刺激42h后收集细胞并用qRT-PCR检测pro-IL-1β的表达量Fig.4-2nsp11caninhibitLPSinducedexpressionofpro-IL-1βmRNAPAMsweretransfectedwithpcDNA3.1-FLAG(Vector)andpcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11),6hlater,thecellswerestimulatedwithLPS(1μg/mL)for42h,andthen,cellswereharvestedandanalyzedbyIL-1β-specificqRT-PCR4.2.2.2nsp11核酸内切酶活性缺失突变体不能抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高PRRSVnsp11是一个具有核酸内切酶活性的蛋白质，His-129、His-144和Lys-173是其催化中心的关键氨基酸，突变其中任何一个都会使nsp11缺失酶活性(Nedialkovaetal.2009)。为了验证nsp11的核酸内切酶活性是否在其抑制IL-1β的表达中发挥作用，本实验中将His-129和His-144均突变成Ala（nsp11H129A和nsp11H144A）。将pcDNA3.1-FLAG-nsp11及其核酸内切酶催化活性缺失的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A和pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A转染PAMs细胞，在LPS的刺激下，转染48h后收集细胞，qRT-PCR检测pro-IL-1β和nsp11及其突变体mRNA的表达水平。结果显示，转染突变体后，pro-IL-1β的表达与对照质粒组无显著性差异，表明突变任何一个关键性氨基酸均不能抑制pro-IL-1β的表达。见图4-3。 52猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究图4-3nsp11突变体不能抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高PAMs转染pcDNA3.1-FLAG(Vector)、pcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11)、pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A(nsp11H129A)或pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A(nsp11H144A)，6h后加入LPS(1μg/mL)，刺激42h后收集细胞并用qRT-PCR检测IL-1β(A)和nsp11,nsp11H129A,andnsp11H144AmRNA(B)的表达量Fig.4-3nsp11mutantscannotinhibitLPSinducedexpressionofpro-IL-1βmRNAPAMsweretransfectedwithpcDNA3.1-FLAG(Vector),pcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11),pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A(nsp11H129A),orpcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A(nsp11H144A).Sixhourslater,thecellswerestimulatedwithLPS(1μg/mL)for42h,andthen,cellswereharvestedandanalyzedforIL-1β(A)ornsp11,nsp11H129A,andnsp11H144AmRNA(B)byqRT-PCR4.2.2.3nsp11可以抑制由LPS和Nigericin共同刺激诱导的IL-1β的分泌Nigericin（尼日利亚菌素）是一种穿孔毒素，在LPS作用的树突状细胞中可以引起不依赖于P2X7受体的钾离子外流，从而激活NLRP3炎症小体。为了在蛋白水平上研究nsp11是否能够抑制NLRP3炎症小体的活化，本实验选取PAMs细胞为模型，并用nsp11的真核表达质粒及其对照质粒进行转染实验，ELISA检测IL-1β的表达量。结果显示，转染nsp11后，IL-1β的表达量与对照组相比，下降约30%，具有显著性差异，表明nsp11能够抑制LPS和Nigericin共同刺激诱导的IL-1β的分泌。见图4-4。 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究53图4-4nsp11可以抑制由LPS和Nigericin共同刺激诱导的IL-1β的分泌PAMs转染pcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11)及其对照质粒pcDNA3.1-FLAG(Vector)，6h后加入LPS(1μg/mL)，刺激24h后加入nigericin(10μM)，刺激18h后收集细胞上清液并用ELISA检测IL-1β的表达量Fig.4-4nsp11caninhibitLPSplusnigericininducedsecretionofIL-1βPAMsweretransfectedwithpcDNA3.1-FLAG(Vector)orpcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11).Sixhourslater,thecellswerestimulatedwithLPS(1μg/mL),and24hlater,thecellcultureswereaddedwithnigericin(10μM).Then18hlater,thecell-freesupernatantswerecollectedandanalyzedforIL-1βbyELISA4.2.2.3nsp11核酸内切酶活性缺失突变体不能抑制由LPS和Nigericin共同刺激诱导的IL-1β的分泌将pcDNA3.1-FLAG-nsp11及其核酸内切酶催化活性缺失的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A和pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A转染PAMs细胞，在LPS和Nigericin的共同刺激下，转染48h后收集细胞，ELISA检测IL-1β的分泌情况。结果显示，转染nsp11突变体后，IL-1β的表达量与对照质粒组相比无显著差异，表明nsp11的核酸内切酶活性在抑制IL-1β的表达中起着不可或缺的作用。见图4-5。 54猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究图4-5nsp11突变体不能抑制由LPS和Nigericin共同刺激诱导的IL-1β的分泌PAMs转染pcDNA3.1-FLAG(Vector)、pcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11)、pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A(nsp11H129A)或pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A(nsp11H144A)，6h后加入LPS(1μg/mL)，刺激24h后加入nigericin(10μM)，刺激18h后收集细胞上清液并用ELISA检测IL-1β的表达量Fig.4-5nsp11mutantscannotinhibitLPSplusnigericininducedsecretionofIL-1βPAMsweretransfectedwithpcDNA3.1-FLAG(Vector),pcDNA3.1-FLAG-nsp11(nsp11),pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A(nsp11H129A),orpcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A(nsp11H144A).Sixhourslater,thecellswerestimulatedwithLPS(1μg/mL),and24hlater,thecellcultureswereaddedwithnigericin(10μM).Then18hlater,thecell-freesupernatantswerecollectedandanalyzedforIL-1βbyELISA4.2.2.4NLRP3炎症小体模型重构为了确定nsp11对NLRP3炎症小体在PAMs细胞上的抑制作用，本研究在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中，共转染pcDNA3.1-FLAG-NLRP3（150ng）、pcDNA3.1-FLAG-ASC（50ng）、pcDNA3.1-FLAG-procaspase-1（50ng）、pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β（300ng）和对照质粒pcDNA3.1-FLAG（600ng），建立了NLRP3炎症小体的体外研究模型(Bryanetal.2009)，为后续验证实验提供基础。ELISA检测结果显示，在共转染这四个炎症小体相关质粒时，可以引起IL-1β的表达且表达量最高，而阴性对照组（只转染对照质粒和只转染pcDNA3.1-FLAG-pro-IL-1β）的IL-1β的表达量则较低。结果表明在HEK293T细胞上成功重构了NLRP3炎症小体模型。见图4-6。 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究55图4.6HEK293T细胞上重构NLRP3炎症小体HEK293T细胞转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β表达质粒或对照质粒pcDNA3.1-FLAG（-），ELISA检测IL-1β蛋白表达Fig.4.6ReconstructNLRP3inflammasomeinHEK293TcellsHEK293TcellsweretransfectedwithexpressionplasmidsencodingNLRP3,ASC,procaspase-1,andpro-IL-1βorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-),IL-1βwasanalysedbyELISA4.2.2.5在HEK293T细胞上，nsp11可以抑制由NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌将NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个炎症小体相关质粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp11（100ng、500ng、1000ng）或者对照质粒pcDNA3.1-FLAG（600ng）共转染HEK293T细胞，24h后收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量。结果显示，随着nsp11剂量的增加，其对于由NLRP3炎症小体介导的IL-1β分泌的抑制作用呈现剂量依赖效应。见图4-7A。另外，将这四个炎症小体相关质粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp11、pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A、pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A或者对照质粒pcDNA3.1-FLAG（600ng）共转染HEK293T细胞，24h后收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量。结果显示，转染nsp11后，IL-1β的表达量与对照组相比，下降约90%，具有显著性差异，而转染nsp11突变体后，IL-1β的表达量与对照组相比无显著性差异。见图4-7B。以上结果确切的证实了nsp11的核酸内切酶活性是其抑制NLRP3炎症小体活化所必需的。 56猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究图4-7HEK293T细胞上ELISA检测结果A：HEK293T细胞转染NLRP3、ASC、procaspase-1、pro-IL-1β表达质粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp11（100ng、500ng、1000ng）或对照质粒pcDNA3.1-FLAG（-），24h后收集细胞上清液并用ELISA方法检测IL-1β蛋白表达，收获的细胞进行WesternBlot检测；B：HEK293T细胞转染NLRP3、ASC、procaspase-1、pro-IL-1β表达质粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp11、pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A、pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144A或者对照质粒pcDNA3.1-FLAG（-），24h后收集细胞上清液并用ELISA方法检测IL-1β蛋白表达，收获的细胞进行WesternBlot检测Fig.4-7TheELISAresultinHEK293TcellsA:HEK293TcellswerecotransfectedwithexpressionplasmidsencodingNLRP3,ASC,procaspase-1,pro-IL-1βandpcDNA3.1-FLAG-nsp11(100ng,500ng,1000ng)orcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-),thecell-freesupernatantswerecollectedat24haftertransfectionandwereanalyzedforIL-1βbyELISA,andthecellswereharvestedandanalyzedfornsp11proteinbywesternblot;B:HEK293TcellswerecotransfectedwithexpressionplasmidsencodingNLRP3,ASC,procaspase-1,pro-IL-1βandpcDNA3.1-FLAG-nsp11,pcDNA3.1-FLAG-nsp11H129A,pcDNA3.1-FLAG-nsp11H144AorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-),thecell-freesupernatantswerecollectedat24haftertransfectionandwereanalyzedforIL-1βbyELISA,andthecellswereharvestedandanalyzedfornsp11proteinbywesternblot4.2.3nsp1α的N端ZF结构是其抑制NLRP3炎症小体活化所必需的4.2.3.1PRRSVnsp1α抑制由NLRP3介导的炎症小体活化PRRSV至少编码16个非结构蛋白（nonstructuralproteins,nsps），这些nsps主要参与病毒基因组的复制和转录(Snijderetal.2013)。而研究表明PRRSVnsp1α是PRRSV的重要免疫抑制蛋白，具有抑制IFN-β转录和TNF-α的产生等作用(Shietal.2013;Songetal.2010a;Subramaniametal.2012)。因此，本实验将探究nsp1α是否抑制NLRP3炎症小 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究57体活化。将NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个炎症小体相关质粒和pcDNA3.1-FLAG-nsp1α（600ng）或者对照质粒pcDNA3.1-FLAG（600ng）共转染HEK293T细胞，24h后收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量。结果显示，共转染nsp1α后，IL-1β的表达与共转染对照质粒组相比，下降约50%，具有显著性差异。见图4-8A。另外，将nsp1α或对照质粒转染PAMs并用LPS或LPS和Nigericin刺激后，qRT-PCR结果显示，IL-1β的mRNA水平与对照质粒组相比，下降约60%，具有显著性差异，见图4-8B；ELISA结果显示，IL-1β蛋白水平的表达与对照质粒组相比，下降约24%，具有显著性差异，见图4-8C。以上结果表明，PRRSVnsp1α可以抑制由NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达。图4-8PRRSVnsp1α可以抑制NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β产生A：HEK293T细胞转染NLRP3炎症小体相关质粒和nsp1α或对照质粒pcDNA3.1-FLAG（-），ELISA检测IL-1β表达；B：PAMs转染nsp1α或对照质粒pcDNA3.1-FLAG，LPS刺激后，qRT-PCR检测IL-1βmRNA表达；C：PAMs转染nsp1α或对照质粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA检测IL-1β蛋白表达Fig.4-8PRRSVnsp1αcaninhibitNLRP3inflammasome-mediatedIL-1βproductionA:HEK293TcellsweretransfectedwithNLRP3inflammasomeandnsp1αorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-),IL-1βsecretionwasanalysedbyELISA;B:PAMsweretransfectedwithnsp1αorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-)andthenwerestimulatedwithLPS,IL-1βmRNAwasquantifiedbyqRT-PCR;C:PAMsweretransfectedwithnsp1αorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-)andthenwerestimulatedwithLPSplusNigericin,IL-1βsecretionwasanalysedbyELISA4.2.3.2HEK293T细胞上PRRSVnsp1αZF结构域突变体不能抑制由NLRP3介导的炎症小体活化nsp1α包含三个结构域：分别是N端的锌指结构功能域（Zinc-fingerdomain,ZF,Met1-Glu65）、中间的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶区域（Papain-likecysteineprotease,PCPα,Pro66-Gln166）和C端的延长区域（Cterminalextension,CTE,Arg167-Met180）(Sun 58猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究etal.2009)。为研究nsp1α的ZF结构域是否在nsp1α抑制IL-1β的表达中发挥重要作用，将缺失ZF结构域的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp1αDZF或者只含有ZF结构域的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp1αZF与炎症小体相关质粒共转染HEK293T细胞，24h后收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量。结果显示，转染缺失ZF结构域的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp1αDZF后，IL-1β的表达量与对照质粒组相比无显著性差异，表明缺失ZF结构域后nsp1α不能够抑制IL-1β的表达。见图4-9A。另外，转染只含有ZF结构域的突变体pcDNA3.1-FLAG-nsp1αZF后，IL-1β的表达量与对照质粒组相比无显著性差异。以上结果表明ZF结构域在nsp1α抑制IL-1β表达中起着不可或缺的作用。在ZF结构域中，围绕着Zn离子周围与Zn离子结合的有四个半胱氨酸残基（Cys8、Cys10、Cys25和Cys28），而突变任何一个半胱氨酸残基都会破坏ZF结构(Songetal.2010a)。因此，将这四个单氨基酸突变体nsp1αC8A、nsp1αC10A、nsp1αC25A、nsp1αC28A分别与炎症小体相关质粒共转染HEK293T细胞，24h后收集细胞上清液，用ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量。结果显示，转染四个突变体后，IL-1β的表达与对照质粒组无显著性差异，表明突变任何一个半胱氨酸残基后，nsp1α都不能够抑制IL-1β的表达。见图4-9B。图4-9HEK293T细胞上PRRSVnsp1αZF结构域突变体不能抑制由NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β产生A：HEK293T细胞转染NLRP3炎症小体相关质粒和nsp1α或缺失ZF结构域突变体nsp1αDZF或只含有ZF结构域突变体nsp1αZF或对照质粒pcDNA3.1-FLAG（-），ELISA检测IL-1β表达；B：HEK293T细胞转染NLRP3炎症小体相关质粒和nsp1α或四个单氨基酸突变体nsp1αC8A、nsp1αC10A、nsp1αC25A、nsp1αC28A或对照质粒pcDNA3.1-FLAG（-），ELISA检测IL-1β表达Fig.4-9PRRSVnsp1αZFdomainmutantscannotinhibitNLRP3inflammasome-mediatedIL-1βproductioninHEK293TcellsA:HEK293TcellsweretransfectedwithNLRP3inflammasomeandnsp1αornsp1αDZFornsp1αZForcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-),IL-1βsecretionwasanalysedbyELISA;B:HEK293TcellsweretransfectedwithNLRP3inflammasomeandnsp1αornsp1αC8A,nsp1αC10A,nsp1αC25A,nsp1αC28AorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-),IL-1βsecretionwasanalysedbyELISA 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究594.2.3.3PAMs细胞上PRRSVnsp1αZF结构域突变体不能抑制由NLRP3介导的炎症小体活化将pcDNA3.1-FLAG、pcDNA3.1-FLAG-nsp1α及其ZF结构域突变体转染PAMs，在LPS和Nigericin的共同刺激下，转染48h后收集细胞上清液，ELISA试剂盒检测IL-1β的表达量。结果显示，转染nsp1α后，IL-1β的表达与对照组相比，下降约30%，具有显著性差异，表明转染nsp1α能够抑制IL-1β的表达。而转染PRRSVnsp1αZF结构域的突变体后，与对照组相比，IL-1β的表达并无显著性差异，均不能够抑制IL-1β的表达。见图4-10。上述结果表明，在PAMs细胞上，PRRSVnsp1α可以抑制由LPS和Nigericin引起的IL-1β的表达，并且ZF结构域在nsp1α抑制IL-1β表达的过程中是必需的。图4-10PAMs细胞上PRRSVnsp1αZF结构域突变体不能抑制由NLRP3炎症小体活化介导的IL-1β产生A：PAMs转染nsp1α或缺失ZF结构域突变体nsp1αDZF或对照质粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA检测IL-1β表达；B：PAMs转染nsp1α或四个单氨基酸突变体nsp1αC8A、nsp1αC10A、nsp1αC25A、nsp1αC28A或只含有ZF结构域突变体nsp1αZF或对照质粒pcDNA3.1-FLAG，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA检测IL-1β表达Fig.4-10PRRSVnsp1αZFdomainmutantscannotinhibitNLRP3inflammasome-mediatedIL-1βproductioninPAMsA:PAMsweretransfectedwithnsp1αornsp1αDZForcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-)andthenwerestimulatedwithLPSplusNigericin,IL-1βsecretionwasanalysedbyELISA;B:PAMsweretransfectedwithnsp1αornsp1αC8A,nsp1αC10A,nsp1αC25A,nsp1αC28AorcontrolplasmidpcDNA3.1-FLAG(-)andthenwerestimulatedwithLPSplusNigericin,IL-1βsecretionwasanalysedbyELISA4.3讨论最近研究表明，PRRSV可以激活其天然宿主细胞PAMs中的NLRP3炎症小体并且导致IL-1β的分泌增加(Bietal.2014;Qiaoetal.2011;Zhangetal.2013)，这和本实验研究结果相一致。但研究PRRSV感染PAMs细胞后NLRP3炎症小体的动态变化情况，我们 60猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究还发现procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平和IL-1β的蛋白水平在病毒感染晚期要远低于感染早期。由此我们推测PRRSV在激活NLRP3炎症小体的同时也在限制着这种抗病毒反应，但是其具体机制还不清楚。I型干扰素（IFN-α/β）提供了宿主抵抗病毒入侵的第一道屏障(Weberetal.2004)，而且，对于启动宿主对病毒感染的控制和适应性免疫反应都是非常重要的(Mulleretal.1994)。然而，许多病毒都会通过自身的防御机制来抑制干扰素的产生，比如流感病毒的NS-1蛋白就可以拮抗干扰素的产生(Haleetal.2008)。研究表明，重组I型干扰素不仅能够保护PAMs和MARC-145细胞不受PRRSV的感染，还能减少病毒在体内的复制(Buddaertetal.1998;Overendetal.2007;Sunetal.2012a)。而PRRSV不仅不能诱导I型干扰素的产生，还可以抑制Poly(I:C)引起的IFN-β的表达(Shietal.2010)，研究表明PRRSVnsp1、nsp2和nsp11可以拮抗干扰素的产生(Beuraetal.2010;Shietal.2010)，从而调节宿主的免疫效应。同样地，许多病毒也可以通过编码一个或几个关键蛋白来抑制炎症小体的活化和IL-1β的产生，从而逃避或破坏宿主天然免疫系统的防御。例如：流感病毒编码的NS-1蛋白能够抑制Caspase-1活性以及IL-1β和IL-18表达，麻疹病毒编码的非结构蛋白V能够与NLRP3结合来抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β表达(Komuneetal.2011;Stasakovaetal.2005)。截止到目前，关于PRRSV自身是如何逃避或破坏宿主天然免疫系统中炎症小体防御的机制尚不清楚。所以，本实验首先针对nsp11对于NLRP3炎症小体介导的IL-1β产生的影响进行深入研究。本实验利用LPS或LPS和Nigericin刺激的原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）为模型，发现PRRSVnsp11不仅可以抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高，还可以抑制由LPS和Nigericin共同诱导的IL-1β蛋白水平的升高，提示nsp11不仅可以抑制炎症小体活化的第一信号途径，而且也可以抑制炎症小体的第二信号途径。同时，本实验还在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中，共转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个真核表达质粒，建立NLRP3炎症小体的体外研究模型，然后共转染PRRSVnsp11和nsp1α及其突变体的真核表达质粒，也得到与PAMs细胞上一致的实验结果，更加确定了nsp11的抑制作用。PRRSVnsp11具有尿嘧啶特异性的内切核糖核酸酶（NendoU）活性，是尼多病毒特有的遗传标记(Ivanovetal.2004;Nedialkovaetal.2009)。NendoU结构域是比较保守的，冠状病毒的nsp15晶体结构显示NendoU的活性位点包含2个组氨酸和1个赖氨酸(Ricagnoetal.2006;Xuetal.2006)，而突变其中任何一个氨基酸都会使核酸内切酶的活性消失(Guarinoetal.2005;Ivanovetal.2004)。本实验室前期研究表明，PRRSV的活性位点包含了His-129、His-144和Lys-173，突变其中任何一个氨基酸都会使nsp11失去抑制IFN-β产生的活性(Shietal.2011)，因此，nsp11的核酸内切酶活性对于其抑制IFN-β的产生是必需的。所以，本实验在验证了nsp11可以抑制IL-1β产生之后，选择nsp11的核酸内切酶活性突变体来研究该活性在抑制IL-1β中的作用。实验结果发现，缺失核酸内切酶活性的nsp11均不能抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA 第四章PRRSVnsp11和nsp1α抑制NLRP3炎症小体研究61水平的升高和由LPS和Nigericin共同诱导的IL-1β蛋白水平的升高，在PAMs细胞和HEK293T细胞模型上的结果相一致。这些结果充分说明了PRRSVnsp11的核酸内切酶活性对于其抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β的产生是必需的，对于解释本研究前期发现的现象提供了一点线索。研究发现，nsp1α是通过抑制NF-κB、干扰素调节因子3（IFNregulatoryfactor3,IRF3）的磷酸化以及IRF3与环腺苷酸反应元件（cyclicAMPresponsiveelement-binding,CREB）绑定蛋白（CREB-bindingprotein,CBP）的相互结合来抑制IFN的产生进而发挥其免疫抑制作用的(Kimetal.2010;Shietal.2010;Songetal.2010a)。所以，本实验之后选择nsp1α作为研究对象，同样利用LPS或LPS和Nigericin刺激的原代猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和重构了炎症小体的HEK293T细胞为模型，发现PRRSVnsp1α不仅可以抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高，还可以抑制由LPS和Nigericin共同诱导的IL-1β蛋白水平的升高。nsp1α包含的三个结构域中，N端的锌指结构功能域总是通过几个氨基酸（C8-C10-C25-C28）和锌离子结合并独立折叠起来以稳定其结构，并帮助病毒抵抗宿主细胞的抗病毒反应，在nsp1α抑制IFN-β的过程中发挥着重要作用。本实验室前期的研究结果表明PRRSVnsp1α的ZF结构对于其抑制IFN-β的转录是必需的，突变围绕锌离子的四个关键氨基酸后，nsp1α则失去了抑制活性(Shietal.2013)。因此，本实验利用缺失和突变ZF结构的nsp1α的突变体来验证该结构在抑制IL-1β中的作用。实验结果发现，缺失ZF结构和只含有ZF结构以及突变ZF结构的突变体均不能抑制IL-1β的产生，在PAMs细胞和HEK293T细胞模型上的结果相一致。这些结果表明ZF结构在nsp1α抑制由NLRP3炎症小体介导的IL-1β产生过程中是必需的，是其发挥免疫抑制功能的重要结构域，为解释本研究前期发现的现象提供了更多的线索。在实验过程中，为了保证nsp11、nsp1α及其突变体在PAMs细胞上表达水平的一致性，首先通过WesternBlot实验检测各个蛋白的表达情况，然而由于PAMs细胞的转染效率较低，即使多次优化了各个转染试剂以及转染条件，用WesternBlot的方法仍然很难检测到各个蛋白的表达；然后用qRT-PCR的方法来检测，发现转染到PAMs细胞上的各个质粒的mRNA水平基本一致，另一方面在HEK293T细胞上可以检测到目的蛋白的表达，保证了实验结果的可靠性。在PAMs细胞刺激模型中，我们选择了LPS和Nigericin这两个刺激剂来保证NLRP3炎症小体的激活，同时，过表达nsp11和nsp1α及其突变体来进行验证实验，而没有选择通过PRRSV感染PAMs细胞为模型，因为PRRSV感染细胞后其本身也会编码nsp11和nsp1α等蛋白，会影响到本实验的针对性，不能够很好的展现出只针对于NLRP3炎症小体的影响。综上所述，PRRSV感染激活NLRP3炎症小体并产生IL-1β等促炎性细胞因子来抵御病毒入侵和保护机体的同时，病毒自身又编码能拮抗NLRP3炎症小体活化的蛋白——nsp11和nsp1α，使自身能够在宿主体内增殖。因此，本研究进一步发现了PRRSV拮抗天然免疫的新机制——拮抗NLRP3炎症小体活化，为PRRSV的防控提供了潜在的分 62猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究子靶点和理论基础。4.4小结本章实验利用LPS或LPS和Nigericin刺激PAMs细胞，以及在HEK293T细胞上成功重构了NLRP3炎症小体，利用这两个细胞模型，经过突变体转染实验共同证实了核酸内切酶活性在PRRSVnsp11以及ZF结构在PRRSVnsp1α抑制由NLRP3炎症小体信号通路介导的IL-1β表达过程中是必需的。 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应63第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应微小非编码RNA（microRNA,miRNA）是一类单链内源性的转录后基因表达调控分子，大小约为20-23个核苷酸。该类RNA可以通过与互补的mRNA选择性地结合来抑制蛋白质的产生，广泛存在于动植物和病毒中。越来越多的研究表明miRNA能够参与各种各样的调节途径，包括器官的形成和发育、细胞的生长、分化和凋亡、造血过程、脂肪代谢、病毒增殖以及炎症和自身免疫性疾病的发病机理等方面。炎症反应过程是由趋化因子、细胞因子和不同的炎性细胞介导的，虽然对于miRNA调控这种天然免疫反应的分子机制还不是很清晰，但最近的研究结果表明miRNA确实在炎症反应的发生和发展过程中起着重要的调节作用。这些miRNAs在调控一些细胞类型，组织和生物学反应的基因表达模式的稳定性和持续性上发挥着关键作用，比如miR-126、miR-132、miR-146、miR-155和miR-221已经被证实成为一些炎症相关介质的转录调节因子(Marques-Rochaetal.2015)。特别是对于这些重要的介质分子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-18、细胞间黏附分子1、血管细胞粘附分子和纤溶酶原激活物抑制剂1的调控。也许在不久的将来，下调或者是拮抗这些miRNAs以及控制外源性的miRNAs会成为对于炎症相关疾病很有前景的治疗策略。本实验之前的研究结果和其他实验室的研究结果均显示PRRSV感染PAMs细胞后，能够通过NLRP3炎症小体途径诱导IL-1β的分泌(Bietal.2014;Lunneyetal.2010;Qiaoetal.2011;Wangetal.2015)。IL-1在炎症、免疫、感染和退行性疾病方面起着非常关键的作用(Dinarello2009;Simsetal.2010)。虽然IL-1包括了IL-1α和IL-1β两种细胞因子，但是这两种细胞因子结合着同一个IL-1受体（IL-1R）。然而，它们却发挥着不同的功能。IL-1α在胃肠道的上皮细胞膜、肺脏、肝脏、肾脏、内皮细胞和星形胶质细胞中均呈现组成性表达，而IL-1β可以被单核细胞和巨噬细胞所分泌并且可以和其它细胞因子发生反应(Dinarello2011;Garlandaetal.2013)。因此，它们的表达水平受到严格的控制以使它们在合适的条件下发挥作用。已有研究报道IL-1α和IL-1β的表达水平可以被一些miRNAs所调控。比如，在人的牙龈成纤维细胞中，miR-146的抑制会促使IL-1β的表达水平升高(Xieetal.2013)；在皮质神经元细胞中，过表达miR-34a、miR-451和miR-874会使IL-1β和TNF-α的mRNA水平急剧升高(Truettneretal.2013)；抑制miR-181会使炎性细胞因子的表达水平上调，包括IL-1β(Hutchisonetal.2013)。另外，过表达miR-181可以通过作用其靶基因CD163来抑制PRRSV的复制和感染(Gaoetal.2013;Guoetal.2013)；miR-125b可以通过负调控NF-κB信号通路来抑制PRRSV的增殖(Wangetal.2013a)；miR-24-3p可以通过抑制血红素加氧酶的表达来促进PRRSV的增殖(Xiaoetal.2015)。那么，机体是否存在一些miRNAs能够调控PRRSV感染后引起的NLRP3炎症小体 64猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究介导的IL-1β的表达还未见报道，本章实验以期通过筛选能够促进或者抑制PRRSV增殖的miRNAs来找到能够参与调控NLRP3炎症小体信号通路的miRNAs，并深入探讨其作用机制。5.1材料与方法5.1.1材料5.1.1.1质粒、毒株、菌株和细胞用于双荧光素酶报告实验的质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negcontrolplasmid和psiCHECK-2vector由本实验室保存，其它所用病毒毒株、菌株和细胞同4.1.1.1。5.1.1.2主要试剂mml-miR-329-3pmimic、mml-miR-1283mimic、mml-miR-379-5pmimic、mml-miR-491-5pmimic、mml-miR-449b-3pmimic、mml-miR-382-5pmimic以及mml-miR-382-5pinhibitor、mml-miR-541-3pmimic以及mml-miR-541-3pinhibitor、mimic阴性对照AllStarsNegativeControlsiRNA、inhibitor阴性对照miScriptNegativeControlinhibitor、转染试剂HiPerFectTransfectionReagent和miScriptPrimerAssay、miRNeasyMiniKit、miScriptIIRTKit以及miScriptSYBRGreenPCRKit均购自Qiagen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；其它试剂同4.1.1.2。5.1.1.3主要仪器主要仪器设备同4.1.1.3。5.1.1.4自行配制试剂主要配制试剂同4.1.1.4。5.1.2方法5.1.2.1鉴定7条miRNAs对PRRSV复制的影响本章实验所使用的7条miRNAs是本实验室前期通过高通量测序从PRRSV感染的MARC-145细胞中筛选出来的变化较显著的miRNAs，其中，miR-382-5p和miR-541-3p是两条下调较显著的miRNAs。按常规方法传代MARC-145细胞至24孔板中，待细胞融合度达到80%左右，按照HiPerFectTransfectionReagent转染试剂说明书进行miRNAmimics（共7条）或miRNAinhibitors的转染。100nM的miRNA加入6μLHiPerFectTransfectionReagent，混合均匀并静置10min，逐滴轻柔地加入细胞孔中。24h后，感染PRRSVBJ-4株（MOI：1.0），48h后收集病毒，将样品反复冻融三次，3000r/min离心5min，取上清进行qRT-PCR和TCID50实验，检测miRNAs对PRRSV复制的影响。qRT-PCR所使用的ORF7和nsp1的特异性定量引物序列如下： 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应65引物名称引物序列产物大小PrimerSequence(5’3’)SizeofproductsORF7RTForAAACCAGTCCAGAGGCAAGG221bpORF7RTRevGCAAACTAAACTCCACAGTGTAAnsp1RTForAGGGTGTTTATGGCGGAGGG140bpnsp1RTRevAACGTCCACCGGAGTGGCTC5.1.2.2靶基因的筛选首先，根据生物信息学的方法，利用在线的生物信息学软件进行预测，例如TargetScan和miRanda，在猕猴的3’-UTR数据库中对miRNAs的宿主靶基因进行预测。根据种子序列（Seedsequence）在不同物种间的保守性、匹配情况和自由能进行初步筛选，之后依据这些靶基因的功能，如与天然免疫、炎症反应、抗病毒反应、免疫抑制等相关方面进行分类筛选，并结合几个分析软件获得交叉重叠的候选靶基因。然后，将mml-miR-382-5pmimic转染到MARC-145细胞中，48h收集细胞，qRT-PCR检测各个靶基因的表达情况。根据这些靶基因设计好跨内含子的定量引物并由上海生工进行合成后使用，引物序列如下。表5-1PCR扩增引物序列Table5-1PCRamplificationprimersequence引物名称引物序列产物大小PrimerSequence(5’3’)SizeofproductsNLRP12RTForGTGGCAGGGATAGGCAAGT132bpNLRP12RTRevTTCCGTGTCACTCTGGTTCATLR6RTForCAGTTTCCCACCCATCAG149bpTLR6RTRevCCAGCCCTCTACCACTTCTRAK1RTForCTGCCACCCTTCACCACT114bpTRAK1RTRevCGTCCAGGTCAACATCCAGMyD88RTForCTCATCGAAAAGAGGTGCCG139bpMyD88RTRevACTTGATGGGGATCAGTCGCNLRP1RTForGCTCCATTCGGAAGGCCATA112bpNLRP1RTRevCCAGACACGGTGTAACGACACASP3RTForCTGCGTCTTTCCCCCATTCT109bpCASP3RTRevGCTTCCATGTATGATTTTTGGTTCCCASP4RTForTAACTATGGCGGAGGGCAAC111bpCASP4RTRevTCAGCACATTCTGTTCCACCANFICRTForGCTCGATGGAGGAAGACGTG113bp 66猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究NFICRTRevCGAGATGCCTCCTTCCATGTTRAF3RTForCCTGCTGAGCTCCTCAAGTC147bpTRAF3RTRevAACTGCTCTGCACAACCTCTTRAF5RTForAACTGAGGTGGATGAACACC146bpTRAF5RTRevAAACCAAACGCATGTGCTCCMARK2RTForTGGCAAAGACAGCCTAACCA109bpMARK2RTRevGGAGGCCGACATGGATTTCTCASP9RTForCTCAGACCGGAAACACCCAG109bpCASP9RTRevTGCTCAGGACGTAAGCCAAAASC-mmlRTForGCTGGTCAGCTTCTACCTGGA124bpASC-mmlRTRevTACAAAGTGCAGGCCCTGGTGCASP1-mmlForTGCCGTGGTGGTGAGTATTT134bpCASP1-mmlRevTCCACATCACAGGAACAAGCAIL-1β-mmlForTACGATCACTGCACTGCACA118bpIL-1β-mmlRevAACACCACTTGTTGCTCCAGANLRP3-mmlForCAGGTGTTGGAATTAGACAAC111bpNLRP3-mmlRevGTCATTGTTGCCTAGGCTCANFIARTForTGTGCCTGGTATCCTGAGTT160bpNFIARTRevTGACCTGGTGGGTGTCTTCCNFIBRTForTGAGCATTTGAGGCTTGTCT180bpNFIBRTRevCCTTTCGCTCTTCTCGCTACDICER1RTForGCGGTCTGCCCTGGTCAACA363bpDICER1RTRevTCTCGCACAGGGGAACGGGGIRF7RTForTACCATCTACCTGGGCTTCG133bpIRF7RTRevGGAAGACACACCCTCACGTTIFNAR1RTForACCATTTCGCAAAGCTCAAA113bpIFNAR1RTRevCCAAAGCCCACATGACACTA5.1.2.3靶基因报告载体构建针对靶基因3’-UTR包含与种子序列结合的区域设计并合成全长为57nt的寡核苷酸，其中5’端和3’端分别是XhoI和NotI酶切位点的粘性末端，中间部分是生物信息学软件预测出来的包含mml-miR-382-5p结合位点（7个核苷酸）以及突变的结合位点的3’-UTR片段。同时，设计并合成全长为82nt的寡核苷酸，其中5’端和3’端分别是EcoRI和XhoI酶切位点的粘性末端，中间部分是包含mml-miR-382-5p种子序列的前体序列以及突变种子序列中4个核苷酸的前体序列。使用退火缓冲液将寡核苷酸引物稀释至 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应67100μM，上下游引物各吸取10μL配制成退火反应液，进行PCR反应：95℃变性2min，94℃，90s，之后每90s下降1℃直到25℃暂停。分别将pcDNA6.2用EcoRI和XhoI以及psi-CHECK-2用XhoI和NotI进行双酶切，反应体系（50μL）如下：组分加入量质粒DNA2μg限制性内切酶12μL限制性内切酶22μL10×缓冲液5μL双蒸水至50μL37℃水浴中酶切2-3h，1%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收载体片段，之后与上述含有相同酶切位点的目的片段进行连接反应，16℃过夜后进行转化以及后续鉴定工作，测序正确后进行双荧光素酶报告实验。5.1.2.4双荧光素酶报告基因检测实验按常规方法传代HEK293T细胞至24孔板中，待细胞融合度达到90%左右，按照Lipofectamine2000说明书进行转染，DNA含量与转染试剂体积比为1:2.5。将构建好的重组质粒psiCHECK-2-3’-UTR（野生型）或psiCHECK-2-3’-UTRMut（突变型）分别与pcDNA6.2-miR-382-5p（野生型）或pcDNA6.2-miR-382-5pMut（突变型）混合，每个质粒加入0.4μg，混合均匀并静置10-20min后，逐滴轻柔地加入细胞孔中，36h后检测荧光素酶值。按照Dual-LuciferaseReporterAssaySystem试剂盒说明书，配制PLB、LARII、Stop&GOL试剂，室温恢复后使用。弃去24孔板中的细胞上清液，向细胞孔中加入100μLPLB裂解液进行裂解，室温缓慢摇晃10-15min，收集细胞裂解液瞬时离心后，吸取20μL加入到侧壁不透光的96孔白板中，每孔加入25μLLARII混合，上机读取萤火虫荧光素酶值（Fireflylucifersae），之后加入25μLStop&GOL混合，读取海肾荧光素酶值（Renillalucifersae）。以萤火虫荧光素酶值为内参，根据海肾荧光素酶值与萤火虫荧光素酶值的比值得到每组相对荧光素酶活性的数据。5.1.2.5鉴定miRNAs对NLRP3炎症小体介导的IL-1β表达的影响取制备好的在24孔板中的PAMs细胞，按照HiPerFectTransfectionReagent转染试剂说明书进行miRNAmimics的转染，24h后加入LPS（1μg/mL），刺激12h后加入Nigericin（10μM），共同刺激12h后收集细胞上清液并用ELISA试剂盒检测IL-1β蛋白的表达水平，同时，将收集的细胞用qRT-PCR的方法检测NLRP3炎症小体相关基因的表达水平。5.1.2.6数据处理及分析 68猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究每个实验数据来自至少三次独立重复实验，数据统计分析采用T检验法或单因素方差分析，当P<0.05时，数据之间具有显著性差异，用“*”表示。本文所有图表均使用GraphPadPrism6.0软件完成。5.2结果5.2.1miR-382-5p和miR-541-3p可以促进PRRSV的复制为了从7条miRNAs中筛选鉴定出对PRRSV复制有影响的miRNAs，本实验将这些miRNAmimics转染到MARC-145细胞中，并用PRRSVBJ-4株感染细胞，之后用qRT-PCR检测ORF7和nsp1的mRNA表达水平，并用TCID50检测病毒的毒力是否有变化。实验结果显示，miR-379-5p、miR-382-5p和miR-541-3p可以使PRRSV的ORF7和nsp1的的mRNA表达水平升高，而TCID50结果显示只有miR-382-5p和miR-541-3p可以促进病毒的感染。见图5-1A-F。为了更加确定上述结果，本实验将miR-382-5p的inhibitor转染到MARC-145细胞中，发现病毒的复制受到抑制，进而确定了miR-382-5p的调控作用。见图5-1G-H。实验结果说明，不是所有测序得到在机体中变化显著的miRNAs都可以对病毒的复制产生影响，而且，miR-382-5p和miR-541-3p的mimics可以促进PRRSV的复制。图5-1miR-382-5p和miR-541-3p可以促进PRRSV的复制A-C：MARC-145细胞转染7条miRNAmimics（100nM）和一条对照，24h后感染BJ-4（MOI：1.0），48h后收集病毒液，qRT-PCR检测PRRSVORF7和nsp1的表达量，同时，TCID50检测PRRSV的毒力变化；D-F：MARC-145细胞转染miR-382-5pmimic（50nM和100nM），24h后感染BJ-4（MOI： 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应691.0），48h后收集病毒液，qRT-PCR检测PRRSVORF7和nsp1的表达量，同时，TCID50检测PRRSV的毒力变化；G-H：MARC-145细胞转染miR-382-5pinhibitor（50nM和100nM），24h后感染BJ-4（MOI：1.0），48h后收集病毒液，qRT-PCR检测PRRSVORF7的表达量，同时，TCID50检测PRRSV的毒力变化Fig.5-1miR-382-5pandmiR-541-3pcouldpromotePRRSVreplicationA-C:MARC-145cellsweretransfectedwith7miRNAmimicsandcontrol,24hlater,thecellswereinfectedwithBJ-4(MOI:1.0),48hlater,viruswereharvestedandanalyzedbyqRT-PCRforORF7andnsp1mRNAexpressionandbyTCID50forvirusvirulence;D-F:MARC-145cellsweretransfectedwithmiR-382-5pmimic(50nMand100nM),24hlater,thecellswereinfectedwithBJ-4(MOI:1.0),48hlater,viruswereharvestedandanalyzedbyqRT-PCRforORF7andnsp1mRNAandbyTCID50forvirusvirulence;G-H:MARC-145cellsweretransfectedwithmiR-382-5pinhibitor(50nMand100nM),24hlater,thecellswereinfectedwithBJ-4(MOI:1.0),48hlater,viruswereharvestedandanalyzedbyqRT-PCRforORF7mRNAandbyTCID50forvirusvirulence5.2.2miR-382-5p候选靶基因的筛选通过在线生物信息学软件预测和文献查阅的方法，初步筛选到一批候选靶基因，再根据这些基因的功能（如与天然免疫、抗病毒、炎症等相关）得到22个候选靶基因。根据这些候选靶基因的序列设计并合成跨内含子的定量引物，在miR-382-5p转染MARC-145细胞48h后，用qRT-PCR的方法检测各个基因的mRNA表达水平，验证在MARC-145细胞内miR-382-5p是否调节这些候选靶基因的表达。实验结果显示，在过表达miR-382-5p的MARC-145细胞中，可以显著降低候选靶基因IFNAR1、ASC、CASP3和DicermRNA的表达（p<0.05），抑制率在20%-80%，表明这些基因很有可能是miR-382-5p调控的宿主靶基因。见图5-2。 70猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究图5-2miR-382-5p候选靶基因的筛选MARC-145细胞转染miR-382-5p或对照，48h后用qRT-PCR的方法检测各个候选靶基因的表达水平Fig.5-2ScreeningcandidatetargetgenesofmiR-382-5pMARC-145cellsweretransfectedwithmiR-382-5porcontrol.48hlater,thecellswerecollectedandanalyzedforcandidatetargetgenesbyqRT-PCR5.2.3miR-382-5p通过直接靶向IFNAR1来降低其表达I型干扰素是宿主感染病毒后产生的抗病毒糖蛋白，而大多数细胞类型都会表达I型干扰素的受体（IFNAR1和IFNAR2），所以，I型干扰素在机体抗病毒的过程中发挥着重要作用。本实验首先针对IFNAR1进行双荧光素酶报告基因检测，验证miR-382-5p对其表达的下调是否直接作用于该靶基因预测的结合位点。本实验成功构建了包含野生型IFNAR13’UTR序列的双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-IFNAR1-3’UTR以及包含miR-382-5p种子序列的前体miRNA序列重组质粒pcDNA6.2-miR-382-5p，另外，分别将IFNAR13’UTR中预测的种子结合位点全部突变得到psiCHECK-2-IFNAR1-3’UTRMut以及突变miR-382-5p的种子序列中的前4个核 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应71苷酸（共7个核苷酸）得到pcDNA6.2-miR-382-5pMut。然后，将报告质粒psiCHECK-2-IFNAR1-3’UTR或psiCHECK-2-IFNAR1-3’UTRMut分别与pcDNA6.2-miR-382-5p、pcDNA6.2-miR-382-5pMut或pcDNA6.2-miR-neg共转染HEK293T细胞，检测萤火虫和海肾荧光素酶值。根据psiCHECK-2质粒图谱及说明书，靶基因的3’UTR插入在海肾荧光素酶基因的下游，如果miRNAs与其结合则会影响到海肾荧光素酶基因的表达，所以，将萤火虫荧光素酶作为内参，结果以每组实验所得到的相对荧光素酶活性（海肾荧光素酶值/萤火虫荧光素酶）与对照组进行比较。实验结果显示，IFNAR1受到miR-382-5p的显著抑制，荧光素酶活性下降20%-30%，而突变实验结果显示，突变后的miR-382-5p不能抑制IFNAR13’UTR的荧光素酶活性，而且，突变后的IFNAR13’UTR荧光素酶活性也不能被miR-382-5p所抑制。上述结果表明miR-382-5p与其靶基因IFNAR13’UTR的相互结合具有特异性，可以通过直接靶向IFNAR1来下调其表达。见图5-3和5-4。图5-3双荧光素酶报告载体Fig.5-3psiCHECK-2vector图5-4靶基因IFNAR1的双荧光素酶实验验证miR-382-5p在IFNAR1mRNA3’UTR区域的预测结合位点由粗体字表示，下划线表示突变的核苷酸，右侧显示双荧光素酶实验结果Fig.5-4ExaminationoftargetgeneIFNAR1BoldindicatsthethepredictedbindingsiteformiR-382-5pinthe3’UTRofIFNAR1mRNA,andtherightshowsdual-luciferasereporterassayresult 72猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究5.2.4PRRSV上调MARC-145细胞中miR-373的表达为了确定本实验室前期通过高通量测序发现的miR-373在PRRSV感染MARC-145细胞后被上调表达的结果，将PRRSVBJ-4株以不同剂量和不同时间点来感染MARC-145细胞，用qRT-PCR的方法检测miR-373的表达情况。结果显示，miR-373在PRRSV感染后呈剂量和时间依赖的方式显著上调。见图5-5。图5-5PRRSV上调MRC-145细胞中miR-373的表达A：BJ-4不同MOI（0.01、0.1、1.0、10）感染MARC-145细胞后，miR-373的表达情况；B：BJ-4不同时间点（6h、12h、18h、24h、36h、48h）感染MARC-145细胞后，miR-373的表达情况Fig.5-5PRRSVup-regulatedmiR-373expressioninMARC-145cellsA:MARC-145cellswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferentMOI(0.01,0.1,1.0,10),miR-373expressionwasdetectedbyqRT-PCR;B:MARC-145cellswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferenttimes(6h,12h,18h,24h,36h,48h),miR-373expressionwasdetectedbyqRT-PCR5.2.5miR-373可以促进NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达为了从上述筛选出来的miRNAs中检验其是否对于NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达有影响，本实验将miR-382-5p和miR-541-3p以及本实验室前期鉴定过的可以促进PRRSV增殖的miR-373转染到PAMs细胞中，LPS和Nigericin共同刺激后，ELISA检测细胞上清液中IL-1β的分泌情况，qRT-PCR检测NLRP3炎症小体相关基因的表达情况。ELISA结果显示，miR-373可以显著地促进IL-1β的分泌，miR-382-5p和miR-541-3p对IL-1β的表达没有影响。见图5-6。qRT-PCR结果显示，miR-373可以显著增加NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA的表达，特别是procaspase-1的mRNA水平可以升高20-30倍。而miR-382-5p和miR-541-3p可以显著抑制ASC和pro-IL-1βmRNA的表达。见图5-7。这些结果表明，miR-373可以有效地促进NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达，促进炎症反应的发生。 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应73图5-6miR-373可以促进由LPS和Nigericin共同刺激诱导的IL-1β的分泌PAMs转染miR-373、miR-382-5p和miR-541-3p，24h后加入LPS(1μg/mL)，刺激12h后加入nigericin(10μM)，刺激12h后收集细胞上清液并用ELISA检测IL-1β的表达量Fig.5-6miR-373canpromoteLPSplusnigericininducedsecretionofIL-1βPAMsweretransfectedwithmiR-373,miR-382-5pandmiR-541-3p,24hlater,thecellswerestimulatedwithLPS(1μg/mL),and12hlater,thecellcultureswereaddedwithnigericin(10μM).Then12hlater,thecell-freesupernatantswerecollectedandanalyzedforIL-1βbyELISA图5-7miR-373可以促进由LPS和Nigericin共同刺激诱导的NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA的表达 74猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究PAMs转染miR-373、miR-382-5p和miR-541-3p，24h后加入LPS(1μg/mL)，刺激12h后加入nigericin(10μM)，刺激12h后收集细胞并用qRT-PCR的方法检测NLRP3炎症小体相关基因的表达水平Fig.5-7miR-373canpromoteLPSplusnigericininducedexpressionofNLRP3,procaspase-1,andpro-IL-1βmRNAPAMsweretransfectedwithmiR-373,miR-382-5pandmiR-541-3p,24hlater,thecellswerestimulatedwithLPS(1μg/mL),and12hlater,thecellcultureswereaddedwithnigericin(10μM).Then12hlater,thecellswerecollectedandanalyzedforNLRP3relatedgenesbyqRT-PCR5.2.6PRRSV下调TGFBR2在PAMs上的表达转化生长因子-β受体2（transforminggrowthfactor-βreceptor2,TGFBR2）作为miR-373的靶基因(Qiuetal.2015)，在免疫抑制特别是抑制炎症反应的发生方面发挥着重要作用(Yangetal.2015)。因此，为了验证TGFBR2在PRRSV感染PAMs细胞后的表达情况，本实验以不同剂量PRRSVBJ-4株感染PAMs细胞，24h后用qRT-PCR的方法检测TGFBR2mRNA的表达水平。结果显示，TGFBR2在PRRSV感染后呈剂量依赖的方式显著下调。见图5-8。综合上述结果，PRRSV感染后上调miR-373的表达并且促进NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌，但是下调免疫抑制性受体TGFBR2的表达，提示miR-373促进炎症反应的发生可能是通过下调TGFBR2的表达实现的，但其在调控炎症反应发生方面的作用机制还需要进一步研究。图5-8PRRSV下调TGFBR2在PAMs上的表达BJ-4不同MOI（0.01、0.1、1.0）感染PAMs细胞，24h后用qRT-PCR的方法检测TGFBR2的表达情况Fig.5-8PRRSVdown-regulatedTGFBR2expressioninPAMsPAMswereinfectedwiththePRRSVstrainBJ-4atdifferentMOI(0.01,0.1,1.0),24hlater,TGFBR2expressionwasdetectedbyqRT-PCR 第五章MiRNAs调控PRRSV引起的炎症反应755.3讨论研究表明，在病毒感染宿主细胞的过程中，宿主细胞的miRNAs可以靶向与病毒复制有关的宿主基因或病毒自身的基因组RNA，在几乎所有细胞的基因调控途径上发挥着关键作用(Chenetal.2011;Gottweinetal.2008;Huangetal.2007;Lecellieretal.2005;Pedersenetal.2007;Songetal.2010b;Vallietal.2012)。相反地，病毒基因组的miRNAs则会抵抗这种调节，下调天然免疫系统中的关键因子，包括促进细胞凋亡和招募免疫系统效应细胞的蛋白质。另一方面，病毒也进化出能够下调或者上调特异性的细胞miRNAs的能力从而促进自身的复制(Cullen2013)。最近一项研究通过对PRRSV感染后的PAMs细胞进行深度测序发现，在感染后48h共有40个miRNAs发生了显著的差异化表达。对其中6条变化较显著的miRNAs进行靶基因验证实验，结果显示这些miRNAs和免疫信号通路、细胞因子和转录因子的产生相关(Jetal.2013)。本实验室前期研究结果显示，在对PRRSV感染后的MARC-145细胞进行深度测序后，发现一些上调和下调表达较显著的miRNAs，对其中一些miRNAs在PRRSV复制过程中的影响进行验证并发现miR-373可以显著促进PRRSV的复制。本实验则对其中的7条miRNAs（5条显著上调、2条显著下调）进行深入研究，发现miR-379-5p、miR-382-5p和miR-541-3p可以促进PRRSVmRNA水平的增加，而miR-382-5p和miR-541-3p也可以促进PRRSV毒力的升高。Xiao等人研究发现miR-24-3p可以通过抑制细胞中血红素加氧酶的表达来促进PRRSV的复制(Xiaoetal.2015)。随后，本实验对miR-382-5p和miR-541-3p的靶基因进行生物学软件预测，并结合文献报道和基因功能在2-3个软件预测结果里面筛选出交叉重叠的靶基因。通过过表达和双荧光素酶报告基因检测实验发现IFNAR1是miR-382-5p的靶基因，并且miR-382-5p通过直接靶向IFNAR1下调其表达。IFNAR1在机体抗病毒的过程中发挥着重要作用，I型干扰素与其结合并诱发一系列级联反应，最终导致核糖核酸酶L、2‘,5‘-寡腺苷酸合成酶、双链RNA激活的蛋白激酶、粘病毒抗性蛋白等很多抗病毒蛋白的产生(Sadleretal.2008)。本实验通过在MARC-145细胞中过表达miR-382-5p，发现miR-382-5p可能通过下调IFNAR1的表达而引起PRRSV复制的增加，然而，根据其在不同物种间的保守性，仍然需要在PAMs细胞中验证miR-382-5p的调控作用。细胞因子是一类广泛的小分子量蛋白质（约5-20kDa），在细胞信号通路中的作用非常重要(Comminsetal.2010)，它们由细胞分泌并且会影响到其它细胞和自身(Ghoreschietal.2009)。这些细胞因子在机体的整个动态平衡中发挥着重要作用，会影响到一系列的生物物理反应(McInnesetal.2007)。这个复杂的调控网络平衡着促炎和抑炎效应，一旦促炎和抑炎细胞因子发生不平衡或者不受控制之后就会导致炎症的发生(Akdis2012;Chizzolinietal.2009;McInnesetal.2007)。细胞因子，例如IL-1、IL-4、IL-6、IL-8和IL-10等的表达受到很多水平上的调节，包括基因转录水平、mRNA翻译水平、 76猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究mRNA的降解等(Stoecklinetal.2006)。细胞因子和miRNA之间的作用是相互的，不仅miRNAs可以靶向细胞因子的mRNA从而调控细胞因子的表达，同样的，细胞因子信号转导也可以影响miRNA的表达(Andersen2013)。比如：IL-1β和TNF-α可以在不同的细胞类型中刺激miR-146a和miR-155的表达，而miR-23b则可以被IL-17下调(Huangetal.2014b;Zhuetal.2012)。最近一项研究报道显示，在PRRSV感染PAMs细胞后，IL-1α和IL-1β基因表达的升高可能是由于miR-24的下调引起的，这也可能和PRRSV感染后NK-κB的激活有关(Jetal.2013)。另外，miR-223、miR-451和miR-486则可以促进脾细胞中LPS刺激引起的炎症反应(Singhetal.2013)。另有报道表明，免疫抑制性受体TGFBR2可以作为miR-373的靶基因参与机体炎症反应的调控(Qiuetal.2015;Yangetal.2015)。为了验证本研究中筛选出来的miRNAs是否调控机体的炎症反应过程，本实验在LPS和Nigericin共同刺激PAMs细胞后，利用miRNAmimics过表达miR-373、miR-382-5p和miR-541-3p，结果显示，miR-373可以显著增加IL-1β的分泌和NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA的水平，促进炎症反应的发生。另外，通过PRRSV感染PAMs和MARC-145细胞后，发现TGFBR2的表达被显著下调，而miR-373的表达被显著上调，这些结果表明PRRSV在感染早期激活NLRP3炎症小体并促进炎症反应的发生可能是通过下调miR-373的靶基因TGFBR2的表达实现的。而在感染晚期炎症反应被抑制则可能是通过PRRSV编码的非结构蛋白nsp11和nsp1α来实现的。本研究中得到的这些结果也许可以解释在第一部分实验中发现的PRRSV感染早期促进炎症反应而在感染晚期抑制炎症反应的现象，提示PRRSV非结构蛋白以及宿主miRNAs可能在调控机体炎症反应方面发挥着重要作用，但是其具体机制还需要更深入的探索。5.4小结本章实验通过对7条miRNAs的筛选，鉴定出miR-382-5p和miR-541-3p可以促进PRRSV的增殖，然后利用生物信息学和qRT-PCR的方法，在过表达miR-382-5p后筛选鉴定其作用的靶基因，并利用双荧光素酶报告基因实验确认IFNAR1为其直接靶向的宿主基因。在LPS和Nigericin共刺激PAMs实验中，发现了miR-373可以显著促进IL-1β的分泌，并且可以增加NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA的表达，促进炎症反应的发生。另外，PRRSV感染可以显著上调miR-373并下调其靶基因TGFBR2的表达，促进感染早期炎症反应的发生，但其具体的调控机制还需要进一步探索。 全文总结77全文总结1.通过对PRRSV感染PAMs后NLRP3炎症小体动态变化情况的分析，发现炎症小体相关基因NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平和细胞上清中的IL-1β在PRRSV感染早期都呈现上升趋势，并分别在24h和48h达到峰值，但是在感染晚期NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β的mRNA水平急剧下降，并与空白对照组水平相当，IL-1β的蛋白水平在之后的阶段也呈现出下降趋势。而不同剂量PRRSV感染PAMs的实验发现，PRRSV上调的procaspase-1、pro-IL-1β的mRNA水平和IL-1β的蛋白水平呈明显的剂量依赖效应。这些实验结果表明PRRSV通过上调NLRP3信号通路蛋白而促进早期炎症反应，但在感染晚期，PRRSV可能通过某种机制而抑制了NLRP3介导的炎症反应。2.NLRP3特异性抑制剂Glyburide以及针对NLRP3和ASC的特异性siRNAs都能够显著抑制由PRRSV诱导的IL-1β的分泌，表明PRRSV诱导IL-1β的分泌依赖于NLRP3炎症小体信号途径。3.将PRRSV非结构蛋白nsp11和nsp1α及其突变体转染PAMs细胞，发现nsp11和nsp1α都能够抑制由LPS引起的pro-IL-1βmRNA水平的升高以及由LPS和Nigericin引起的IL-1β蛋白水平的升高，并且nsp11的核酸内切酶活性以及nsp1α的N端锌指结构对于其抑制作用是必需的。在已重构NLRP3炎症小体模型的HEK293T细胞上也得到与PAMs细胞上相一致的实验结果，进一步确定nsp11和nsp1α对NLRP3炎症小体介导的IL-1β表达及其对炎症反应发生的抑制作用。4.MiR-382-5p和miR-541-3p可以促进PRRSV在MARC-145细胞上的复制。而在LPS和Nigericin共同刺激的PAMs细胞上过表达miR-373，可以显著增加NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌以及促进NLRP3、procaspase-1和pro-IL-1βmRNA水平的升高，并且，PRRSV感染PAMs细胞后可以显著下调miR-373的靶基因TGFBR2的表达，从而促进感染早期炎症反应的发生。这些结果为更深入了解PRRSV调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制提供了研究基础。 78猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究本论文创新点1.PRRSV感染可以诱导NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌，并通过上调NLRP3信号通路蛋白而促进早期炎症反应，但在感染晚期，PRRSV可能通过某种机制而抑制了NLRP3介导的炎症反应。2.PRRSVnsp11和nsp1α可以抑制NLRP3炎症小体介导的IL-1β的表达，从而抑制炎症反应的发生，并且nsp11的核酸内切酶活性以及nsp1α的N端锌指结构对于其抑制作用是必需的。3.PRRSV感染可以上调miR-373的表达，并且下调miR-373的靶基因TGFBR2的表达。而miR-373可以增加NLRP3炎症小体介导的IL-1β的分泌，促进病毒感染早期炎症反应的发生。 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缩略词101缩略词缩写英文名称中文名称aaAminoacid氨基酸AIM2Absentinmelanoma2黑色素瘤缺乏2AP-1Activatorprotein-1激活蛋白-1ASCApoptosis-associatedspeck-likeprotein凋亡相关斑点样蛋白containingCARDbpBasepair碱基对CARDCaspaseactivationandrecruitmentdomain胱天蛋白酶招募结构域cDNAComplementaryDNA互补DNADAMPDanger-associatedmolecularpattern危险相关分子模式ddH2ODoubledistilledH2O双蒸水DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DLRADualluciferasereporterassay双荧光素酶报告实验DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜dNTPDeoxy-ribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附实验FBSFetalbovineserum胎牛血清gGram克GPGlycoprotein糖蛋白hHour小时HRPHorseReddishPeroxidase辣根过氧化物酶IFNInterferon干扰素ILInterleukin白细胞介素IL-1RIL-1receptorIL-1受体IPS-1Interferon-βpromoterstimulator1β干扰素启动刺激因子1IRAKInterleukin-1receptoractivatedproteinkinaseIL-1受体活化蛋白激酶IRF3Interferonregulationfactor3干扰素调节因子3ISGsInterferon-stimulatedgenes干扰素刺激基因kDaKilodalton千道尔顿LLiter升LARIILuciferaseassaybufferII荧光素酶缓冲液IILBLuria-BertaniLB培养基MAPKMitogen-activatedproteinkinase丝裂原活化蛋白激酶mgMilligram毫克minMinute分钟 102猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究mLMilliliter毫升MOIMultiplicityofinfection病毒感染复数mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸MyD88Myeloiddifferentiationprimaryresponse髓样分化因子88protein88NF-κBNuclearfactor-kappaB核因子kappaBNLRP3Nod-likereceptorprotein3Nod样受体蛋白3NONitricoxide一氧化氮nspNonstructuralprotein非结构蛋白ntNucleicacid核苷酸ODOpticaldensity光密度ORFOpenreadingframe开放阅读框PAMPorcinealveolarmacrophage猪肺泡巨噬细胞PAMPPathogen-associatedmolecularpattern病原体相关分子模式PBSPhosphatebufferdsaline磷酸盐缓冲液PRRSPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征PRRsPatternrecognitionreceptors模式识别受体PRRSVPorcinereproductiveandrespiratorysyndrome猪繁殖与呼吸综合征病virus毒PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯PYDPyrindomain热蛋白结构域r/minRotationperminute每分钟转速RIG-IRetinoicacid-induciblegeneI视黄酸诱导基因IROSReactiveoxygenspecies活性氧RT-PCRReversetranscription-polymerasechain反转录聚合酶链式反应reactionSDS-PAGESodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegel十二烷基硫酸钠聚丙烯electrophoresis酰胺凝胶电泳secSecond秒sgmRNASubgenomicmRNA亚基因组mRNASnSialoadhesin唾液酸粘附素TCID50Mediantissuecultureinfectivedose半数组织感染量TEMEDTetramethylethylenediamine四甲基乙二胺TGFBR2Transforminggrowthfactor-βreceptor2转化生长因子-β受体2TNFTumornecrosisfactor肿瘤坏死因子TLRTolllikereceptorToll样受体UTRUntranslatedregion非编码区μLMicroliter微升 致谢103致谢面对致谢二字迟迟不肯下笔，只因内心需要感谢的人很多，满满的感激之情不知从何说起。三年半的博士研究生生涯即将结束，在这美好的青春年华里，不仅仅是岁月留下的痕迹，更多的是对自己心智的磨练；不仅仅是实验技能的提高，更多的是学术思想的成熟；不仅仅是身体素质的提升，更多的是承受力和自信心的增加。在郑州的三年时光里，少了些硕士期间的稚嫩与感性，多了些男人的成熟与执着。每个人的生命轨迹中都会进进出出许多人，在我人生如此重要的阶段中，真心感谢所有和我一起走过的人们。首先要感谢我的恩师张改平院士，“忙”似乎是您的代名词，在成为河南农业大学的校长后，您更忙了。但是，工作再忙您仍心系科研，时刻关注我们的实验结果和实验室的发展，无论白天黑夜，没有工作日和周末之分，您以自己的实际行动诠释着什么叫做以满腔的热血投入到工作当中，您始终是我们学习的榜样。每次与您的谈话都让我们感受到作为一个中国人，我们需要心怀祖国与人民，做好自己的工作，做出优秀的成果是我们的责任与义务。您在科学研究的道路上不懈追求、大胆创新，您广博活跃的科学理念，严谨周密的学术思想始终引领着我们在科学研究的道路上砥砺前行。您为我们提供了优秀的实验平台和实验环境，让我们可以专心实验，心无旁骛，这些学生都铭记在心。在此论文完成之际，由衷的感谢您默默的付出与奉献，在以后的学习和工作生活中，我会时刻提醒自己，以您为榜样，努力工作。感谢周恩民院长给与我继续求学的机会，让我踏入了科学的殿堂，完成了博士研究生阶段的学习。感谢您对于我的谆谆教导，很珍惜每一次与您的谈话，每次谈话都会使我受益匪浅。您孜孜不倦的工作作风，认真负责的工作态度，在我们面临困难时为我们指点迷津、提供帮助，都让学生看到了以后需要努力的方向，为了不辜负您的一片期望，唯有以更加热情的工作态度和更加优秀的科研成果加以回报。感谢我的指导老师史西保博士，三年来您对我的耐心指导、无私帮助和真诚鼓励都使我在学习的过程中各方面得到很大的提高。无论从实验设计、实验问题的解决、实验技能、文献的追踪与阅读、论文的写作与修改和PPT的制作与汇报等各个细致的方面，您都不厌其烦地给予了我指导和帮助，希望我成长为优秀的科研工作者，在毕业之后能够独立面对和从容处理各种实验工作。您对科学前沿的把握、实验结果的敏锐程度以及大量扎实的基础理论知识都让我感到佩服与惊讶，向您学习并真心感谢这三年来您的帮助，我很幸运也很珍惜这份缘分。感谢河南省动物免疫学重点实验室提供的良好平台以及实验室领导邓瑞广主任，感谢实验室老师乔松林、郭军庆、罗俊、邢广旭、程娜、赵东、杨继飞、胡晓飞、金前跃、杨素珍、陈鑫鑫、李睿、郅玉宝、卢清侠、郝慧芳、王方雨、柴书军、刘运超、李青梅、王丽、藤蔓、杨艳艳、李学伍、何萍、王建中等在实验中给予的热情帮助与无私指导。 104猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究感谢课题小组成员陈静、司朝朝和常咏哲对于实验材料、实验方法和实验结果的分析等方面提供的无私帮助，因为有了你们的协助才使得我的实验能够顺利开展下去，谢谢你们。感谢实验室的其他成员万博、鲍登克、李鹏、迟佳琦、宋春美、陈玉梅、王耀、王瑞宁、王寅彪、李任峰、赵朴、殷萌琪、李华玮、谢莎、胡博、宿靖伟、刘肖、党露、刘畅、禹乐乐、侯婕、高月、谷雨、丁培阳、王攀、杨琪、王林建在我的实验和生活过程中都增添了几分色彩，让这枯燥无味的实验室生活充满了欢乐与生机，很高兴能与你们一同走过这段岁月，谢谢你们。感谢西北农林科技大学动物医学院的老师肖书奇、赵钦、穆杨、王承宝以及院办的各位老师在学校学习过程中给予的指导、帮助和支持。感谢师兄高继明、张冲、王向鹏、黄柏成提供的无私帮助与照顾。感谢刘宝元在西农为我提供了很多方面的帮助与支持，让我在郑州能够安心从事自己的实验工作，从硕士到博士这么多年的情谊是无价的，谢谢你。感谢艾文娜、曹志、于童、李治军、李娜、郝华芳、于颖、龚雨鑫让我在学校的生活变得丰富多彩，让我得到那么多快乐的回忆，谢谢你们。感谢成长路上一直陪伴我的发小赵阳和王继诚，二十多年的兄弟情谊我相信是谁都买不来的，谢谢你们一直以来的关心和支持，让一直漂泊在外求学的我知道，其实，我不是一个人在战斗。当我硕士毕业的时候，你们相继步入了婚姻的殿堂，当我即将博士毕业的时候，你们的孩子也就是我的侄儿也已经可以喊爸爸妈妈了。看着你们幸福美满的婚姻家庭生活，我其实从内心里替你们感到开心与满足，相信我们的生活都会越来越好，没有什么困难阻挡得了内心充满爱的人，且行且珍惜，谢谢你们。感谢我的父母及家人，大爱不言谢，从来没有在你们面前表示过感谢，但并不代表了内心里没有这份沉甸甸的感激之情。父母养育我长大成人，作为我成长路上坚强的后盾，并且，这么多年来一直支持我所做的任何选择，一直鼓励我继续求学完成学业，不让我分心。在我即将博士毕业之际，虽然岁月催人老，但是你们坚强乐观的心态让你们永葆青春，也让我看到了我的爸爸妈妈还很年轻，谢谢你们，我会更加努力的工作来回报你们，同时，也对于我常年在外求学，没有一直陪在你们身边表示深深的歉意，谢谢你们的理解与包容，你们的健康是我最大的心愿。再次感谢所有帮助和关心过我的人们，包括那些没有提及到的你们，真心地谢谢你们，好人一生平安，希望有情有义的我们一切顺利，健康快乐。王超2015年11月于郑州 作者简介105作者简介王超，男，汉族，中共党员，1985年11月出生于河南省鹤壁市。2005年被青岛农业大学动物医学院动物医学专业录取，2009年本科毕业，取得农学学士学位。同年考入甘肃农业大学动物医学院预防兽医学专业，攻读硕士学位，并于2010年进入中国农业科学院上海兽医研究所进行联合培养，2012年获得农学硕士学位。同年考入西北农林科技大学动物医学院预防兽医学专业，攻读博士学位，并于河南省动物免疫学重点实验室完成博士学位论文，师从张改平院士，博士期间主要从事猪繁殖与呼吸综合征病毒调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究。博士期间发表的论文以及获奖情况如下：1.Wang,C.,ShiX.,ZhangX.,WangL.,DengR.,ZhangG..Theendoribonucleaseactivityessentialforthenon-structuralprotein11ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)toinhibitNLRP3inflammasome-meditatedIL-1βinduction.DNAandCellBiology.2015,34(12):1-8.2.王超,史西保,王丽,陈静,司朝朝,王爱萍,邓瑞广,张改平.猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α(nsp1α)的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需.畜牧兽医学报.2015,46(11):2032-2039.3.ShiX.,ChangY.,ZhangX.,WangL.,LiC.,JiangK.,ChenJ.,WangC.,DengR.,FanJ.,ZhangG..SmallinterferingRNAtargetingnonstructuralprotein1α(nsp1α)ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)canreducethereplicationofPRRSVinMARC-145cells.ResearchinVeterinaryScience.2015,99:215-217.4.司朝朝,史西保,李恭贺,乔松林,王丽,李青梅,王超,陈静,王寅彪,张改平.猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测.河南农业科学.2015,44(1):126-129.5.Shi,X.,Li,Q.,Chang,Y.,Chen,J.,Wang,C.,Zhao,P.,Yang,J.,Yang,S.,Zhang,G..Thenonstructuralprotein1papain-likecysteineproteasewasnotnecessaryforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusnonstructuralprotein1toinhibitinterferon-betafunction.2013InternationalPRRSSymposiumandPCVAD(PCV2).MAY20-222013,122,BeiJing.6.史西保,常咏哲,王方雨,王丽,乔松林,郭军庆,陈静,王超,张改平.N端锌指结构是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）nsp1α抑制β干扰素转录所必需.2013年全国动物疫病与食品安全博士后学术论坛，(2013.11.6-9),34.河南郑州,(2013).7.史西保,李青梅,常咏哲,陈静,王超,赵朴,杨继飞,张改平.木瓜样蛋白酶活性不是猪 106猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）调控NLRP3介导的炎症反应的分子机制研究繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1抑制β干扰素作用所必需.2013年全国动物疫病与食品安全博士后学术论坛,(2013.11.6-9),35.河南郑州,(2013).获奖情况2015年1月：河南省动物免疫学重点实验室优秀研究生奖学金三等奖；河南省农业科学院篮球联赛三等奖；2015年10月：西北农林科技大学动物医学院“大北农励志奖学金”