《分泌型iga在iga肾病发病中的作用及机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码10459学号或申请号201111440153密级公开博士学位论文分泌型IgA在IgA肾病发病中的作用及机制研究本课题为国家自然科学基金资助项目（编号：81100510/H0509）国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目（编号：2012CB517600）作者姓名：梁艳导师姓名：刘章锁教授学科门类：医学专业名称：内科学（肾脏病学）培养院系：第一附属医院完成时间：2015年3月 AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctorThestudyontheroleandmechanismofsecretoryIgAinthepathogenesisofIgAnephropathyBy:YanLiangSupervisor:Prof.ZhangsuoLiuDepartmentofNephrologyTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMarch2015 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式彳：示明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：碌日期？P日，学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，_可以米用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：“年r月和円 摘要分泌型IgA在IgA肾病发病中的作用及机制研究摘要研究背景：IgA肾病（IgAnephropathy，IgAN）是我国乃至全球最常见的原发性肾小球肾炎，其特征是免疫荧光下见到以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区和/或肾小球毛细血管襻沉积。据2014年最新资料显示，全球IgAN的发病率为2.5人/10万人/每年，约20%-50%的患者20年可进展为终末期肾脏病。但是，IgAN的发病机制仍然不十分清楚。因IgAN患者常在上呼吸道或肠道等粘膜感染后发生肉眼血尿和/或蛋白尿，提示粘膜免疫与IgAN的发病机制密切相关。分泌型IgA（secretoryIgA，SIgA）是参与粘膜免疫最重要的抗体，近年来的研究发现，SIgA在IgAN的发病中可能也起着一定的致病作用。IgAN的病理类型及临床表现具有多样性，是否因为有SIgA的参与？SIgA可以沉积在IgAN患者的系膜区，那么它对系膜细胞具有损伤作用吗？SIgA发挥这些致病损伤作用的机制是什么呢？迄今为止，还未见相关报道。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类具有内源性调控功能的非编码RNA，它通过与靶基因信使RNA（messengerRNA，mRNA）的3’端非编码区（untranslatedregion，UTR）结合，发挥抑制翻译的作用。研究提示，miRNAs在肾脏病中也起了重要的作用。那么SIgA是否通过作用miRNAs来发挥在IgAN中的致病性呢？第一部分IgA肾病患者分泌型IgA在肾组织的沉积以及同临床病理之间的关系目的：检测IgAN患者肾组织中SIgA沉积的比例；分析SIgA与临床及肾脏病理之间的关系。方法：I 摘要选取263名原发性IgAN患者，应用激光共聚焦显微镜观察肾组织SIgA的沉积，并比较有SIgA沉积和无沉积患者的临床及肾脏病理各项指标的不同。结果：1.263名IgAN患者中87名可见到系膜区SIgA的沉积，约占29.28%；2.同系膜区无SIgA沉积的病人相比较，有SIgA沉积的病人具有明显的感染史（P=0.016）及血尿（P=0.024）发生率，临床指标上具有明显低水平的血清胱抑素C（P=0.027）和β2微球蛋白（P=0.018），病理特征上具有更微的肾脏小管间质损伤（P=0.030）和更低的T评分（牛津分型，P=0.026）。结论：粘膜免疫同IgAN密切相关，SIgA参与了IgAN的发病，它在肾组织的沉积与某些的临床肾脏病理指标相联系。第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究目的：检测IgAN患者肾组织中SIgA激活的补体通路来研究SIgA的肾损伤作用，以及比较肾组织经不同补体途径激活的IgAN患者之间的临床病理特征。方法：选取87名原发性IgAN患者，应用激光共聚焦显微镜观察肾组织SIgA以及各补体通路相关蛋白的沉积，探讨SIgA与各补体通路激活的关系，并比较不同补体激活通路的患者临床及肾病理特点之间的差别。结果：1.87名IgAN患者中有22名可见到系膜区SIgA沉积，其中经旁路途径激活的占77.27%，在65名无SIgA沉积的患者中经凝集素途径激活的占72.30%，两组比较无明显差别（P=0.648）；2.同肾组织经凝集素途径激活的患者相比较，经旁路途径激活的64人（73.6%）在临床指标方面具有更低的肾小球滤过率（P=0.043），在肾病理方面II 摘要肾小球硬化比例（P=0.035）、小管间质损伤程度（P=0.030）、C3的免疫荧光强度（P=0.012）以及牛津评分的S（P=0.006）和T评分（P=0.039）均损伤更严重。结论：在IgAN中SIgA具有致病性，可能通过激活旁路途径和凝集素途径造成肾损伤；经旁路途径激活的IgAN患者部分临床和肾病理特征比经凝集素途径激活的患者严重。第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究目的：研究SIgA对人系膜细胞的生物学效应，探讨SIgA在IgAN中的致病作用。方法：运用亲和层析柱提纯IgAN患者及正常人唾液中的SIgA，应用亲和层析柱和分子筛提纯IgAN患者及正常人血中的多聚IgA（polymericIgA，pIgA）；将提纯的SIgA及pIgA分别刺激人系膜细胞，检测细胞的增殖及各种促炎促纤维化因子（IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白）在细胞中mRNA及蛋白水平的表达情况，并相互比较。结果：1.SIgA和pIgA均能使人系膜细胞明显增殖（P<0.05），表达IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白明显增多（mRNA和蛋白水平，P<0.05），并且患者来源的SIgA和pIgA对细胞的上述生物学效应均明显强于正常人来源的刺激作用（P<0.05）；2.经IgAN患者唾液纯化的SIgA对系膜细胞的增殖作用及刺激其分泌IL-6、IL-8和纤维粘连蛋白的作用要明显弱于经IgAN患者血清纯化的pIgA作用（P<0.05）。结论：III 摘要在IgAN中SIgA有致病作用，SIgA具有刺激系膜细胞增殖和释放促炎促纤维化细胞因子的生物学效应，并且SIgA与pIgA对系膜细胞的生物学效应是不完全相同的。第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证目的：筛选与SIgA致病性有关的miRNAs，研究SIgA在IgAN中产生致病性的分子机制。方法：运用AgilenthumanmiRNAs芯片，检测经IgAN患者及正常人SIgA刺激的系膜细胞中的miRNAs，并分析筛选其中差异性表达的miRNAs，应用实时荧光定量PCR分别进行验证。结果：1.通过miRNAs芯片筛选了17个经IgAN患者及正常人的SIgA刺激后细胞内差异表达的miRNAs，其中上调5个、下调12个；2.经实时荧光定量PCR验证芯片筛选结果中的miRNAs，趋势均一致，其中16个表达差异显著（P<0.05），1个差异性不显著（P>0.05）。结论：SIgA在IgAN发挥致病性的机制中，miRNAs参与其中。第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制目的：预测和验证了miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因，进一步探讨SIgA在IgAN中产生致病性的分子机制。方法：IV 摘要通过生物信息学方法对miRNAs芯片筛选结果中的miR-16-2-3p和miR-100-3p进行靶基因预测，建立融合靶基因3‘UTR的荧光素酶报告基因载体，通过双报告荧光素酶基因检测方法确定miR-16-2-3p和miR-100-3p的靶基因；应用实时荧光定量PCR和Westernblot研究miR-16-2-3p和miR-100-3p对其靶基因的内源性调控作用。结果：1.成功构建了能够过表达miR-16-2-3p和miR-100-3p的报告基因载体；2.荧光素酶双报告基因检测显示，miR-16-2-3p和miR-100-3p的复制物可以分别与报告基因载体的IL-6和IL-83’UTR野生序列结合，使载体的荧光素酶活性降低，而IL-6和IL-83’UTR突变序列不能产生这样的作用（P<0.05）；3.MiR-16-2-3p过表达可以抑制SIgA刺激系膜细胞中分泌IL-6蛋白过多的情况，但不影响IL-6mRNA的水平（P>0.05），同样miR-100-3p过表达可以抑制其分泌IL-8蛋白过多的情况，但不能影响IL-8mRNA的水平（P>0.05）。结论：MiR-16-2-3p的靶基因是IL-6，miR-100-3p的靶基因是IL-8；SIgA通过作用miR-16-2-3p和miR-100-3p来分别调控系膜细胞产生炎症因子IL-6和IL-8，是SIgA在IgAN中产生致病性的分子机制之一。全文结论SIgA参与了IgAN的发病，它在肾组织的沉积同一定的临床肾脏病理指标相联系；SIgA在IgAN中具有致病作用，表现在有可能激活旁路途径和凝集素途径造成肾损伤，刺激系膜细胞增殖并释放促炎促纤维化细胞因子；SIgA通过作用miR-16-2-3p和miR-100-3p来分别调控系膜细胞产生炎症因子IL-6和IL-8，可能是SIgA在IgAN中发挥致病作用的机制之一。关键词IgA肾病，分泌型IgA，补体，系膜细胞，microRNAsV AbstactThestudyontheroleandmechanismofsecretoryIgAinthepathogenesisofIgAnephropathyAbstractBackgroundIgAnephropathy(IgAN)isthemostcommonformofprimaryglomerulonephritisinourcountryandeventheworld.IgANisspecificallythepresenceofIgA-dominantorco-dominantimmunedepositsinthemesangiumorcapillaryloopoftheglomeruli.Accordingtothelatestdatashowedin2014,itsestimatedfrequencyisatleast2.5casesperyearper100,000adults.However,thepathogenesisofIgANisstillremainunclear.PatientswithIgANhavemacroscopichematuriaorproteinuriaprecededbymucosalinfectionsoftheupperrespiratorytractordigestivesystemhassupportedtheviewthatIgANmightbeconnectedwithmucosalimmuneresponses.SecretoryIgA(SIgA)isthedominantimmunoglobulininmucosalimmunity.AndrecentlystudiessuggestedSIgAmightplayanimportantroleinthepathogenesisofIgAN.TheclinicalmanifestationsandpathologicphenotypesofIgANvary,isitbecauseofSIgAinvolved?SIgAcoulddepositeinmesangiuminpatientswithIgAN,wetheritplaysaroleinthemesangialcellsinjury?WhatisthemechanismofinjurySIgAplays?Sofar,thereisnoreports.MicroRNAs(miRNAs)areagroupofnoncodingRNAwiththefunctionofendogenousregulationineukaryoticcells,whichcandownregulategeneexpressionbybindingtosequencesinthe3’untranslatedregion(UTR)oftheirtargetmRNAs.RecentlyresearchhaveshowedmiRNAsareinvolvedinmanypathogenesisofrenaldiseases.IfSIgAplaysapathogenicroleinIgANthroughmiRNAs,itisunknownuntilnow.PartⅠObjectives:ToinvestigatetheproportionofSIgAdepositionintheglomeruli;ToanalyzetherelationshipbetweenSIgAandtheclinicalandrenalpathologicalcharactersinpatientswithIgAN;VI AbstactMethodsThisstudyenrolled263primaryIgANpatients,renalsectionsofthemwerestainedtodetectdepositionofSIgAbyaconfocalmicroscope.ClinicalandpathologicalcharacteristicsofpatientswithIgAorSIgAdepositionwereanalyzed.Results:1.In263patients,therewere87patients(29.28%)withSIgAdepositioninmesengium;2.ComparedwithpatientswithoutSIgAdeposition,thepatientswithSIgAdepositionhadhigherincidencesofinfectionhistory(P=0.016),hematuria(P=0.024）,lowerlevelsofserumcystatinC(P=0.027),β2microglobulin(P=0.018)andlowertubulointerstitiallesiongrades(P=0.030)andT-gradeintheOxfordclassification(P=0.026)；Conclusions:ThisstudysuggestedastronglinkbetweenmucosalimmuneandIgAN.SIgAparticipatesinthepathogenesisofIgAN.ThedepositionofSIgAinkidneyareassociatedwithdifferentclinicalandpathologicalmanifestationsinpatientswithIgAN.PartⅡThestudyofcomplementpathwaysactivatedbySIgAinthekidneyofIgANpatientsObjectives:TostudyrenalinjuryeffectsofSIgA,wedetectedthecomplementpathwaysinkidneyactivatedbySIgAdepositedinrenaltissueofpatientswithIgAN;TocomparetheclinicalandpathologicalcharactersofIgANpatientswithdifferentcomplementactivationpathways.Methods:Thisstudyenrolled87primaryIgANpatients,renalsectionsofthemwerestainedtodetectdepositionofSIgAandcomponentsofcomplementpathwaysbyaconfocalmicroscope.TherelationshipbetweenSIgAandcomplementactivationpathwayswerestudied.ClinicalandpathologicalcharacteristicsofpatientswithVII Abstactdifferentcomplementactivationpathwayswereanalyzed.Results:1.In87patients,therewere22patientswithSIgAdepositioninmesengium,inthattherewere77.27%patientswithalternativepathwayactivation,andthisproportionwas72.30%inpatientswithoutSIgAdeposition;Comparisonoftheproportionintwogroupshadnosignificantdifference(P=0.648).2.Comparedwithpatientswithlectinactivationpathways,thepatientswithalternativepathwayactivationhadlowerglomerularfiltrationrate(P=0.043),higherratioofglomerularsclerosis(P=0.035),leveloftubulointerstitiallesions(P=0.030),intensityofC3(P=0.012),S(P=0.006)andTscores(P=0.039)inOxfordclassifications.Conclusions:SIgAmayplayapathogenicroleinIgAN,itcancauserenaldamagebyactivatingalterativeandlectinpathways;Milderinjurywasfoundinpatientswithlectionpathwayactivation,comparewiththoseactivatedbyalternativepathway.PartⅢBiologicaleffectsofsecretoryIgAonmesangialcellsObjectives:TostudythebiologicaleffectsofsecretoryIgAonmesangialcells;ToinvestigaterenalinjuryofSIgAinIgAN.Methods:ThesalivaofpatientswithIgANandhealthyvolunteerswerecollectedtopurifySIgAbyjacalinaffinitychromatography.SerumofIgANpatientsandhealthysubjectswerecollectedtoisolatepolymericIgA(pIgA)byjacalincolumnandSephacryIS-300gelfiltrationchromatographycolumn;ThebiologicaleffectsofSIgAandpIgAonhumanmesangialcellswereinvestigatedandcompared.Thebiologicaleffectsincludedtheproliferationsofmesangialcellsandtheexpressionsofcytokines(interleukin-6,interleukin-8,monocytechemotacticprotein1,transforminggrowthfactor-β1andfibronectin)inmRNAandproteinlevels.Atlast,thebiologicaleffectsofSIgAandpIgAwerecompared.VIII AbstactResults:1.SIgAisolatedfromIgANpatientsstimulatedmesangialcellsatahigherratioofproliferation(P<0.05）andhighermRNAandproteinlevelsofinterleukin-6,interleukin-8,monocytechemotacticprotein1,transforminggrowthfactor-β1andfibronectin(P<0.05),comparedwithSIgAisolatedfromhealthyvolunteers.BiologicaleffectsofpolymericIgApurifiedfromIgANpatientsandhealthysubjectsonmesangialcellsweresimilartothatofSIgA.Bytheway,theproliferationandproductionsofinterleukin-6,interleukin-8andfibronectininmesangialcellsstimulatedbySIgAisolatedfromIgANpatientsweresignificantlylowerthanthatbypolymericIgAisolatedfromIgANpatients;BiologicaleffectsofpolymericIgApurifiedfromIgANpatientsandhealthysubjectsonmesangialcellsweresimilartothatofSIgA.2.Theproliferationandproductionsofinterleukin-6,interleukin-8andfibronectininmesangialcellsstimulatedbySIgAisolatedfromIgANpatientsweresignificantlylowerthanthatbypolymericIgAisolatedfromIgANpatients;Conclusions:SIgAmayplayapathogenicroleinIgAN.SIgAcanactivatemesangialcellsproliferatingandproducingproinflammatorycytokines.ThebiologicaleffectsofSIgAonmesangialcellsaredifferentfromthatofpolymericIgA.PartⅣScreenandverificationofmiRNAsrelatedwiththepathogenicityofsecretoryIgAObjectives:ToscreenthemiRNAsrelatedwiththepathogenicityofsecretoryIgA;ToresearchthemolecularmechanismofrenalinjuryactivatedbySIgAinIgAN.Methods:MicroRNAsinmesangialcellsweredetectedoutbyAgilenthumanmicroRNAschips,whichwerestimulatedbySIgAfromIgANpatientsandfromnormalpeople.AndthedifferentexpressionsofmiRNAsofthemwerescreenedout.Theywereverifiedbyquantitativereal-timePCR;Results:IX Abstact1.DifferentialexpressionprofilesofmiRNAswerescreenedoutbymiRNAschipanalysistechniques,fivemiRNAsforupregulationand12fordownregulation;2.Theresultsofchipscreeningwereverifiedbyquantitativereal-timePCR,andtheyshowedthesimilarconsistenttrend,ofwhich16differentiallyexpressedsignificantly(P<0.05),the1differenceisnoobvious(P>0.05).Conclusions:MiRNAsmaybecloselyrelatedtothepathogenicroleplayedbySIgAinIgAN.PartⅤThemolecularmechanismofmiR-16-2-3pandmiR-100-3pregulatedonIL-6andIL-8Objectives:TocalculateandverifythetargetgeneofmiR-16-2-3pandmiR-100-3p;ToresearchthemolecularmechanismofkidneyinjuriesactivatedbySIgAinIgANpatients.Methods:PotentialcandidatetargetgenesofmiR-16-2-3pandmiR-100-3pwereobtainedbybioinformaticsanalysis.Luciferasereportervectorsfusedwithtargetgene3’UTRwereconstructedanddual-luciferasereporterassayswereimposedtotesttheeffectsofmiR-16-2-3pandmiR-100-3pontheirtargetgenes;InordertostudytheendogenousregulatoryeffectsofmiR-16-2-3pandmiR-100-3pontargetgenes,theexpressionlevelsoftargetgeneinmesangialcellsweredetectedbyquantitativerealtimePCRandWesternblot.Results:1.LuciferasereporterwithoverexpressionofmiR-16-2-3pandmiR-100-3pwereconstructedsuccessfully.2.Dual-luciferasereporterassaysshowedthatmiR-16-2-3pandmiR-100-3pmimiccouldbindwiththe3’-untranslatedregionofinterleukin6andinterleukin8mRNA(wildtype)inthereportergenevector,andreduceluciferaseactivities,respectively；Althoughtheycan’thappeninthereportergenevectorwithmutationofinterleukin6andinterleukin8(P<0.05).3.OverexpressionofmiR-16-2-3pcouldinhibittheproteinlevelofinterleukin6inX AbstactmesangialcellsstimulatedbySIgA,notinthelevelofmRNA.Similar,overexpressionofmiR-100-3pcouldinhibittheproteinlevelofinterleukin8inmesangialcellsstimulatedbySIgA,notinthelevelofmRNA.Conclusions:ThetargetgeneofmiR-16-2-3pisinterleukin6,thetargetgeneofmiR-100-3pisinterleukin8;SIgAeffectsmiR-16-2-3pandmiR-100-3ptoregulatemesangialcellsproducingIL-6andIL-8,respectively;ThismaybetheoneofmolecularmechanismofpathogenicityofSIgAintheIgAN.ConclusionsforallSIgAparticipatesinthepathogenesisofIgAN;ThedepositionofSIgAinkidneyareassociatedwithdifferentclinicalandpathologicalmanifestationsinpatientswithIgAN;SIgAmayplayapathogenicroleinIgANinthefollowing,foronemomentitcanactivatealterativeandlectinpathways,foranotheritcanactivatemesangialcellsproliferating,producingproinflammatoryandprofibroticcytokines;SIgAeffectsmiR-16-2-3pandmiR-100-3ptoactivatemesangialcellsproducingIL-6andIL-8,respectively.ThismaybeoneofthemolecularmechanismsofpathogenicityofSIgAintheIgAN.Keywords:IgAnephropathy,secretoryIgA,complement,mesangialcells,microRNAsXI 目录目录论文部分分泌型IgA在IgA肾病发病中的作用及机制研究·····································1引言·········································································································1第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系······11.实验材料·························································································12实验方法·························································································33.实验结果························································································64.讨论······························································································85.小结·····························································································12第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究··························131.实验材料························································································132方法·······························································································153结果·······························································································174.讨论·······························································································225.小结·······························································································24第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究·········································251实验材料························································································252方法·······························································································324讨论·······························································································565小结·······························································································59第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证····························601.实验材料························································································602方法·······························································································653结果·······························································································694讨论·······························································································765小结·······························································································79第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制·····················801实验材料························································································802实验方法························································································843实验结果························································································964讨论·····························································································1085小结·····························································································110全文结论································································································112综述···························································································120MicroRNAs与IgA肾病关系的研究进展·······················································120参考文献································································································129攻读博士期间发表文章及研究成果····················································135致谢···························································································137 主要符号和缩略语说明主要符号和缩略语说明英文缩写英文全称中文译名IgANIgAnephropathyIgA肾病SIgASecretoryIgA分泌型IgAESRDend-stagerenaldisease终末肾脏病EMTepithelial-mesenchymaltransition上皮-间充质细胞转分化MBLmannan-bindinglectinpathway甘露聚糖结合凝集素FITCfluoresceinIsothiocyanate异硫氰酸荧光素TRITCtetramethylrhodamineisothiocyanate四甲基异硫氰酸罗丹明miRNAsmicroRNAs小分子RNAmRNAmessengerRNA信使RNAMACmembraneattackcomplex膜攻击复合物ILInterleukin白介素RT-PCRreversetranscriptionPCR反转录RCRMCMmesangialcellmedium系膜细胞培养液HRMChumanrenalmesangialcells人肾系膜细胞TNFtumournecrosisfactor肿瘤坏死因子TGFtransforminggrowthfactor转化生长因子MCPmonocytechemotacticprotein单核细胞趋化因子TLRsToll-likereceptorsToll样受体CysCCystatinC胱抑素CHEhematoxylin-eosin苏木素-伊红PASschiffperiodicacidshiff过碘酸雪夫氏PASMperiodicacid-silvermetheramine过碘酸六胺银SCsecretorycomponent分泌片pIgRpolymericimmunoglobulinreceptor多聚免疫球蛋白受体P-SIgAPurifiedsecretoryIgAfrompatients患者体内纯化的SIgAN-SIgAPurifiedsecretoryIgAfromnormalpersons正常人体内纯化的SIgApIgAPolymericIgA多聚IgAP-pIgAPurifiedpIgAfrompatients患者体内纯化的pIgAN-pIgAPurifiedpIgAfromnormalpersons正常人体内纯化的pIgAmIgAmonomericIgAIgA单聚体dIgAdimericIgAIgA二聚体UTRuntranslatedregion非翻译区 引言分泌型IgA在IgA肾病发病中的作用及机制研究引言IgA肾病（IgAnephropathy,IgAN)是我国乃至全球最常见的原发性肾小球肾炎，且逐年呈上升趋势。据2014年资料显示，全球IgAN的发病率为2.5人/10万人[1]/每年，约20%的患者起病10年就可出现肾功能不全，并进展至终末期肾脏病[2]（end-stagerenaldisease，ESRD）。我国IgAN约占原发性肾小球疾病的45%，[3]并且是我国慢性肾衰竭的主要病因，约占27%。IgAN主要累及青壮年，给社会和家庭带来极大负担，因此对IgAN的机制研究是非常必要的。IgAN患者常在上呼吸道或肠道等粘膜感染后发生肉眼血尿和/或蛋白尿，因此粘膜免疫同IgAN密切相关。分泌型IgA(SecretoryIgA,SIgA)是参与人体粘膜免[4,5]疫的最重要抗体，主要分布在口腔、肠道消化液、呼吸道粘液以及初乳中，少量返流入血。前期研究发现IgAN患者血清多聚IgA1中含有大量的SIgA；甚至[6]在部分患者的肾脏中亦发现有SIgA的沉积；与正常人相比，IgAN患者血清及[6,7]尿液中SIgA的水平显著升高并且与肾脏的损伤程度密切相关；血清SIgA水平[8]升高与IgAN患者的肉眼血尿的发作有相关性。以上提示SIgA在IgAN的发病中可能也起着非常重要的作用。可是，目前为止IgAN的病因仍不清楚。很多临床及基础实验研究普遍关注在具有糖基化缺陷的IgA1在其发病中的作用，既以糖基化缺陷IgA1为主的免疫复合物沉积在肾小球的系膜区，激活补体，刺激系膜细胞增殖并分泌促炎症促[9]纤维化细胞因子，致细胞外基质增多，造成肾脏损伤。那么肾组织SIgA沉积的患者及IgA沉积的患者中，他们的临床及肾病理特征是否相同呢？IgAN中SIgA同IgA具有相类似的致病性吗？比如在激活补体，刺激系膜细胞从而产生一系列生物学效应方面，它们的作用相同吗？那么SIgA在IgAN中发挥这些致病性的分子机制是什么呢？近几年，在对肿瘤的机制及致病靶点研究发现，非编码基因同肿瘤的发生发展有密切的联系，特别是一类非编码的单链小RNA(microRNAs,miRNAs)几乎参与了肿瘤发病、进展及转移的每一步，可能成为肿瘤在临床诊断、[10]分型、治疗及预后等各方面的分子标志物，在肾脏疾病尤其是IgAN邻域也发[11]挥着重要的调控作用。SIgA是否可以通过作用miRNAs来发挥其在IgAN中的致病性呢？到目前为止，均未见这方面的报道。1 引言为了解决上述问题，本课题预从以下五个部分进行阐述：第一部分：为了探讨SIgA是否参与了IgAN，我们检测IgAN患者肾组织SIgA的沉积，并比较SIgA与患者临床及肾脏病理之间的关系；第二部分：为了研究SIgA在IgAN中的肾损伤作用，我们检测IgAN患者肾组织SIgA及各补体通路的成分，研究SIgA与各补体通路激活的关系，以及经不同补体通路激活的患者之间的特点；第三部分：为了研究SIgA的致病作用，我们提纯IgAN患者体内的SIgA并检测其对系膜细胞的促增殖促炎促纤维化的生物学效应，同IgAN患者来源的多聚IgA对系膜细胞的作用进行比较；第四部分：为了探索SIgA产生致病性的机制，运用miRNAs芯片杂交技术，筛选出与SIgA对系膜细胞发挥致病性有关的miRNAs，并予以验证；第五部分：为了进一步探讨SIgA产生致病性的机制，选取上一部分芯片结果中的miR-16-2-3p和miR-100-3p，进行与炎症因子相关的靶基因预测，并应用双荧光报告基因检测及对内源性蛋白调控的检测确定靶基因预测的准确性。本课题的创新点：首次探讨了肾组织沉积的SIgA与IgAN患者临床及肾脏病理的关系；首次成功提纯了IgAN患者体内的SIgA；系统性地探讨了SIgA对肾小球系膜细胞的生物学效应；成功预测并验证了miR-16-2-3p的靶基因是白介素6，以及miR-100-3p的靶基因是白介素8；首次探讨致病性SIgA通过miRNAs调控肾脏系膜细胞炎症因子释放，从而导致肾损伤的机制。2 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系IgA肾病（IgAnephropathy，IgAN）是全球最常见的原发性肾小球疾病，约[3]占我国原发性肾小球疾病的45%，它以肾小球系膜区出现以IgA为主的免疫复[12,13]合物沉积为主要特征。由于该病约80%为青壮年，且其中约20-30%的患者在起病后10-20年进展到终末期肾脏病（end-stagerenaldisease，ESRD），由此患者的长期社会劳动力减弱或丧失，至尿毒症期只能依赖透析或肾移植维持生命。IgAN不仅是我国ESRD的重要原因之一，更为重要的是，它造成了个人和社会的极大负担，所以对IgAN的研究是非常必要的。一系列研究提示粘膜免疫异常参与了IgAN的发生。研究者们发现，IgAN[13,14]患者血清或肾组织中存在粘膜相关抗原；粘膜相关抗原免疫小鼠可诱导[15]IgAN动物模型；参与粘膜免疫的Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）基因[16]多态性与IgAN严重程度相关等。而分泌型IgA(SecretoryIgA,SIgA)是参与人体粘膜免疫的最重要抗体，主要表达在口腔、肠道、呼吸道等粘膜分泌液及[4,5]初乳中，在血液中的浓度很低。有研究发现SIgA同IgAN发病是有相关性的。IgAN患者血清及尿中的SIgA水平是增高的，并都与肾功能、尿蛋白及肾脏病[6,17]理损伤程度相关；另外在小样本（34名IgAN患者）检测发现约33%患者肾[17]组织存在SIgA的沉积。因此SIgA或许在IgAN的发病机制中起了重要的作用。IgAN患者肾脏病理既可以表现为轻度系膜增生性肾小球肾炎，也可以表现为增生硬化性肾小球肾炎，甚至新月体性肾炎；其临床上可以表现为隐匿性的单纯血尿，也可以呈肾病综合征或者肾功能的下降。因此，IgAN的病理类型及临床表现具有明显的多样性。那么沉积在IgAN患者肾组织的SIgA起了什么样的作用呢，是否因为它的沉积会造成患者的临床病理特征而不同呢？迄今为止，还没有这方面的报道。本部分将扩大样本，检测IgAN患者肾组织SIgA的沉积，并探讨SIgA的沉积与患者临床及肾脏病理之间的关系。1 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系1.实验材料1.1实验主要试剂(1)小鼠抗人SC单克隆抗体：Genetex，美国(2)AlexaFluor®594标记的驴抗小鼠IgG：Invitrogen，美国(3)兔抗人IgA多克隆抗体：Dako，丹麦(4)牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司，中国(5)FITC标记的山羊抗小鼠IgG：北京中杉生物试剂公司，中国(6)苏木素-伊红染色试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，中国(7)六胺银染色液：北京索莱宝科技有限公司，中国(8)马松三色特染试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，中国(9)高碘酸雪夫特染试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，中国(10)兔抗人IgM多克隆抗体：Dako，丹麦(11)小鼠抗人C3多克隆抗体：Dako，丹麦(12)兔抗人C1q多克隆抗体：Dako，丹麦(13)FITC标记的山羊抗兔IgG：北京中杉生物试剂公司，中国(14)OCT：Bayer，美国(15)丙酮：上海化学试剂有限公司，中国(16)甘油、中性树胶：北京中杉生物试剂公司，中国1.2实验主要器材倒置荧光显微镜Leica，德国激光共聚焦显微镜LSM710Zeiss，德国超低温冰箱MDF-U52V型SANYO，日本普通贮存冰箱BC-169型海尔集团，中国恒温箱上海新苗(CIMO)医疗器械有限公司，中国电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司，中国烤片机上海精宏实验设备有限公司，中国电子天平PB303型Mettler公司，瑞士PH/温度微电脑测试笔HANNA，意大利2 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系制冰机IEC-25型苏州雪尼，中国磁力搅拌器S6型北京金北德工贸有限公司，中国冷冻切片机HM550型MICROM，德国冷冻抽干机VIRTIS，美国1.3实验液体配置（1）0.01MPBS（pH7.4）NaCl8gNa2HPO412H2O2.9gKCl0.2gKH2PO40.26g去离子水1000ml（2）含1%BSA的PBST（BSA/PBST）BSA1gPBST100ml2实验方法2.1研究对象及其临床资料、肾组织收集选取在郑州大学第一附属医院肾内科2011年09月-2013年09月期间住院，经肾穿刺活检术确诊原发性IgA肾病，免疫荧光IgM阴性的患者，共263名。所有病例的穿刺肾小球数≥10个，均除外系统性红斑狼疮，紫癜性肾炎，慢性肝病等引起继发性IgA在系膜区沉积的疾病；所有病例均有完整的临床资料，包括病史、性别、年龄、肾活检前一周的血压、血常规、血生化、24小时尿蛋白定量，并用MDRD公式（年龄≥18岁）或Counahan-Barratt公式（年龄<18岁）[18,19]计算eGFR（estimateglomerularfiltrationrate），来评价肾功能；肾活检后的肾脏标本一部分用10%中性甲醛溶液固定4℃保存留备石蜡切片，另一部分用3 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系OCT（opti-mumcuttingtemperaturecompound）包埋冻存在-80℃的冰箱中留备冰冻切片。所有患者在实验前均签订知情同意书。2.2肾组织常规病理检查及评分2.2.1石蜡肾组织切片染色及评分经甲醛固定的肾组织，石蜡包埋切片（4μm），常规脱蜡至水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各10min，95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各10min蒸馏水冲洗，分别用做苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）、马松（Masson）、过碘酸雪夫氏(schiffperiodicacidshiff，PAS)染色及过碘酸六胺银（periodicacid-silvermetheramine，PASM）+Masson套染，二甲苯透明，中性树胶封片。通过光学显微镜摄取图像。[20]经两名病理医师独立阅片，光镜下观察并按下列标准予以常规评分：①系膜增生程度：1，4-6个系膜细胞/系膜区；2，>6个系膜细胞/系膜区。②肾小球硬化，新月体，细胞新月体，细胞纤维新月体，纤维新月体：均按病变肾小球占总穿刺的小球数比值。③肾小管间质病变（包括肾小管萎缩，间质纤维化及间质浸润）：0，无病变；1，<25%的间质小管病变；2，25-50%的间质小管[21]病变；3，>50%的间质小管病变。同时还根据牛津分型给予评分：①系膜细胞增殖（M）：M0，<4个系膜细胞/系膜区；M1，≥4个系膜细胞/系膜区（系膜细胞增殖积分取所有肾小球的平均值系膜细胞积分计算在PAS染色下进行）。②肾小球节段硬化（S）：S0，无不同程度的袢受累；S1，有不同程度的袢受累。③毛细血管内增殖（E）：E0，未见肾小球毛细血管内细胞增殖致袢腔狭小；E1，存在肾小球毛细血管内细胞增殖致袢腔狭小。④小管萎缩/间质纤维化（T）：T0，肾皮质小管萎缩或间质纤维化<25%；T1，肾皮质小管萎缩或间质纤维化26-50%；T2，肾皮质小管萎缩或间质纤维化>50%。2.2.2冰冻肾组织切片染色及评分对新鲜冰冻OCT包埋肾组织应用直接免疫荧光法立即进行异硫氰酸荧光素（fluoresceinIsothiocyanate，FITC)标记的IgG、IgA、IgM、C3和C1q的染色。经两名病理医师独立阅片，免疫荧光显微镜下观察并按下列标准予以荧光强度评：0，各种倍数的荧光显微镜均不能显现；1，低倍镜下模糊，高倍镜下4 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系可见；2，低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见；3，低倍镜下清晰可见，高倍镜[22]下耀眼；4，低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。2.3激光共聚焦检测IgAN患者肾组织中SIgA的沉积从-80℃冰箱中取出OCT包埋的IgAN患者肾组织冰冻切片（4μm），4℃静置20-30min；将多余的水分擦干，-20℃预冷丙酮固定：4℃，10min；0.01MPBS漂洗5min×3次；加入1%BSA/PBS封闭，室温，孵育30min；0.01MPBS漂洗5min×3次；加入一抗：0.01MPBS1：100稀释的小鼠抗人SC，4℃过夜；0.01MPBS漂洗5min×3次；加入二抗：0.01MPBS1：100稀释的AlexaFluor®594标记的驴抗小鼠IgG，37℃孵育60min，避光；0.01MPBS漂洗5min×3次；加入：用0.01MPBS1：30稀释的FITC标记的兔抗人IgA*，37℃孵育60min，避光；PBS漂洗5min×3次；擦去多余水分，甘油封片，激光共聚焦显微镜下阅片。阳性对照：人小肠组织阴性对照：上述步骤中一抗为0.01MPBS。注：*FITC标记的兔抗人IgA带有FITC标记的IgG。2.4统计学分析计量资料用均数±标准差（正态分布）或中位数（最小值，最大值）（非正态分布）表示，两组间临床指标或病理指标的比较采用t检验（正态分布）、非参检验（非正态分布）或卡方检验（分类资料）。统计分析应用SPSS统计软件完成（17.0，Chicago,IL），作图采用GraphPadPrism6.0完成，P<0.05认为有统计学意义。5 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系3.实验结果3.1肾组织常规病理检查本实验共收集到了263名符合筛选条件的IgAN患者。所有肾组织的冰冻切片均可见到肾小球是IgA或以IgA沉积为主的免疫复合物沉积，未见C1q、IgM的沉积，经过石蜡及冰冻常规染色，制片合格。3.2肾小球的SIgA沉积检测经过肾组织的SIgA免疫荧光检测发现：红色的SC表达在肾小球的系膜区，少数在肾小管也有表达，绿色的IgA均沿系膜区分布。共检测了263名IgAN患者，其中77名可见到系膜区SC与IgA的共沉淀，既SIgA，显色为黄色，占29.28%（图1.1）。阴性对照只见绿色IgA沿系膜区分布，未见红色SC沉积。3.3肾小球SIgA的沉积与患者临床指标的关系77名有沉积的患者（SIgA+），其感染史发生率（P=0.016）和血尿发生率（P=0.024）均明显高于186名无沉积的患者（SIgA-）（图1.2a），并且SIgA+组的血胱抑素C（P=0.027）（图1.2b）和血β2微球蛋白（P=0.018）（图1.2c）均明显低于SIgA-组。在血压、血红蛋白、血白蛋白、血肌酐、肾小球滤过率及24小时尿蛋白方面两组间没有明显差异（图1.2，表1.1、1.2）。图1.1IgAN患者肾组织SIgA的沉积（a）：绿色荧光为肾组织系膜区IgA的沉积；（b）：红色荧光为同一块肾组织系膜6 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系区分泌片段（SC）的沉积；（c）：黄色荧光为SIgA的表达。（放大×200倍）表1.1肾组织SIgA+及SIgA-的患者临床特征之间的比较。SIgA+(n=77)SIgA-(n=186)P-值性别（男/女）48/29125/610.449年龄（岁）32(4,63)30.5(4,67)0.879感染史（阳性/阴性）27/5039/1470.016*血尿（阳性/阴性）55/22105/810.024*收缩压(mmHg)129(89,180)129.5(88,212)0.863舒张压(mmHg)81(60,130)81(55,140)0.76血红蛋白(g/L)131(82,182)131(61,198)0.831血白蛋白(g/L)38.35(11.3,51.8)38.8(10.1,57.2)0.266血尿素氮(mmol/L)5.29(2.6,34.89)5.89(2.27,48.39)0.071血肌酐(µmol/L)77(29,851)82.3(32,1133)0.361肾小球滤过率81.25±36.7480.50±37.620.883(mL/min)血尿酸(µmol/L)313(147,559)338(143,850)0.241胱抑素C(mg/L)0.95(0.4,5.24)1.07(0.51,5.47)0.027*β2微球蛋白(mg/L)1.9(0.27,10.88)2.36(0.5,18.75)0.018*尿蛋白(g/24h)1.5(0.07,15)1.44(0.07,29.8)0.512注：标记*表示P<0.05。图1.2IgAN患者肾组织SIgA+与SIgA-临床及病理特征比较（a）肾组织SIgA+的比SIgA-患者的有更高感染史（P=0.016）及血尿（P=0.024）发生7 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系率；（b）肾脏SIgA+的胱抑素C低于SIgA-患者（P=0.027）；（c）肾脏SIgA+患者的β2微球蛋白低于SIgA-患者（P=0.018）；（d）肾脏SIgA+患者的肾组织小管间质损伤程度低于SIgA-患者（P=0.03）；（e）肾组织SIgA+患者的肾脏病理T评分（牛津评分）低于SIgA-患者（P=0.021）.3.4肾小球SIgA的沉积与患者肾脏病理的关系SIgA+组肾组织小管间质病变程度（P=0.030）及牛津评分的T评分（P=0.026）均低于SIgA-组。在系膜增生程度，小球硬化，C3沉积以及牛津分型的其他评分方面两组间未见明显差异（图1.2，表1.2）。表1.2肾组织SIgA+及SIgA-患者肾脏病理之间的比较。SIgA+(n=77)SIgA-(n=186)P值肾小球硬化(%)3.13(0,39.44)3.13(0,18.5)0.708总新月体(%)5.13(0,62.96)0(0,69.23)0.076细胞性新月体(%)0(0,59.26)0(0,65.38)0.111细胞纤维性新月体(%)0(0,14.29)0(0,23.08)0.115纤维性新月体(%)0(0,40)0(0,60)0.708系膜增殖程度44/33106/800.982（1级/2级）小管间质损伤36/33/5/355/93/17/210.030*（0级/1级/2级/3级）C3强度20/15/31/1152/35/79/200.866（0级/1级/2级/3级）M0/M166/11158/280.873E0/E156/21140/460.667S0/S143/34104/820.992T0/T1/T272/3/2148/24/140.021*注：M、E、S、T：指牛津分型，标记*表示P<0.05。4.讨论IgAN是Berger于1968年提出来的，因此又称为Berger病（Berger’sdisease）[12]。它是一个免疫病理诊断，其特征是免疫荧光下见到以IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜区和/或肾小球毛细血管襻沉积。目前研究认为，IgA1分子的糖8 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系[23]基化缺失，遗传因素以及粘膜免疫等均参与了IgAN的发病，但是，其确切的发病机制仍未阐明。IgAN患者常在上呼吸道或肠道等粘膜感染后发生肉眼血尿和/或蛋白尿，其[24]中约有40%的患者会在一天内就出现肉眼血尿。因此粘膜免疫与IgAN的发病密切相关。而SIgA是参与人体粘膜免疫的最重要抗体，SIgA主要在粘膜表面产生，含有SIgA1和SIgA2两种亚型，在不同的粘膜SIgA1/SIgA2的比例相对[25][26]不同：唾液中为1.3-1.4，小肠液中主要的亚型是SIgA2，初乳中两种亚型[27]的比例基本相当。SIgA为双聚体，每个分子含有一个J链和一个分泌片（secretorycomponent，SC）（图1.3），α链、轻链和J链均由浆细胞分泌出来以后，与多聚免疫球蛋白受体（polymericimmunoglobulinreceptor,pIgR）在上皮细胞的基底侧，以共价键的形式结合形成复合物,然后启动上皮细胞的内吞作用，将其摄入泡内形成吞饮小泡，转运至细胞的顶端，并将IgA-pIgR复合物以胞吐方式释入粘膜腔。释放过程中pIgR分子被截去一小段，剩余部分即为SC，并与IgA结合形成SIgA（图1.4）。部分SIgA可返流入血液，因此血清中也含有少量的SIgA。其中SC不仅可以存在SIgA中，在IgM也有大量的SC，故我们在选取病人时排除了肾组织有IgM沉积的患者。图1.3SIgA的结构模式图(引自MarjoleinvanEgmond,etal,TRENDSinImmunology,2001)9 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系图1.4SIgA的合成与分泌(引自陈慰峰等，医学免疫学，2005)既往一系列国外研究以及我研究所的前期工作均表明，SIgA与IgAN的致病性关系非常密切。例如：有研究发现，部分IgAN患者血清及唾液中SIgA的水平明显高于正常人，且血清SIgA水平的高低与肉眼血尿相关，即有肉眼血尿[13,28,29]的患者血清SIgA水平明显高于无肉眼血尿的患者。Oortwijn等的研究发现，血清SIgA仅存在于致病的大分子IgA1中，而单体IgA1中并不能检测到SIgA，且IgAN患者血清大分子IgA1中SIgA的水平显著高于正常人大分子[30]IgA1中SIgA的水平。Suzuki等发现部分IgAN患者肾脏中可检测到SC，[31]提示IgAN患者肾脏中沉积的IgA可能部分来源于粘膜分泌的SIgA。另外，Emancipator等给胆道结扎的小鼠口服或注射免疫复合物后观察，发现其肾小球[32]系膜区出现SIgA的沉积。Eijgenraam等的一项研究发现，将IgAN病人经鼻粘膜进行抗原（霍乱弧菌）免疫后，其血清中抗原特异性的SIgA水平显著升高[24]。还有研究者在移植肾的洗脱液中发现了大量的SIgA，是IgA1的120倍，[13]而这个肾脏的供体是一名IgAN患者。本研究所的前期工作，亦对致病性的血清IgA1分子以及SIgA进行了一系列的研究。这种血清大分子IgA1中含有大量[6]的SIgA；甚至在部分患者的肾脏中亦发现有大量SIgA的沉积；与正常人相比，IgAN患者血清及尿液中SIgA的水平显著升高并且与肾脏的损伤程度密切相关，即肾脏损伤严重的病人，其血清及尿液中SIgA的水平明显高于肾脏损伤轻10 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系[6,17]的病人。以上的各种研究均提示SIgA可能参与了IgAN的发病，那么因为SIgA的参与是否会使患者的临床及肾脏病理而出现不同的情况呢？正如IgAN的临床及肾脏病理本身就具有多样性一样，是否是因为不同的IgA沉积而造成的呢？为了探讨这个问题，我们研究了263名在我科住院并经肾穿刺确诊的原发性IgAN患者，经检测发现有77名患者（29.28%）肾组织存在SIgA的沉积，同我研究所以往的检测比例相类似。并且还发现肾组织有沉积的患者存在明显的感染史(P=0.016)及血尿史(P=0.024)。这更加说明了IgAN中粘膜免疫反应同肾组织SIgA的沉积之间的相关性。既往的研究发现粘膜感染后唾液及血清SIgA水平是升高的，而IgAN患者血清SIgA又同血尿密切相关，因此推论或许是由于粘膜感染导致了较高的血清SIgA水平，最终诱导SIgA在肾脏沉积。我们还发现肾组织有SIgA沉积的患者在临床指标上具有明显低水平的血清胱抑素C（P=0.027）和β2微球蛋白（P=0.018），并且有较低的血肌酐（均值：SIgA+vsSIgA-=77µmol/Lvs82.3µmol/L）和较高的肾小球滤过率（均值：SIgA+vsSIgA-=81.25ml/minvs80.50µmol/L）。胱抑素C（CystatinC，CysC），又名后γ球蛋白，可以从肾小球自由滤过，完全被小管上皮细胞重吸收在胞内降解，它[33]的血清浓度主要由GFR决定；β2微球蛋白是由多形核白细胞、淋巴细胞、血小板产生的一种小分子球蛋白，每天的生成率恒定只在肾脏排泄，它同血清肌[34]酐一样，与GFR之间存在显著的相关性。以上两个参数在临床上均已作为早期衡量肾小球滤过率异常的指标。根据我们的结果可见肾组织有SIgA沉积的患者这两个同肾小球滤过有关的指标比无沉积的似乎要好一些，在血肌酐和肾小球滤过率方面也表现为较轻的损伤，但由于后两项指标两组间没有明显差异，故还需要大样本进一步研究。在肾脏病理中，肾组织有SIgA沉积的患者肾小球的损伤同无沉积的患者基本无差别，但具有较轻的小管间质损伤（P=0.030）和较低的T评分（牛津分型，P=0.026）。我们分析可能有以下原因：（1）正常人的肾小管是可以分泌SIgA的，[6,35]并且尿中SIgA的水平同尿路感染有一定的相关性。这些发现说明SIgA可[36]能在小管中起了一定的保护作用，用以防止细菌粘附于粘膜；（2）Lai等发现IgAN中免疫复合物可以刺激系膜细胞分泌一些炎症介质损伤小管上皮细胞，称之为“球-管对话”，而对于SIgA，或许这种损伤作用并没有IgA1的严重。我们推测也许是以上的原因使SIgA沉积的患者小管间质损伤情况没有IgA沉积的患11 第一部分分泌型IgA在IgA肾病患者肾组织的沉积以及与临床病理之间的关系者严重，为了探讨其中相关的机制，我们又进行了本课题的后面部分的研究（见第三-五部分）。[37]LeWB等在调查了1155名IgAN患者，经过平均随诊7.9年后发现反复发作血尿的患者比没有血尿的预后要好，但是并没有探索其原因。那么经过我们的研究结果及分析，是否是因为这部分患者存在SIgA的作用，而SIgA的致病性弱于IgA而导致呢？这还需要我们对患者进行更深入的研究调查以及临床随诊等等。5.小结通过研究我们认为粘膜免疫同IgAN是密切相关的，SIgA参与了IgAN的发病，我们首次探讨了肾组织沉积的SIgA与IgAN患者临床及病理的关系，发现它在IgAN患者肾组织的沉积同患者血清CysC、β2微球蛋白、肾小管间质损伤以及T评分等相关联。12 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究IgAN是一个免疫病理诊断，即系膜区出现IgA或以IgA为主的免疫复合物[23]沉积，这些沉积物现在认为大多是IgA1多聚体，常结合IgG、补体成分如C3、[38]膜攻击复合物（membraneattackcomplex，MAC）等。引人关注的是，Suzuki等发现在健康移植肾的肾组织中存在系膜区IgA的沉积是相当常见的现象，但如果合并系膜区C3的沉积，则往往就会伴随轻度的血尿、系膜细胞的增殖和巨[39]噬细胞浸润。这提示我们系膜区IgA的广泛沉积并不一定发生IgAN，必须有补体参与才可能出现免疫炎症。因此补体途径的激活在IgAN的肾损伤中起着至关重要的作用。由于系膜区通常少有C1q的沉积，故认为IgAN中确实存在着局部肾组织的补体活化反应，主要是通过旁路途径(alternativepathway)和甘露聚糖结合凝集素（mannan-bindinglectin，MBL）途径而非经典途径（classicalpathway）来实现[40,41]对补体活化的。目前研究认为，MBL途径的激活与肾脏损伤的严重程度密[13,28,42]切相关。既往国内外实验多集中在血清IgA1分子与补体激活的关系上，而对于SIgA与补体激活的研究仍然鲜有报道。本课题的第一部分我们已经发现SIgA在IgAN患者肾脏的沉积，以及与临床和肾脏病理有一定的相关性。那么SIgA沉积在肾组织，是如何发挥肾脏损伤作用呢？是激活了一定的补体通路吗？为此，这部分选取了我科经肾活检确诊的原发性IgAN患者，检测了肾组织SIgA及各补体成分的检测，来研究SIgA在肾组织激活的补体通路。1.实验材料1.1实验主要试剂(1)小鼠抗人SC单克隆抗体：Genetex，美国(2)兔抗人IgA多克隆抗体：Dako，丹麦(3)小鼠抗人P因子单克隆抗体：Abcam，美国13 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究(4)兔抗人C3d多克隆抗体：Abcam，美国(5)绵羊抗人B因子多克隆抗体：Abcam，美国(6)兔抗人C5b-9单克隆抗体：Abcam，美国(7)小鼠抗人MBL单克隆抗体：Abcam，美国(8)兔抗人C4d多克隆抗体：Abcam，美国(9)AlexaFluor®594标记的驴抗小鼠IgG：Invitrogen，美国(10)FITC标记山羊抗小鼠IgG：北京中杉生物试剂公司，中国(11)TRITC标记驴抗兔IgG：Jacksonimmuno，美国(12)FITC标记驴抗绵羊IgG：Jacksonimmuno，美国(13)FITC标记山羊抗小鼠IgG：北京中杉生物试剂公司，中国(14)余试剂同第一部分1.2实验主要器材倒置荧光显微镜Leica，德国激光共聚焦显微镜LSM710Zeiss，德国超低温冰箱MDF-U52V型SANYO，日本普通贮存冰箱BC-169型海尔集团，中国恒温箱上海新苗(CIMO)医疗器械有限公司，中国电热恒温水浴箱上海精宏实验设备有限公司，中国电子天平PB303型Mettler公司，瑞士PH/温度微电脑测试笔HANNA，意大利制冰机IEC-25型苏州雪尼，中国磁力搅拌器S6型北京金北德工贸有限公司，中国冷冻切片机HM550型，MICROM，德国冷冻抽干机VIRTIS，美国1.3实验液体配置（1）0.01MPBS（pH7.4）14 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究NaCl8gNa2HPO412H2O2.9gKCl0.2gKH2PO40.26g去离子水1000ml（2）含1%BSA的PBST（BSA/PBST）BSA1gPBST100ml2方法2.1研究对象及其临床资料、肾组织收集我们选取第一部分2.1所述的于2013年01月-2013年10月期间住院的患者，共87名。患者临床资料及肾组织的收集也同第一部分的2.1。所有患者在实验前均签订知情同意书。2.2肾组织常规病理检查及评分石蜡肾组织切片染色、冰冻肾组织切片染色及评分同第一部分的2.2。2.3用免疫荧光检测肾组织SIgA及各种补体因子从-80℃冰箱中取出OCT包埋的IgAN患者肾组织冰冻切片（4μm），4℃静置20-30min；将多余的水分擦干，-20℃预冷丙酮固定：4℃，10min；0.01MPBS漂洗5min×3次；加入1%BSA/PBS封闭，室温，孵育30min；0.01MPBS漂洗5min×3次；分别在肾组织加入第一个一抗（各抗体及稀释度详表2.1），4℃过夜；0.01MPBS漂洗5min×3次；15 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究分别加入第一个二抗，37℃孵育60min，避光；0.01MPBS漂洗5min×3次；分别加入第二个一抗，37℃孵育120min，避光；PBS漂洗5min×3次；分别加入第二个二抗，37℃孵育60min，避光；0.01MPBS漂洗5min×3次；擦去多余水分，甘油封片，激光共聚焦显微镜下阅片，共定位良好时显示两种抗体在同一部位呈现黄色。阳性对照：慢性扁桃体炎并急性发作的扁桃体冰冻切片（C5b-9）；狼疮性肾炎肾组织的冰冻切片（C3d，P因子，B因子，C5b-9）；肾移植排斥反应的移植肾冰冻切片（C4d）。阴性对照：上述步骤中一抗均为0.01MPBS。表2.1免疫荧光法中一抗和二抗的工作液稀释度添加次序一抗稀释度二抗（IgG）稀释度1小鼠抗人SC单抗1:100AlexaFluor®594标记驴抗鼠1:1002兔抗人IgA多抗*1:301小鼠抗人P因子单抗1:25FITC标记山羊抗小鼠1:1002兔抗人C3d多抗1:2000TRITC标记驴抗兔1:1001绵羊抗人B因子多抗1:15FITC标记驴抗绵羊1:1002兔抗人C5b-9单抗1:15TRITC标记驴抗兔1:1001小鼠抗人MBL单抗1:15FITC标记山羊抗小鼠1:1002兔抗人C4d多抗1:20TRITC标记驴抗兔1:100注：FITC：异硫氰酸荧光素，TRITC：四甲基异硫氰酸罗丹明，*FITC标记的兔抗人IgA带有FITC标记的IgG。2.4共聚焦显微镜对两种补体成分共定位的判断所有的切片经两名病理医师独立阅片评分，结果不一致时进行再次阅片，讨论决定。两种补体成分分别标记呈绿色的FITC和呈红色的四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC)或AlexaFluor®594，共定位良好16 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究呈现黄色。2.5统计学分析计量资料用均数±标准差（正态分布）或中位数（最小值，最大值）（非正态分布）表示，SIgA（+）和SIgA（-）两组间以及旁路途径激活的患者和MBL途径激活的患者之间，临床指标和病理参数的比较采用t检验（正态分布）、非参检验（非正态分布）或者卡方检验（分类资料）。统计分析应用SPSS统计软件完成（17.0，Chicago,IL），作图采用GraphPadPrism6.0完成，P<0.05认为有统计学意义。3结果3.1肾组织常规病理检查本实验共收集到了87名符合筛选条件的IgAN患者。所有肾组织的冰冻切片均可见到肾小球是IgA或以IgA沉积为主的免疫复合物沉积，未见C1q、IgM的沉积，经过石蜡及冰冻常规染色，制片合格。3.2肾组织各种补体通路的激活P因子：有64名（73.56%）患者肾组织可见沉积，大部分在肾小球毛细血管壁分布（绿色荧光）；C3d：在64名患者（73.56%）的肾组织呈阳性，可沿系膜区分布，可沿肾小球毛细血管壁分布（红色荧光）；B因子：有64名患者（73.56%）肾组织可见其沉积，沿系膜区及肾小球毛细血管壁分布，有新月体沉积的部位沉积更明显（绿色荧光）；C5b-9：又称膜攻击复合物，表示补体通路的最终激活。在87名患者（100%）肾组织均可见到沉积，分布在肾小球系膜区及沿肾小球毛细血管壁，有新月体沉积的部位沉积更明显（红色荧光）；MBL：23名患者（26.44%）肾组织呈阳性沉积，沿着肾小球的毛细血管袢和系膜区分布（绿色荧光）；C4d：58名患者（66.67%）可见在系膜区沉积，部分还沿着肾小球的毛细17 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究血管袢可见（红色荧光）。检测了87名患者肾组织各补体通路激活的补体，其中64名患者（73.56%）肾组织可见P因子与C3d的黄色共沉淀、B因子与C5b-9的黄色共沉淀，既旁路途径激活；23名患者（26.44%）肾组织可见MBL与C4d的黄色共沉淀，既凝集素途径激活（详见图2.1）。阴性对照均未见到有阳性沉积。图2.1激光共聚焦显微镜观察IgAN患者肾脏补体激活情况。（a）P因子在系膜区沿毛细血管壁沉积（绿色荧光）；（b）C3d在同一块组织的系膜区表达，部分沿毛细血管壁沉积（红色荧光）；（c）P因子及C3d的共沉积（黄色荧光）；（d）B因子在系膜区的表达，部分沿毛细血管壁沉积（绿色荧光）；（e）C5b-9在同一块组织的18 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究系膜区表达，部分沿毛细血管壁沉积（红色荧光）；（f）B因子及C5b-9的共沉积（黄色荧光）；（g）MBL在系膜区的表达，部分沿毛细血管壁沉积（绿色荧光）；（h）C4d在同一块组织的系膜区表达，部分沿毛细血管壁沉积（红色荧光）；（i）MBL及C4d的共沉积（黄色荧光）。a-f×400倍,g-i×200倍。3.3肾小球SIgA沉积的检测肾组织的SIgA免疫荧光检测同第一部分的3.2，该部分检测了87名IgAN患者，其中22名可见到系膜区SIgA沉积，显色为黄色，阳性率25.29%（详见图1.1）。3.4肾小球沉积的SIgA同激活的补体通路之间的关系在肾小球有SIgA沉积组（SIgA+），17名患者(77.27%)为旁路途径激活（P因子与C3d、B因子与MAC的共沉淀），5名(22.73%)为凝集素途径激活（MBL与C4d的共沉积）；在无sIgA沉积组，47名患者(72.30%)为旁路途径激活，18名(27.70%)为凝集素途径激活。(P=0.648)（表2.2）表2.2肾小球沉积的SIgA同激活的补体通路之间的关系SIgA+组（22人）SIgA-组（65人）P值旁路途径17(77.27%)47(72.30%)0.648凝集素途径5(22.73%)18(27.70%)3.5不同补体通路的患者临床及肾脏病理指标的比较经过非参数检验及卡方检验分析，可见旁路途径激活的64人（73.6%）中，在临床指标方面eGFR较凝集素途径激活的患者明显偏低（P=0.043）（表2.3，图2.2a）,在肾病理损伤方面肾小球硬化比例（P=0.035）、小管间质损伤程度（P=0.030）、C3的免疫荧光强度（P=0.012）以及牛津评分的S（P=0.006）和T评分（P=0.039）均明显重于MBL途径激活的患者。19 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究表2.3不同补体通路的患者临床指标的比较旁路途径激活（64人）MBL途径激活（23人）P值性别（男/女）41/2316/70.634年龄（岁）34.47±13.7730±13.730.185收缩压（mmHg）126.5(95,160)126(110,210)0.525舒张压（mmHg）80(58,110)80(60,140)0.602血红蛋白（g/L）130.92±20.44138.09±19.280.147血白蛋白(g/L)38.8(17.8,49.8)38.3(15.4,57.2)0.729血尿素氮(mmol/L)5.79(2.27,46.1)5.23(2.7,15.1)0.368血肌酐(µmol/L)85(33,656)72(38,341)0.065肾小球滤过率(mL/min)89.81±37.78108.59±37.070.043*血尿酸(µmol/L)319.5(143,698)316(150,508)0.802血胱抑素C(mg/L)1.03(0.73,3.56)1.01(0.51,2.47)0.438血β2微球蛋白(mg/L)2.27(0.74,9.48)1.98(0.82,7.01)0.63尿蛋白(g/24h)1.41(0.15,9.62)1.69(0.07,15)0.648注：标记*表示P<0.05。表2.4不同补体通路的患者肾脏病理指标的比较旁路途径（64人）凝集素途径（23人）P值肾小球硬化(%)8.89(0,75)3.13(0,31.25)0.035*总新月体(%)3.75(0,60)0(0,42.11)0.196细胞性新月体(%)0(0,55.56)0(0,21.05)0.778细胞纤维性新月体(%)0(0,23.08)0(0,2.7)0.347纤维性新月体(%)0(0,60)0(0,21)0.639系膜增殖程度（1级/2级）42/2219/40.127小管间质损伤12/39/7/611/11/0/10.030*（0级/1级/2级/3级）C3强度5/8/37/148/1/12/20.012*（0级/1级/2级/3级）M0/M158/622/10.754E0/E145/1917/60.743S0/S126/3817/60.006*T0/T1/T249/10/523/0/00.039*注：M、E、S、T：指牛津分型，标记*表示P<0.05。20 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究图2.2IgAN患者肾组织不同激活通路的临床及肾脏病理特征比较21 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究4.讨论当前对IgAN发病机制研究的两个重要切入点是IgAN的分子遗传及免疫学机制，而补体系统在免疫应答损伤机制中起着不可替代的作用。[43]补体系统包括大约30种血浆蛋白和膜结合蛋白，共有3条激活途径（见图2.3）：经典途径、MBL途径和旁路途径。经典途径中首先被激活的是C1，与抗原结合的IgM、IgG、C-反应蛋白和血清淀粉样蛋白P、死亡的细胞成分等都要与C1q的两个位点结合才能变构，激活相关的丝氨酸蛋白酶C1r和C1s。激活的C1s将C4裂解为C4a和C4b。C4b就近与组织共价结合。结合后的C4b再[44,45]结合C2，裂解掉C2b小片段，形成C3转化酶C4bC2a；旁路途径不经过C1、C4、C2，因自身有一个缓慢转化过程而能够自我激活，在B因子和D因子辅助下从C3开始激活，C3（H2O）与B因子与结合，B因子的构象发生改变，随后被血清中的D因子裂解，产生Ba和Bb，Bb片断仍与复合物相联，通过自身的丝氨酸蛋白酶活性，裂解与之结合的C3分子，产生C3b。多数产生的C3b被循环中的I因子及其辅助因子H因子（fH）和膜辅蛋白（MCP）快速失活。如果C3b结合的是一个补体正在激活的表面（细菌胞壁或损伤的组织），就会免于失活，替代途径进一步循环往复，结合更多的B因子，产生更多的C3转化酶C3bBb。P因子（properdin）与C3bBb结合可以使之作用更加稳定，从而加强整个连续的蛋白降解过程；MBL途径中MBL与糖类配体结合后活化，构象发生改变，激活与之相连的MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MBLassociatedserineprotease，MASP)-1、2和3。MASP-1可以直接裂解C3为C3b和C3a，MASP-2进一步裂解C4和C2，形成与经典途径相同的C3转化酶（C4b2b）。MBL途径的活化都会裂解C4为C4d，并通过共价键结合在补体激活部位的膜表面上，因[46]而也是MBL途径活化后相对持久的表面标志物。三条途径具有共同的末端通路：膜攻击复合物（membraneattackcomplex，MAC）即C5b-9形成及其所致的[47]细胞溶解效应。70年代起，一系列研究发现，IgAN患者肾组织中有P因子、C3、C5b-9的沉积，当时未见Clq和C4，故认为IgAN中确实存在着肾组织的补体活化反应，[40,41][7,8]主要通过旁路途径而非经典途径。体内、体外及动物实验均支持补体旁路途径的激活在IgAN发病中起着重要作用。如Rits及Hiemstra等发现，大鼠的IgA二聚体（dimericIgA，dIgA）、pIgA以及人的pIgA，在体外可直接激活22 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究[48,49]旁路途径，而IgA单聚体（monomericIgA，mIgA）的作用很微弱。后期研究表明，部分IgAN患者肾小球中也可检测出C4，且血清中也有C4的激活产物,由于IgA分子不能激活补体经典途径，因此推测IgAN可能存在补体另外一条途径，即MBL途径的激活。图2.3补体系统激活的三条途径（引自ThurmanJM,HolersVM.JImmunol,2006.）一系列研究证实，IgAN肾组织中有MBL、MASP、L-纤维蛋白胶凝素[50]（L-ficolin）等MBL途径相关产物的沉积，且与肾脏损伤的严重程度相关。[50]RoosA等体外证实，MBL可以与血清pIgA分子结合，直接激活MBL途径。随后他们又发现25%IgAN肾小球存在MBL、L-ficolin、MASP-2和C4沉积，并且这和临床和病理严重的程度相关，如蛋白尿、肾功能损伤、毛细血管外增殖、肾小球硬化和肾间质纤维化。因此提出MBL途径和IgA的相互作用可能是连接天然免疫和获得性免疫的新桥梁，MBL可能通过其凝集素区域与多聚IgA结合，促发MBL途径的补体活化。以上均是IgAN中致病的IgA同补体激活通路的关系，但对于SIgA的情况只有一篇报道，既在小样本的调查检测中，Oortwijn等发现4名IgAN患者肾小[51]球中存在SIgA与MBL共沉淀，并且还伴C4d的激活，提示IgAN中SIgA可23 第二部分分泌型IgA在IgAN患者肾组织激活的补体通路研究以激活肾脏MBL途径。为了进一步验证以及探寻SIgA在IgAN的致病机制，我们检测了87名原发性IgAN患者的各条补体通路的成分及SIgA的免疫荧光，发现了同Oortwijn等的研究不太相同的结果：有SIgA沉积的肾组织既存在MBL、C4d的共沉淀，还有P因子和C3d以及B因子和C5b-9的共沉积。这说明在IgAN中SIgA有可能激活MBL途径，以及旁路途径；其中，SIgA（+）中MBL途径所占的比例同在SIgA（-）的患者中其占的比例基本相当（P=0.648）。这个结果与IgAN中致病性IgA激活的补体通路相类似。在前面的论述中我们提到了有学者调查了60名IgAN患者，发现15名（25%）肾组织是MBL途径激活的，其临床和病理损伤程度相对旁路途径激活的要更严[52]重。我们的研究却与之不太相同，87名IgAN中肾组织经过MBL途径激活的有23名（26%），临床指标经比较发现患者的eGFR较旁路途径激活的患者明显偏高（P=0.043）；肾病理损伤比较后发现肾小球硬化比例（P=0.035）、小管间质损伤程度（P=0.030）、C3的免疫荧光强度（P=0.012）以及牛津评分的S（P=0.006）和T评分（P=0.039）方面MBL途径激活的患者损伤均更弱。通过以上的结果看来，似乎IgAN患者旁路途径激活的患者的部分临床指标和肾脏病理损伤更严重。这与文献报道的有一定的出入，但其中的原因还不清楚，这可能还需要通过检测其他同补体损伤的因子，更进一步的扩大样本及随诊分析来探讨。5.小结通过研究我们认为SIgA在IgAN中具有致病性，它有可能激活MBL途径和旁路途径，从而造成肾损伤；旁路途径激活的IgAN患者的部分临床指标如eGFR，和肾脏病理如肾小球硬化比例、C3的免疫荧光强度以及S、T评分较MBL途径激活的患者要严重，这还有待于进一步的验证和研究。24 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究现阶段对IgAN病因的研究主要侧重在2个方面，基因遗传学和免疫学异常，普遍认为这些异常最终导致的结果是，含多聚IgA1为主的免疫复合物沉积在肾小球系膜区，刺激系膜细胞，发挥致病性，如：促炎症促纤维化细胞因子生成，致细胞外基质增多，并作用肾小球的足细胞及小管上皮细胞，引起尿蛋[9,36]白及肾纤维化等，造成肾脏损伤。在本课题的前面两部分已经发现了SIgA能够沉积在IgAN患者的肾小球系膜区，有可能激活补体通路发挥致病性，并且有SIgA沉积患者的临床病理特征与其他类型的IgA沉积的患者不完全相同。那么SIgA是否也可以通过作用系膜细胞而发挥致病性呢？同多聚IgA致病性是否相同呢？目前国际上仅有一项相关研究，即Oortwijn等的发现，商品化的SIgA能与人系膜细胞结合，且SIgA刺[13]激人系膜细胞后，可以促进其分泌白介素（interleukin，IL）-6，提示SIgA有可能通过活化系膜细胞，从而参与肾脏的损伤。为了研究上述问题，进一步明确SIgA具体的肾脏损伤机制，本课题在首次提纯了IgAN患者的SIgA，并刺激人系膜细胞，首次多角度探讨了SIgA对肾小球系膜细胞的生物学效应。1实验材料1.1细胞购买美国ScienCell公司的人原代系膜细胞（HumanRenalMesangialCells,HRMC)，编号4200。1.2实验主要试剂(1)Jacalin-agarose亲和层析柱料：Thermoscientific，美国(2)蜜二糖：Sigma，美国(3)凝胶过滤柱刻度试剂盒（28403842）：GEHealthcare，英国(4)牛血清白蛋白：北京索莱宝科技有限公司，中国25 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(5)吐温20（Tween-20）：北京化学试剂公司，中国(6)小鼠抗人SC单克隆抗体：Sigma，美国(7)兔抗人IgA多克隆抗体：Dako，丹麦(8)HRP标记的山羊抗兔IgG：北京中杉生物试剂公司，中国(9)人SIgA：Serotec,英国(10)羊抗人IgA多克隆抗体F(ab)’2片段：JacksonImmunoResearch，美国(11)单克隆小鼠抗人IgA1：Sigma，美国(12)山羊抗鼠IgG-HRP：Biolegend，美国(13)小鼠抗人IgA1单克隆抗体：AbDSerotec，美国(14)浓H2SO4：：北京化学试剂公司，中国(15)TMB显色液：北京康贝源责任有限公司，中国(16)分子量标准：Pierce26616，Thermo，美国(17)三羟甲基氨基甲烷（Tris）：Fluka，美国(18)丙烯酰胺溶液（30%）：北京普利莱基因技术有限公司(19)分离胶Tris缓冲液：北京普利莱基因技术有限公司(20)浓缩胶Tris缓冲液：北京普利莱基因技术有限公司(21)胎牛血清：Gibco，美国(22)胰蛋白酶：ScienCell,美国(23)青霉素、链霉素：ScienCell,美国(24)细胞冻存液：ScienCell,美国(25)系膜细胞培养基及系膜细胞生长因子：ScienCell,美国(26)RPMI1640培养基：Gibco，美国(27)CCK-8试剂盒：Dojindo，日本(28)细胞用PBS液：北京索莱宝科技有限公司，中国(29)人TGF-β1ELISA试剂盒：R&D，美国(30)人IL-6ELISA试剂盒：R&D，美国(31)人IL-8ELISA试剂盒：R&D，美国(32)人MCP-1ELISA试剂盒：R&D，美国(33)人TNF-αELISA试剂盒：R&D，美国(34)人FibronectinELISA试剂盒：R&D，美国(35)Trizol：Invetrogin，美国26 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(36)PrimerScriptRTreagentKit：TaKaRa，日本(37)LightCycler®480SYBRGreenIMaster：Roche，瑞士TM(38)mirVanaRNAIsolationKit：AppliedBiosystem，美国1.3实验主要设备ACTA-FPLCGEHealthcare，英国10KD、30KD超滤离心管SartoriusStedim，法国TMTMHiPrep16/60SephacrlS300HRGEHealthcare，英国层析空柱XK16columnGEHealthcare，英国混合纤维素酯微孔滤膜0.22μm上海兴亚净化器材，中国针头滤器0.22μmMilliporeS.A.公司，法国Nanodrop分光光度计ND-1000Thermo，美国HH·W21型水浴锅北京市长风仪器仪表公司聚苯乙烯96孔酶标板Costar，美国荧光定量PCR仪LC480ⅡRoche，瑞士PCR仪9700ABI，美国移液器Thermo公司，美国摇床TS-2000A型，麒麟医用仪器厂，中国二氧化碳细胞培养箱Thermo，美国超净工作台北京冠鹏净化设备公司22细胞培养瓶（25cm，75cm）Nunc,美国细胞培养板（96孔，6孔）Nunc,美国低温离心机Thermo公司酶标仪Model680型，BioRad,美国ImageQuantLAS4000miniGEHealthcare，英国27 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究1.4引物GenePrimerAccessionnumberGAPDHForward5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT3’NM_002046Reverse5’-CTCCACGACGTACTCAGCG3’/NM_001256799IL-6Forward5’-GTTGTTAATGGGCATTCCTT3’NM_000600Reverse5’-ATAGTGTCCTAACGCTCATAC3’IL-8Forward5’-TGAAGAGGGCTGAGAATTCATA3’NM_000584Reverse5’-GCAACCCTACAACAGACC3’MCP-1Forward5’-GACTAACCCAGAAACATCCAA3’NM_002982Reverse5’-GAATGAAGGTGGCTGCTAT3’TGF-β1Forward5’-ACTCATTCAGTCACCATAGCAA3’NM_000660Reverse5’-GCAGGAACTCCTCCCTTA3’TNF-αForward5’-ACCTGGGATTCAGGAATG3’NM_000594Reverse5’-AGATGTCAGGGATCAAAGC3’FibronectinForward5’-TTCAGAGACTGGGACGTTT3’NM_054034Reverse5’-CCACTTGAGCTTGGATAGG3’1.5实验液体配置1.5.1Jacalin亲和层析柱提纯液（所有提纯液均0.22μm滤膜过膜）28 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(1)A液(0.01MPBS)pH=7.4NaCl8.5gNa2HPO412H2O2.9g.NaH2PO42H2O0.3g去离子水1000ml(2)B液（洗脱液）蜜二糖3.602gA液100ml(3)20%乙醇无水乙醇200ml去离子水1000ml1.5.2S300凝胶过滤柱液体配置（所有提纯液均0.22μm滤膜过膜）(1)Washingbuffer（0.05mol/LPBS/0.15MNaCl）pH7.0NaCl8.77gNa2HPO412H2O14.507g.NaH2PO42H2O1.48g去离子水1000ml(2)Cleaningbuffer（0.2MNaOH）NaOH8g去离子水1000ml(3)20%乙醇无水乙醇200ml去离子水1000ml1.5.3酶联免疫吸附试验（ELISA）所用试剂(1)0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）29 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究NaHCO32.95gNa2CO31.08g去离子水900ml(2)0.01MPBS（pH7.4）NaCl8gNa2HPO412H2O2.9gKCl0.2gKH2PO40.26g去离子水1000ml(3)0.01MPBST0.01MPBS1000mlTween-201ml(4)1%BSA/PBS0.01MPBS100mlBSA1g(5)1%BSA/PBST0.01MPBST100mlBSA1g(6)1MH2SO4浓H2SO427.8ml去离子水500ml1.5.4Westernblot所用实验液体(1)SDS-PAGE缓冲液（pH8.3）Tris0.75gGlycine3.6gSDS0.75g去离子水250ml用浓HCL调至PH8.330 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(2)过硫酸铵溶液（APS）（10%）APS1g去离子水10ml(3)膜-胶快速染色液膜-胶快速染色液50ml甲醇50ml冰醋酸2ml(4)膜-胶脱色液甲醇50ml冰醋酸2ml去离子水48ml(5)SDS-PAGE分离胶（12%）分离胶Tris缓冲液2.5ml丙烯酰胺溶液（30%）4ml10%APS100μlTEMED8.3μg去离子水3.5ml(6)SDS-PAGE浓缩胶（4%）浓缩胶Tris缓冲液0.75ml丙烯酰胺溶液（30%）0.4ml10%APS20μlTEMED7.5μg去离子水1.9ml(7)转移缓冲液Tris0.6gGlycine2.88g甲醇40ml31 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究去离子水200ml用浓HCL调至PH8.3(8)TBST（PH7.5）NaCl9gTris1.211g去离子水1000ml用浓HCL调至PH7.5Tween-201ml(9)封闭液脱脂奶粉1gTBST50ml1.5.5系膜细胞TGF-β1表达检测缓冲液(1)1NHCl（过膜4℃保存）去离子水91.67ml浓HCl8.33ml(2)10NNaOH去离子水10mlNaOH4ml(3)1.2NNaOH/0.5MHEPES（过膜4℃保存）去离子水37.5ml10NNaOH6mlHEPES5.95g32 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究2方法2.1标本收集2.1.1唾液标本采集第一部分肾组织有SIgA沉积的患者唾液：患者晨起刷牙前，用矿泉水漱口，且避免饮水或饮食至少30min；给予患者无菌棉球，通过咀嚼分泌唾液约20-30ml/人，装入无菌容器内，用低温保温桶拿至实验室，进行低温（4°C）离心，4000g，15min，取上清于-80℃冰箱中保存。按上述步骤收集正常志愿者唾液，志愿者年龄及性别同上述患者匹配，并且无肝炎、肾病及近期无粘膜感染史。2.1.2血清标本随机选取第一部分IgAN患者10人，收集新鲜血标本10ml/人，4000g4℃离心15min，取上层血浆，放置-80℃冰箱中保存。同时选取上述留取唾液的健康志愿者血标本做对照。上述患者及志愿者在收集标本前均签订知情同意书。2.2Jacalin-agarose亲和层析柱的安装（1）洗柱料：取5ml×2immobilizedJacalin，用过膜去离子水洗3次，每次去除水都要等柱料沉于杯底，小心吸取上清液。（10ml柱料约用40ml过膜水），再用0.1MPBS洗一次，后将柱料浸泡在20%乙醇中；（2）装柱料：柱子（XK16）使用之前要用超净水冲洗，下面的滤网拆卸冲洗，安装柱子下部，用注射器缓慢注入A液，安装滤网，避免气泡。固定后上柱料，待柱料完全下沉后安装柱体上部，直至接近Jacalin柱料；（3）计算柱体积：测量最后装好的柱料高度，计算出一个柱体积约8ml；（4）压柱：连接FPLC仪器，按下列程序进行走液：A液：0.2ml/min，3个柱体积；0.5ml/min，3个柱体积；0.8ml/min，3个柱体积；1.2ml/min，3个柱体积；1.6ml/min，3个柱体积；（5）冲柱：20%过膜乙醇，1ml/min，3个柱体积。2.3提纯SIgA（1）提前将唾液上清标本从冰箱中取出，在4℃融化；（2）0.22μmMillipore滤器过滤，装入50KD的超滤离心管，4℃离心33 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究4000g×30min，将离心管上半部分管内的液体收集，用0.01MPBS按1:1稀释；（3）将FPLC仪器打开，先用A液冲A泵，B液冲B泵，然后连接安装好的Jacalin-agarose亲和层析柱及上样环；（4）用无菌注射器将稀释后的唾液上清注射入上样环：8ml/次；（5）设定程序（流速均为1ml/min）1)A液平衡柱5倍柱体积；2)上样8ml；3)A液平衡15倍柱体积（此时冲洗未与Jacalin结合的成分，而SIgA则与Jacalin结合未被冲走，UV280显示的波峰为穿过峰）；4)B液10倍柱体积（因B液的蜜二糖与Jacalin结合力更强，故将之前的SIgA洗脱下来，UV280显示的波峰为洗脱峰，2ml/管收集SIgA）；5)A液平衡柱子5倍柱体积；6)20%酒精过柱；7)收柱子。（6）从IgAN患者唾液提纯的SIgA收集到一起，既：P-SIgA；从正常志愿者唾液提纯的SIgA收集，称为N-SIgA；（7）将P-SIgA分次装入30KD的超滤离心管（基本倒满，约20ml），4℃离心4000g×40-60min，当上半部分的管内只有3-4ml液体时，将0.01MPBS装入离心管滤膜管到至20ml处，继续上述离心，共3次完成液体置换，即为SIgA的PBS液。N-SIgA处理步骤同上。2.4SIgA浓度的测定（1）抗人SC抗体包板：以0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液将小鼠抗人SC抗体稀释至5.1g/ml包被酶标板。抗原包被孔为只包被一半酶标板，非抗原包被孔为另一半只用碳酸盐缓冲液包被，以除外非特异结合。每一步每孔加样量均为100l，均为37℃孵育60min；（2）洗板：含0.1％Tween-20的0.01MPBSTpH7.4洗板3次；（3）封闭：应用含1%BSA/PBS封闭未结合位点，37℃孵育60min；（4）洗板：含0.1％Tween-20的0.01MPBSTpH7.4洗板3次；34 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究（5）加检测样品：加入应用1%BSA/PBST1：1000稀释的提纯SIgA液。每块酶标板均设空白及阳性对照，空白对照孔加入1%BSA/PBST，阳性对照孔加入用1%BSA/PBST稀释的人sIgA0.625g/ml。每份样品均设双抗原包被孔及双非抗原包被孔，37℃孵育60min；（6）加检测抗体：1：5000稀释的多克隆兔抗人IgA，100μl/孔，37℃孵育60min；（7）洗板：含0.1％Tween-20的0.01MPBSTpH7.4洗板3次；（8）加检测抗体：1：10000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃孵育60min；（9）洗板：含0.1％Tween-20的0.01MPBSTpH7.4洗板3次；（10）显色：显色前配好过氧化物酶底物显色液3',3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），A液与B液1：1混合(现用现配），100μl/孔，显色15-30min，待颜色最深的显色为深蓝色时即可终止；（11）终止：1MH2SO4100μl/孔终止反应；（12）酶标仪490nm读光密度值（OD值）；（13）标准曲线绘制及结果判定：每块酶标板均设空白及标准品，根据标准品OD值及对应浓度绘制标准曲线，计算样本SIgA浓度。2.5提纯的SIgA鉴定2.5.1SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(1)安装电泳槽的玻璃板，灌制12%电泳分离胶，上端灌入去离子水防止分离胶和空气接触，在室温使分离胶凝固；(2)小心倒去覆盖的去离子水，并用纸吸干；(3)均速在分离胶上加满浓缩胶，插上梳子，防止气泡，在室温放置直到浓缩胶凝固；(4)轻轻拔出梳子，用针头把加样槽修直，再倒入电泳缓冲液；(5)分别将商品化的SIgA、P-SIgA、N-SIgA与β巯基乙醇上样缓冲液（还原型）按4:1混合放100℃煮沸5分钟；(6)加样：分别加入分子量标准、商品化的SIgA、P-SIgA、N-SIgA，后三者均按4μg上样；35 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(7)进行凝胶蛋白电泳，恒定电压80mv，电泳时间约120min，随后取出凝胶，把上部分的浓缩胶小心切下扔掉；(8)小心将分离胶放入考马斯亮蓝快速染色液中，进行1小时的染色；(9)用脱色液多次脱色，直至胶为无色，可见蛋白的蓝色条带。2.5.2Western-blot方法(1)灌制2块凝胶，步骤同上述蛋白电泳的1）-5）；(2)加样：每块凝胶分别加入分子量标准、商品化的SIgA、P-SIgA、N-SIgA，后三者均按2μg/个上样；(3)进行凝胶蛋白电泳，恒定电压80mv，电泳时间约120min，随后取出凝胶，把上部分的浓缩胶小心切下扔掉；(4)取3张滤纸和2张硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜，裁剪和上述电泳后的分离胶大小完全吻合，把NC膜用转移缓冲液预先浸泡30min，将滤纸用转移缓冲液浸透；(5)将2块分离胶用转移缓冲液轻轻洗涤，放在NC膜上，挤出中间的气泡，上下各放置3张滤纸，并挤出气泡。使凝胶一侧为负极、NC膜一侧为正极进行电转，条件是200mA，100min；(6)小心取出这两张NC膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，室温60min并振摇；(7)将1张NC膜放入用5%脱脂奶粉TBST稀释的1.4g/ml的小鼠抗人SC溶液中，另一张放入用5%脱脂奶粉TBST稀释的1:2000的小鼠抗人IgA1溶液中，4℃过夜并振摇；(8)用TBST洗涤3次，每次10min；(9)用抗SC溶液孵育的NC膜放入用5%脱脂奶粉TBST1：10000稀释的辣根过氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP）标记的山羊抗小鼠IgG溶液中，在室温振摇共孵育60min，后洗涤10min（TBST）/次，共3次；(10)将两张NC膜用化学发光法显色，A也为鲁米诺发光液，B液为H2O2溶液，等体积混合均匀加在NC膜上，反应1min，用滤纸洗干NC膜上多余的发光液；(11)将NC膜置于GEImageQuantLAS4000化学发光成像分析仪中曝光显色并保存。36 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究2.6循环总IgA的提纯（1）提前将IgAN患者及正常人血浆从冰箱中取出，在4℃融化；（2）融化后的每个人血浆用0.01MPBS按1:1稀释，0.22μmMillipore滤器过滤；（3）将FPLC仪器打开，先用A液冲A泵，B液冲B泵，然后连接安装好的Jacalin-agarose亲和层析柱及上样环；（4）用无菌注射器将稀释后的血浆注射入上样环：8ml/次；（5）设定程序（流速均为1ml/min）（6）A液平衡柱5倍柱体积；（7）上样8ml；（8）A液平衡15倍柱体积（此时冲洗未与Jacalin结合的成分，而IgA则与Jacalin结合未被冲走，UV280显示的波峰为穿过峰）；（9）B液10倍柱体积（因B液的蜜二糖与Jacalin结合力更强，故将之前的IgA洗脱下来，UV280显示的波峰为洗脱峰，2ml/管收集IgA）；（10）A液平衡柱子5倍柱体积；（11）20%酒精过柱；（12）收柱子。（13）将提纯每个人的总IgA分次装入30KD的超滤离心管，4℃离心4000g×40-60min，超滤浓缩，并用A液15ml/次，洗涤3次去除蜜二糖，进行下一步分离。2.7循环总IgA的分离2.7.1S300凝胶过滤柱的冲洗(1)连接FPLC，0.5ml/min过膜蒸馏水冲柱0.5个柱体积（1个柱体积为120ml）；(2)1ml/minWashingbuffer冲柱2个柱体积。2.7.2S300凝胶过滤柱标准曲线绘制(1)1ml/minwashingbuffer冲柱1个柱体积；(2)0.5ml/min上样葡聚糖蓝（1.0mg/ml，1ml）计算V0体积（columnvoid37 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究volume）=上样时到葡聚糖蓝峰值时的体积；(3)0.5ml/分钟上样分子量marker（凝胶过滤柱刻度试剂盒）：0.2mlOvalbumin+0.15mlConalbumin+0.2mlAldolase+0.15mlFerritin+0.25mlThyroglobin+0.05mlwashingbuffer记录各个蛋白的Ve（洗脱体积elutionvolumn）=上样时到蛋白峰值时的体积。分子量marker的洗脱峰值如图1：(4)0.5ml/minCleaningbuffer洗柱1.5个柱体积；(5)1ml/minwashingbuffer冲柱至少2个柱体积；(6)0.5ml/min20%乙醇冲柱1.5个柱体积，收柱保存；(7)绘制曲线：Kav=(Ve-Vo)/(Vc-Vo)；X轴—logMt，Y轴---Kav（Mt：分子量molecularweight）。标准曲线绘如图2所示。根据样品蛋白洗脱峰值Ve计算样本分子量。2.7.3S300凝胶过滤柱分离提纯循环IgA(1)1ml/min，washingbuffer冲柱1个柱体积;(2)0.5ml/min上样1.2~2ml（样本为浓缩的上一步骤中提纯的总IgA）。washingbuffer0.5ml/min洗脱样本，收集洗脱液体2ml/管.洗脱共2个柱体积（根据峰值可以计算Ve，并根据标准曲线计算分子量）将每一波峰蛋白分别用30KD超滤离心管浓缩，并用0.01MPBS液置换溶液3次，-80℃保存待用。(3)收柱保存：0.5ml/minCleaningbuffer洗柱1.5个柱体积，1ml/minwashingbuffer冲柱2个柱体积；0.5ml/min过膜水洗柱4个柱体积，0.5ml/min20%乙醇冲柱4个柱体积，收柱保存。(4)样本的蛋白的洗脱峰值显示如下：根据标准曲线计算P1、P2、P3、P4对应的分子量分别为：918、472、174、72。其中主峰P3为mIgA，P1和P2混合，为pIgA。从IgAN患者血浆提纯的pIgA收集到一起，称为：P-pIgA；从正常人血浆提纯的pIgA收集，称为N-pIgA；2.8pIgA浓度的测定(1)抗人IgA抗体包板：用0.05M的碳酸盐缓冲液（PH9.6）将羊抗人IgA多克隆抗体F(ab)’2稀释到2.5g/ml包被酶标板。每孔加样量均为100l，4℃孵育过夜。38 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(2)洗板：0.01MPBSTpH7.4洗板5次；(3)加待检测的样品：待测样品血清用1%BSA/PBST1:32000稀释，浓缩的pIgA1:10000稀释，标准品稀释方法为：1:4000~1:256000倍比稀释，并设阴性对照孔；每孔加样量均为100l，37℃孵育1.5h；(4)洗板：0.01MPBSTpH7.4洗板5次；(5)加检测抗体：使用1:25000稀释的单克隆抗人IgA1，加样量均为100l/孔，37℃孵育2h；(6)加入辣根标记的抗体：PBST洗板5次，1：5000稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，100l/孔，37℃孵育45min；(7)洗板：0.01MPBSTpH7.4洗板5次；(8)显色：加入TMB，A液与B液1：1混合，100l/孔，避光显色30min;(9)终止：用1MH2SO4100μl/孔终止反应；(10)读数：酶标仪450nm/570nm读光密度值（OD值）；(11)标准曲线绘制及结果判定：每块酶标板均设空白及标准品，根据标准品OD值及对应浓度绘制标准曲线，计算样本pIgA浓度。2.9细胞的培养（1）培养：购买人原代HRMC，用系膜细胞培养液（mesangialcellmedium，MCM）培养，并在培养液中加有2%系膜细胞生长因子，5%的胎牛血清，青霉素G（100U/ml）及链霉素（100U/ml）。放置37℃，5％CO2细胞培养箱中；（2）换液：每24-48h更换培养液一次，并在倒置显微镜下观察细胞状态，细胞生长处于对数生长期，融合度达70-80%时收集细胞；2（3）消化传代：75cm培养瓶用37℃预热的PBS缓冲液3-4ml轻轻冲洗细胞3次,而后加入0.125%胰酶lml消化细胞，放置37℃培养箱约100s，取出培养瓶放置在倒置显微镜下观看：细胞回缩、变圆、细胞间隙变大并处于流动状态时终止消化，立即加入含有血清的MCM6ml，中和胰酶，予以反复吹打细胞成单细胞悬液后，将其均匀分在3个培养瓶中，并增加培养液10ml/瓶，放置培养箱中培养，将HRMC培养至第4-5代，在5-7代内完成细胞实验的检测；39 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究（4）冻存：暂不用的细胞用胰酶消化，吹打下来，至离心管，900g×5min，弃去上清液，加入冻存液，吹打均匀，按3×10^6-1×10^7/ml放入冻存管，1-1.2ml/管，做好标记，按阶梯冻存程序，最后放入液氮罐，以便后续实验使用；（5）本部分的细胞实验至少重复3次。2.10SIgA和pIgA刺激HRMC增殖率的检测5（1）铺96孔板：将HRMC用胰酶消化、吹打下来，按1×10个/ml加入96孔板内，100μl/孔，共铺3个板，进行培养；（2）G0化：贴壁后弃去上清MCM，用0.01MPBS小心清洗，换为无生长因子、无血清的MCM（G0培养基），培养24小时，使细胞转为G0期；（3）加刺激：3个96孔板，标记为A、B、C，分别表示：A-刺激12h，B-刺激24h，C-刺激36h。又将每个96孔板细胞分为5组（3个复孔/组），弃去原培养液，孔内分别加入各组的刺激蛋白。分别是：1.P-SIgA组：加入纯化的P-SIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；2.N-SIgA组：加入纯化的N-SIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；3.P-pIgA组：加入纯化的P-pIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；4.N-pIgA组：加入纯化的N-pIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；5.对照组（Control）：加入G0培养基100μl/孔；（4）CCK-8（CellCountingKit-8assay）试剂盒检测增殖率：上述96孔板在刺激12h时将A板取出，刺激24h时将B板取出，刺激36h时取出C板，按下列步骤检测读数：1)弃去上清液（防止刺激蛋白对CCK-8试剂的影响）；2)加入含CCK-8试剂的G0培养基（现用现配并避光，配置比例：10μlCCK-8试剂+100μlG0培养基），110μl/孔；3)设立空白：不加细胞，只加含CCK-8的G0培养液，110μl/孔；4)放置细胞培养箱避光孵育2h；5)在酶标仪450nm处，读数，记录吸光度（OD值）；（5）计算：按下列公式计算各组的增殖率（表达式3.1）。40 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究（3.1）2.11SIgA和pIgA刺激HRMC收集上清液和细胞6（1）铺6孔板：将第4-代细胞胰酶消化、吹打下来，按1×10个/ml加入6孔板内，1ml/孔，共铺3个板，5孔/板，进行培养；（2）G0化：贴壁后弃去上清MCM，用0.01MPBS小心清洗，换为无生长因子、无血清的MCM（G0培养基），培养24小时，使细胞转为G0期；（3）加刺激：3个6孔板，标记为A、B、C，分别表示：A-刺激12h，B-刺激24h,C-刺激36h。又将每个6孔板细胞分为5组（1个孔/组），弃去原培养液，孔内分别加入各组的刺激蛋白。分别是：1.P-SIgA组：加入纯化的P-SIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；2.N-SIgA组：加入纯化的N-SIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；3.P-pIgA组：加入纯化的P-pIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；4.N-pIgA组：加入纯化的N-pIgA，用G0培养基配成200μg/ml的浓度；5.对照组（Control）：加入G0培养基100μl/孔；（4）收集上清液：上述6孔板在刺激12h时将A板取出，小心将上清液全部吸出装入无菌1.5mlEP管中，并做好标记，放入4℃离心机，4000g，15min，取上清并分装，放置-80℃冰箱，用于下一步细胞因子浓度的检测。刺激24h时将B板取出，刺激36h时取出C板，步骤同上；（5）将24小时既B板的细胞用胰酶消化下来，用于检测各个细胞因子的mRNA。2.12HRMC中各个细胞因子的mRNA检测上面收集的细胞按下列步骤进行细胞因子IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白（monocytechemotacticprotein-1，MCP-1）、转化生长因子β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）和纤维粘连蛋白的信使RNA（messengerRNA，mRNA）检测。TM2.12.1细胞总RNA的提取（mirVanaRNAIsolationKit）41 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究以下操作均在冰上，将500μl的lysis/bindingbuffer加入上部分处理的细胞中,反复吹打混匀并振动使细胞裂解；按1/10的体积加入Homogenateadditive，充分混匀涡旋，放置在冰上10min；按裂解液（不计Homogenateadditive）相同的体积加入酚氯仿，进行混匀涡旋30-60min，离心（4℃，10000g）5min，若分相不好，则重新离心。把上层的水相放到新管中，并记体积；按照1.25倍体积加入100%乙醇，混匀涡旋；将样品放入一过滤柱中，下面接收集管，将上述混合液放入此柱中进行RNA吸附，10,000g离心15s，反复多次过柱，弃去滤过物；将350ulwash1加入，并离心（5-10s），清洗纯化拄（离心15s，10000g），弃过滤液。再将500ulwash2/3加入，并离心（5-10s），二次清洗纯化柱（离心15s，10000g），扔掉滤液，再离心1min；将离心柱放在新的收集管里，将100μL95℃预热的ElutionSolution加到柱中，最高转速离心20-30s（室温），将管中的液体收集，就是提取的总RNA，保存在-80℃冰箱。2.12.2逆转录取出冰箱存储的总RNA，室温下解冻，在0.2mlPCR管中配制逆转录反应体系，成分如下所示。总RNA0.5μgOligodT（50μM）0.5μlRandom6mers（100μM）0.5μlPrimerScriptBuffer5×2μlPrimerScriptRTEnzymeMixI0.5μlDEPC水加至10μlABI9700型PCR仪上37℃保温15min使逆转录反应完全后，85℃5s终止反应。加入90μlDEPC水稀释至100μl储存在-20℃冰箱，用于后续实验。2.12.3荧光定量PCR扩增使用荧光定量PCR检测法，使用材料1.4中各个细胞因子检测引物42 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究Forward，Reverse以及GAPDH检测引物Forward，Reverse，不少于6次重复。LightCycler®480SYBRGreenIMaster（2×）5μlForwardPrimer（10μM）0.2μlReversePrimer（10μM）0.2μlcDNA模板1μlDEPC水3.6μlTotal10μl扩增反应条件：使用两步法PCR扩增标准程序具体如下Stage1：预变性循环：195℃10minStage2：PCR反应循环：4095℃10s60℃30s(-ΔΔCt)结果mRNA的表达用Ct表示，既mRNA=2，其中ΔΔCt=[(Ct细胞因子-CtGAPDH)PATIENT-(Ct细胞因子-CtGAPDH)NORMAL]。2.13上清液各个细胞因子水平的ELISA试剂盒检测（按各试剂盒检测步骤）2.13.1IL-6水平表达的检测(1)稀释样本：1:50（用试剂盒的稀释液1×稀释）；(2)稀释标准品：5毫升稀释液（1×）溶解冻干品，轻轻振摇至少15分钟充分溶解，为300pg/ml，后在EP管中按下列浓度进行稀释标准品：300pg/ml、100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml、6.25pg/ml、3.12pg/ml，并设立空白对照；(3)加样：按100µl/孔，将稀释的样品、稀释的各标准品加入试剂盒中的微孔，设立空白对照（只加稀释液）；(4)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育2h；(5)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残43 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究液；(6)加二抗：酶标检测抗体Conjugate，200µl/孔；(7)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育2h；(8)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(9)加显色液：200µl/孔显色液A+显色液B（等体积混合，15min内使用）室温30min，避光；(10)终止：试剂盒的终止液50µl/孔，可轻拍使微孔颜色变均匀；(11)读数：在酶标仪450nm波长下读数，校正波长：540nm，30min内读取；(12)计算：根据标准品的浓度及OD值，制作标准曲线，根据ELISA软件计算各个样品的IL-6浓度。2.13.2IL-8水平表达的检测(1)稀释样本：1:40（用试剂盒的稀释液1×稀释）；(2)稀释标准品：5毫升稀释液（1×）溶解冻干品，轻轻振摇至少15分钟充分溶解，为2000pg/ml，后在EP管中按下列浓度进行稀释标准品：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.2pg/ml、15.6pg/ml，并设立空白对照；(3)加样：按100µl/孔，将稀释的样品、稀释的各标准品加入试剂盒中的微孔，设立空白对照（只加稀释液）；(4)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育2h；(5)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(6)加二抗：酶标检测抗体Conjugate，100µl/孔；封闭胶纸封住反应孔，室温孵育2h；(7)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(8)加显色液：200µl/孔显色液A+显色液B（等体积混合，15min内使用）室温30min，避光；(9)终止：试剂盒的终止液50µl/孔，可轻拍使微孔颜色变均匀；(10)读数：在酶标仪450nm波长下读数，校正波长：540nm，30min内读取；44 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(11)计算：根据标准品的浓度及OD值，制作标准曲线，根据ELISA软件计算各个样品的IL-8浓度。2.13.3MCP-1水平表达的检测(1)稀释样本：1:2（用试剂盒的用于细胞实验的稀释液1×稀释）；(2)稀释标准品：5毫升稀释液（1×）溶解冻干品，轻轻振摇至少15分钟充分溶解，为2000pg/ml，后在EP管中按下列浓度进行稀释标准品：2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml，并设立空白对照；(3)加样：按200µl/孔，将稀释的样品、稀释的各标准品加入试剂盒中的微孔，设立空白对照（只加稀释液）；(4)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育2h；(5)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(6)加二抗：酶标检测抗体Conjugate，200µl/孔；(7)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育1h；(8)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(9)加显色液：200µl/孔显色液A+显色液B（等体积混合，15min内使用）室温30min，避光；(10)终止：试剂盒的终止液50µl/孔，可轻拍使微孔颜色变均匀；(11)读数：在酶标仪450nm波长下读数，校正波长：540nm，30min内读取；(12)计算：根据标准品的浓度及OD值，制作标准曲线，根据ELISA软件计算各个样品的MCP-1浓度。2.13.4TGF-β1表达水平的检测(1)活化样本：100ul细胞上清液+20ul1NHCl混匀室温放置10min；加入20ul1.2NNaOH/0.5MHEPES混匀；(2)稀释标准品：在等待样本活化过程中配制，2毫升CaliDiluent（1×）稀释，轻轻振摇至少5min充分溶解为2000pg/ml，后在EP管中按下列浓度进行稀释标准品：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml，45 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究并设立空白对照；(3)加样：按50µl/孔，将活化的样品、稀释的各标准品加入试剂盒中的微孔，设立空白对照（只加AssayDilution1×）；(4)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育2h；(5)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(6)加二抗：酶标检测抗体Conjugate，100µl/孔；(7)封闭胶纸封住反应孔，室温孵育1h；(8)洗板：4次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(9)加显色液：100µl/孔显色液A+显色液B（等体积混合，15min内使用）室温30min，避光；(10)终止：试剂盒的终止液100µl/孔，可轻拍使微孔颜色变均匀；(11)读数：在酶标仪450nm波长下读数，校正波长：540nm，30min内读取；(12)计算：根据标准品的浓度及OD值，制作标准曲线，根据ELISA软件计算各个样品的MCP-1浓度。2.13.5纤维粘连蛋白表达水平的检测(1)稀释样本：1:80（用试剂盒的Assaybuffer1×稀释）；(2)稀释标准品：1300µl过膜去离子水溶解冻干品，轻轻振摇30分钟充分溶解，为20ng/ml，后在EP管中按下列浓度进行稀释标准品：20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.63ng/ml、0.31ng/ml，并设立空白对照（Assaybuffer1×）；(3)洗板：取出试剂盒微孔，先洗板2次，400µl/孔，用试剂盒的洗涤液（1×），最后一步拍干微孔中的残液；(4)加样：按100µl/孔，稀释的各标准品加入试剂盒中的微孔；按50µl/孔加入稀释的标本，然后在这些标本的微孔中再各加入50µlAssaybuffer1×，设立空白对照（只加Assaybuffer1×）；(5)生物素：每孔均加入稀释的生物素50µl；(6)封闭胶纸封住反应孔，室温2h，震动，频率400rpm；(7)洗板：6次，用洗板液400ul/孔，每次10-15s；46 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究(8)加二抗：每孔加100ul，稀释二抗（标记HRP）；(9)封闭胶纸封住反应孔，室温1h，震动，频率400rpm；(10)洗板：6次，用洗板液400ul/孔，每次10-15s；(11)显色：加显色液每孔100ul，避光，室温10min——多次观察板的颜色：最高标准品为蓝黑色时；或620nm读数最高标准品OD值0.9-0.95时则可终止；(12)终止：快速加入终止液，每孔100ul；(13)读数：在酶标仪450nm处读数（620nm矫正）；(14)计算：根据标准品的浓度及OD值，制作标准曲线，根据ELISA软件计算各个样品的纤维粘连蛋白浓度。2.14统计学分析所有的统计处理均采用SPSS17.0软件完成，作图采用GraphPadPrism6.0完成。计量资料采用均数±标准差表示，各组细胞增殖的数据以及各个细胞因子表达的数据之间比较均采用方差分析。P<0.05认为有统计学差异。3.实验结果3.1唾液SIgA的提纯结果经过Jacalin亲和层析柱提纯后，可见在UV280显示的A峰为穿过峰，为未与Jacalin结合的蛋白，B峰为洗脱峰，既经B液洗脱下来的之前与Jacalin结合的SIgA（图3.1）。47 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究图3.1唾液SIgA的Jacalin亲和柱色谱图3.2提纯SIgA的鉴定结果不论从IgAN患者还是正常人唾液经Jacalin提纯的SIgA，煮沸后经过蛋白电泳分为3个条带：SC（75kDa）、IgA重链（56kDa）和IgA轻链（23kDa），同商品化SIgA位置基本相同，无杂带（图3.2A）；经Westernblot检测更进一步验证了SC（图3.2B）和IgA（图3.2C）。图3.2提纯的SIgA蛋白电泳及Westernblot的鉴定通道1：来源于IgA肾病患者的纯化SIgA，通道2：正常人体内提纯的SIgA，通道3：商品化的SIgA。A：SIgA经蛋白电泳分为3个条带：75、56及23kDa；B：Westernblot检测分泌片段(75kDa)；C:Westernblot检测IgA重链(56kDa)。48 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究3.3循环IgA的提纯结果3.3.1循环总IgA的提纯结果经过Jacalin亲和层析柱提纯后，可见在UV280显示的A峰为穿过峰，为未与Jacalin结合的蛋白，B峰为洗脱峰，既经B液洗脱下来的之前与Jacalin结合的IgA（图3.3）。图3.3循环IgA的Jacalin亲和柱色谱图3.3.2循环总IgA的分离（1）S300分子筛凝胶过滤柱分子量marker洗脱结果如图3.4所示：A-E洗脱峰对应的分子量从左到右依次为669kD，440kD，158kD，75kD及44kD。49 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究图3.4S300分子筛凝胶过滤柱分子量marker洗脱（2）循环IgA的S300分子筛洗脱结果根据S300分子筛凝胶过滤柱分子量marker洗脱结果对应的分子量，可见血循环中还有多聚体IgA既pIgA（A峰），和单体IgA（B峰）图3.5循环IgA的S300分子筛洗脱图50 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究3.4纯化的SIgA和pIgA刺激HRMC增殖率的检测结果从IgAN患者唾液提纯的SIgA（P-SIgA）、正常人唾液提纯的SIgA（N-SIgA）、IgAN患者血中提纯的pIgA（P-pIgA）及正常人血中提纯的pIgA（N-pIgA）在200µg/ml均能刺激HRMC增殖，并且在刺激12h、24h和36h，P-SIgA对细胞的增殖作用明显强于N-SIgA（P<0.05），P-pIgA对细胞的增殖作用明显强于N-pIgA（P<0.05）。并且我们还观察到，P-pIgA对细胞的增殖作用是明显强于P-SIgA的（12h：P<0.05，24h和36h：P<0.001）（详见图3.6）。图3.6提纯的SIgA和pIgA刺激HRMC增殖情况#*:P<0.001,:P<0.05,NS:P>0.053.5纯化的SIgA和pIgA(200µg/ml)刺激HRMC，分泌各个细胞因子mRNA和蛋白水平表达的情况3.5.1IL-6（1）mRNA的表达（刺激24h）：在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC表达IL-6mRNA的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），是1.6倍；同样在pIgA中，P-pIgA51 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），是2.3倍；并且P-pIgA刺激HRMC表达的作用是P-SIgA的1.8倍（P<0.001）。（2）蛋白水平的分泌：在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC分泌IL-6的作用明显强于N-SIgA（12h：P<0.05，24h、36h：P<0.001），其中P-SIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-SIgA的1.7、2.0和2.1倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（都是P<0.001），其中P-pIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-pIgA的1.6、1.6和1.5倍；并且P-pIgA刺激HRMC表达的作用明显大于P-SIgA的作用（都是P<0.001），在孵育12h、24h和36h时P-pIgA的作用分别是P-SIgA的4.5、2.8和1.9倍。图3.7提纯的SIgA和pIgA刺激HRMC表达IL-6的情况#*：P<0.001，：P<0.05，NS：P>0.053.5.2IL-8（1）mRNA的表达（刺激24h）在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC表达IL-8mRNA的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），是1.5倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），是1.4倍；并且P-pIgA刺激HRMC表达的作用是P-SIgA的2.5倍（P<0.001）。52 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究（2）蛋白水平的分泌在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC分泌IL-8的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），其中P-SIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-SIgA的3.7、1.6和3.3倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），其中P-pIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-pIgA的1.4、1.4和1.5倍；最终P-pIgA刺激HRMC表达的作用是最明显的（P<0.001），其中在孵育12h、24h和36h时P-pIgA的作用分别是P-SIgA的4.7、3.5和1.2倍。图3.8提纯的SIgA和pIgA刺激HRMC表达IL-8的情况#*：P<0.001，：P<0.05，NS：P>0.053.5.3MCP-1（1）mRNA的表达（刺激24h）在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC表达MCP-1mRNA的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），是2.0倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），是2.1倍；P-pIgA刺激HRMC表达的作用同P-SIgA的作用相似（P>0.05）。（2）蛋白水平的分泌在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC分泌MCP-1的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），其中P-SIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-SIgA的1.7、2.0和1.7倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强53 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究于N-pIgA（P<0.001），其中P-pIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-pIgA的1.2、2.0和1.9倍；P-pIgA刺激HRMC表达的作用在孵育12h时是P-SIgA的1.2倍（P<0.001），其他时间作用相似（P>0.05）。图3.9提纯的SIgA和pIgA刺激HRMC表达MCP-1的情况#*：P<0.001，：P<0.05，NS：P>0.053.5.4TGF-β1（1）mRNA的表达（刺激24h）在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC表达TGF-β1mRNA的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），是2.1倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），是2.4倍；P-pIgA刺激HRMC表达的作用同P-SIgA的作用相似（P>0.05）。（2）蛋白水平的分泌在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC分泌TGF-β1的作用明显强于N-SIgA（12h、36h：P<0.05，24h：P<0.001），其中P-SIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-SIgA的1.3、1.3和1.2倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（12h、36h：P<0.001，24h：P<0.05），其中P-pIgA在孵育12h、24h和36h时的作用都是N-pIgA的1.3倍；P-pIgA刺激HRMC表达的作用在孵育12h时是P-SIgA的1.3倍（P<0.001），其他时间作用相似54 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究（P>0.05）。图3.10提纯的SIgA和pIgA刺激HRMC表达TGF-β1的情况#*：P<0.001，：P<0.05，NS：P>0.053.5.5纤维粘连蛋白（1）mRNA的表达（刺激24h）在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC表达纤维粘连蛋白mRNA的作用明显强于N-SIgA（P<0.001），是1.8倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），是1.5倍；并且P-pIgA刺激HRMC表达的作用是最明显的（P<0.05），是P-SIgA的1.2倍。（2）蛋白水平的分泌在SIgA中，P-SIgA刺激HRMC分泌纤维粘连蛋白的作用明显强于N-SIgA（12h、24h：P<0.05，36h：P<0.001），其中P-SIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-SIgA的1.4、1.5和1.4倍；同样在pIgA中，P-pIgA刺激HRMC的作用也明显强于N-pIgA（P<0.001），其中P-pIgA在孵育12h、24h和36h时的作用分别是N-pIgA的1.3、1.3和1.2倍；并且P-pIgA刺激HRMC表达的作用是最明显的（P<0.001），其中在孵育12h、24h和36h时P-pIgA的作用分别是P-SIgA的2.4、1.7和1.2倍。55 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究图3.11提纯的SIgA和pIgA刺激HRMC表达纤维粘连蛋白的情况#*:P<0.001,:P<0.05,NS:P>0.054讨论系膜细胞在肾小球的系膜区，位于肾小球的内皮细胞和基底膜之间，具有收缩功能可以调节肾小球血液动力学如滤过系数和管-球反馈的变化，具有吞噬作用，能够吞噬残留在基膜上的大分子物质的沉积物。最为重要的是系膜细胞能分泌产生多种细胞因子，尤其在受到免疫损伤时会分泌促炎促增殖促纤维化因子，如：IL-6、IL-8、IL-1β、IFN-γ-inducibleprotein-10（IP-10）和纤维粘连蛋[53]白等。由于其内在的位置和表达各种功能的细胞因子的能力，系膜细胞在启动和介导肾小球损伤中起了关键作用。而系膜细胞的增殖是一个早期的病理改变特点，常见于多种形式的免疫介导的肾小球肾炎，如：IgAN、系膜增生性肾[54]小球肾炎和糖尿病肾病等。IgAN是免疫复合物导致的肾小球肾炎，其特征是IgA或IgA为主的免疫复合物沉积在系膜区，造成系膜细胞增殖，分泌基质及多种促炎促纤维化的细胞因子，如：IL-6、IL-8、IL-18、TGF-β、MCP-1、MIF和PDGF等等，介导免疫[55-57]损伤，并加剧疾病进展。IgAN的患者血清IgA水平均较高，同时研究发现[58]IgA的多聚体与单聚体的比例也明显增高。IgAN患者肾穿刺组织中，IgA沉56 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究积的形式主要为pIgA，并且pIgA在患者血清中的含量高低同穿刺肾组织的含量[59]高低具有明显的一致性。已有多项研究表明，这种IgA/IgA1多聚体可以刺激系膜细胞，引起增殖，并活化细胞分泌多种促炎促纤维化因子增多，但IgA的[56]单聚体则基本不能引起系膜细胞的活化作用。以上充分说明这种pIgA在IgAN致病中起了关键作用。我们通过Jacalin层析柱提纯IgAN患者血清中的总IgA，再经过分子筛S300就得到了pIgA即P-pIgA。当我们用pIgA刺激HRMC后，发现在刺激12h、24h和36h时均能引起细胞增殖明显（P<0.05），并且患者来源的pIgA（P-pIgA）对细胞的增殖作用明显强于正常人来源的pIgA（N-pIgA）（P<0.05）。另外，pIgA还可以活化HRMC分泌炎症因子IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白增多，同样是P-pIgA较N-pIgA刺激表达更明显（P<0.05）。为什么患者同正常人的pIgA对系膜细胞的生物学效应会有所不同呢？人类的IgA存在两种亚型：即IgA1和IgA2。二者的主要区别是，IgA1含有铰链区，因此具有O-糖基结构，而IgA2则没有。目前已经证实，沉积在肾小球系膜区的IgA主要来源于血清中的大分子IgA1，且患者血清IgA1分子的O－糖基化[42,60]缺陷（唾液酸或半乳糖的缺失)可能是IgAN发生发展的一个关键环节，也就是说，IgAN患者体内的糖基化缺陷的血清IgA1分子是导致IgAN的重要因子。这也许就是P-pIgA对HRMC的损伤作用更明显的原因，进一步验证了既往的实验研究。SIgA是粘膜免疫最重要的一种免疫球蛋白，由粘膜的B细胞分泌，主要分布在唾液、呼吸道、肠道粘膜及乳汁尤其是初乳中，在不同的粘膜部位，其含量也不同，在唾液中约为81μg/ml，肠消化液中约为97μg/ml，在血清中也发现[17,61-63]了少量的SIgA，但浓度较低：9–18μg/ml。迄今为止还未见提纯IgAN患者体内SIgA的报道。有研究表明IgAN中肾小球沉积的糖基化缺陷IgA部分是[63-65]来源于患者扁桃体的，唾液中的SIgA水平相对较高，能反映很多粘膜免疫系统的功能状态信息，并且患者的唾液较易留取，因此我们选取了IgAN患者的唾液，通过Jacalin亲和层析的方法进行提纯SIgA，并验证成功。我们前面部分中已经研究了粘膜免疫尤其是SIgA在IgAN发病中的重要作用。有理论认为IgAN中SIgA从粘膜分泌出来，可以部分弥散入血，并沉积在[13]系膜区。并有研究表明SIgA同人系膜细胞的结合力要明显强于IgA。那么SIgA与肾小球系膜细胞结合后，其对系膜细胞的具体生物学效应如何？目前国际上57 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究仅有一项相关研究，即Oortwijn等的研究发现，商品化的SIgA能刺激人系膜[13]细胞促进其分泌IL-6，提示SIgA有可能通过激活系膜细胞，从而参与肾脏的损伤。我们首次将提纯的IgAN患者SIgA刺激HRMC，发现在刺激12h、24h和36h时均能引起细胞增殖明显（P<0.05），另外，SIgA还可以活化HRMC分泌炎症因子IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β1和纤维粘连蛋白明显增多（P<0.05）。[66]IL-6是炎症起始阶段的一个重要致炎因子，也是一种自分泌的生长因子，它[67]还能促进细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）的生成，在外周血单核细[66,68]胞及系膜细胞中促进MCP-1的分泌；IL-8可以使中性粒细胞粘附到血管内[69]皮细胞，引起中性粒细胞的脱颗粒作用及活性氧代谢产物的释放；MCP-1是对单核细胞有趋化作用的细胞因子，在其作用下，单核细胞发生迁移并聚集在病变部位，在炎症反应中其主导作用，并可引起肾小管上皮损伤，诱导巨噬细[70]胞、T细胞、上皮细胞等分泌TGF-β和TNF-α。IL-6、IL-8和MCP-1均能诱[58,71,72]导系膜细胞增殖并在IgAN肾损伤中主要发挥促炎症作用。在众多促纤维化的因子中，TGF-β1被认为是最重要的促纤维化因子之一,它能增加ECM的合[72]成、抑制ECM的降解,引起肾小球硬化，并能促进肾小管凋亡，间质纤维化，它还是一种多功能的细胞因子，可以促进B细胞产生更多的IgA产物，在感染[73]损伤修复以及不同的免疫反应中起了一定的作用。纤维粘连蛋白是细胞外间质中的一种粘连糖蛋白，它在IgAN中可以同IgA形成IgA-纤维粘连蛋白复合物，[58,74]结合Ⅳ型胶原蛋白，在系膜区沉积，是系膜基质的组成成分；TGF-β1和纤[30,36,73,维粘连蛋白在IgAN中主要对ECM的累积以及肾脏纤维化起了重要作用75]。根据结果，SIgA或许通过刺激系膜细胞引起其增殖，并促使分泌上述促炎症促纤维化的因子，来发挥IgAN中肾损伤的作用。那么SIgA是如何介导这些生物学效应的呢？IgAN中研究发现IgA可以结合一些受体如CD89,Fcα/μR,多聚免疫球蛋白受体（thepolymericIgreceptor，pIgR),去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoproteinreceptor，ASGP-R),type1[1,30,74,76]transferrinreceptor(TfR1)和integrinα1/β1andα2/β1，以及激活TGF-[36,77-79]β/Smad或NF-κB信号通路等。但在这方面的致病机制还未见报道。我们将在本课题的第四第五部分对SIgA产生这些致病性的分子机制进行探索。另外，我们发现同pIgA作用相类似，P-SIgA对细胞的增殖作用明显强于N-SIgA（P<0.05），并且P-SIgA较N-SIgA刺激HRMC表达上述一系列细胞因子更明显（P<0.05）。这说明在IgAN患者体内的SIgA同正常人的结构是不同的。58 第三部分分泌型IgA对系膜细胞的生物学效应研究[80]有研究表明SC和J链均存在糖基，那么P-SIgA是否像IgA一样也存在糖基化异常的情况？这还需要进一步的检测研究。本部分结果中还有一件有趣的现象，IgAN患者体内提纯的SIgA刺激系膜细胞后，其增殖率及表达IL-6、IL-8和纤维粘连蛋白的作用均弱于P-pIgA刺激后。提示SIgA对系膜细胞的部分生物学效应要弱于IgA的作用。有研究在调查了1155名IgAN患者发现，有血尿的病人比无血尿的在肾损伤上具有较低的牛[37]津分型评分（M、S和T），并且预后好。结合本课题第一部分：有SIgA沉积的IgAN病人具有明显的感染史及血尿史，具有明显低水平的血清胱抑素C和β2微球蛋白，以及肾脏小管间质损伤和牛津分型的T评分均明显弱于无SIgA沉积的患者。那么，造成IgAN血尿患者预后好的原因或许是因为不同的IgA在肾组织的沉积。这还需要随诊及进一步的检测研究。5小结通过这部分研究我们发现SIgA具有刺激HRMC增殖和活化其生成促炎促纤维化细胞因子的生物学效应，IgAN患者来源比正常人来源的SIgA上述活化作用更强，并且SIgA与pIgA对HRMC的生物学效应是不完全相同的。SIgA或许通过这些生物学效应来发挥其在IgAN发病中的致病性。59 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证本课题第三部分研究发现，从IgAN患者唾液提纯的SIgA能使HRMC分泌多种促炎症促纤维化细胞因子，我们推测SIgA或许通过这些生物学效应来发挥其在IgAN发病中的致病性，那么SIgA是如何使HRMC释放这些炎症因子的呢？蛋白质是由mRNA转录及翻译的，而调控mRNA方面起了非常重要作用的是非蛋白质编码miRNAs。miRNAs是真核细胞内源性的非编码单链小分子，由大约21-23个核苷酸构成，参与转录后基因调控,可以特异性识别靶基因mRNA的3'非编码区（untranslatedregions，UTR），并与之结合引起靶基因的mRNA降解（常见于植物）或抑制其翻译（常见于哺乳动物）,对基因进行转录后表达的[11]调控,参与调节细胞的活动,具有重要的生理和病理意义。根据miRBase数据[81]库最新发布的数据显示，人类已发现超2000种miRNAs，故为了检验各个miRNA表达水平，高通量的miRNAs芯片检测成为首选。它可以囊括几乎所有成熟的人类miRNAs，并且具有所需样本量少、灵敏度高等优点。本部分首次利用提纯IgAN患者及正常人唾液的SIgA分别刺激HRMC后，提取细胞内miRNAs，进行miRNAs芯片杂交技术，进行分析比较，首次筛选了IgAN中同SIgA对人系膜细胞生物学效应有关的miRNAs，并进行验证。1.实验材料1.1细胞HRMC：来源于第三部分制备冻存。1.2引物如表4.1所示。60 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证表4.1用于qRT-PCR检测各miRNAs的引物61 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证62 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证1.2实验主要试剂(1)胎牛血清：Gibco，美国(2)胰蛋白酶：ScienCell,美国(3)青霉素、链霉素：ScienCell,美国(4)细胞冻存液：ScienCell,美国(5)系膜细胞培养基及系膜细胞生长因子：ScienCell,美国(6)细胞用PBS液：北京索莱宝科技有限公司，中国63 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证(7)Trizol：Invetrogin，美国TM(8)mirVanaRNAIsolationKit：AppliedBiosystem，美国(9)琼脂糖：Promega，美国(10)50×TBE：大连宝生物生物有限公司(11)DNA分子量MarkerDL2000：中国大连宝生物公司(12)Goldview核酸染料：北京赛百盛公司，中国(13)10×loadingbuffer：TaKaRa，日本(14)DEPC水：上海生工生物技术有限责任公司，中国(15)M-MLVReverseTranscriptase：Promega，美国(16)RNA酶抑制剂RI：TaKaRa，日本TM(17)SYBR®PremixExTaq：TaKaRa，日本(18)miRNeasy®MiniKit：QIAGEN，德国1.3实验主要设备AgilentHumanmiRNAs芯片3.0（8*60K）Agilent，美国芯片扫描仪AgilentScannerG2505CAgilent，美国杂交炉Agilent，美国NanoDrop分光光度计Thermo，美国低温小型离心机Eppendorf，德国低温大型离心机Thermo，美国Milli-Q系统纯水制备仪Millipore，美国电热恒温培养箱精宏实验设备超净工作台北京冠鹏净化设备公司二氧化碳细胞培养箱Thermo，美国倒置显微镜Leica，德国实时定量PCR仪7500ABI，美国64 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证2方法2.1miRNAs芯片检测2.1.1细胞的制备将第三部分所述将冻存的第4-5代的HRMC从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，立即在超净台中将冻存管中的液体吸出放入离心管中，并加入含血清的MCM，进行离心900g×5min，后弃去上清，加入含血清的MCM吹打均匀至培养瓶，放入培养箱中生长贴壁；加入P-SIgA（从IgAN患者唾液提纯）的HRMC称为PATIENT，加入N-SIgA（从正常人唾液提纯）则称为NORMAL，浓度均为200μg/ml；培养24h后，小心倒出培养液，用0.01MPBS清洗3次，加入0.125%胰酶l.5ml消化；在弃去消化液，放置37℃培养箱约100s，显微镜下观察细胞开始回缩、变圆，并且间隙变大开始流动时即刻加入4ml带血清的培养液终止消化；用一次性专用吸管吹打瓶壁，使其成为单细胞悬液；收集细胞至离心管内，900rpm离心5min（室温），弃去上面的培养液，准备提取总RNA。TM2.1.2细胞总RNA的提取（使用mirVanaRNAIsolationKit）同第三部分步骤2.12.1。2.1.3总RNA及芯片质量检测（1）细胞总RNA的质量控制1）细胞总RNA浓度和纯度取细胞总RNA样本溶液2ul用38ul无RNA酶水稀释20倍，并设定NanoDrop分光光度计的相应参数，以无酶水做为空白调零，在光度计上读取所测总RNA的浓度和纯度。若总RNA样本吸光度OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，说明提取纯度较好，无明显污染和降解。2）细胞总RNA的质量将0.60g琼脂糖放在50mlTBE溶液中，加热溶解，把2μl10mg/ml的溴65 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证化乙淀加入，充分混匀后倒入胶膜槽中，并插上梳子；静置30min（室温），等琼脂糖凝胶凝固后轻轻拔掉梳子，将制备好的凝胶放进装有0.5×TBE的电泳缓冲液（经高温高压灭菌）的水平电泳槽里；上样—取上述配好的总RNA样本溶液5μl+上样缓冲液(6×)lμl，混匀加到上样孔里，90V恒压电泳20min；将电泳后的凝胶置于紫外仪下观察，若提取的总RNA无明显污染和降解，完整性好，可用于后续实验。（2）芯片质量控制芯片的质控标准使用CV参数，即代表重复性探针变异系数，值越小，实验精度越高。Agilent公司一般建议为小于15%为质控合格。2.1.4芯片杂交(1)取100ng总RNA，定容至2μl；(2)去磷酸化：配制去磷酸化混合液（按所示的顺序）：CIPMasterMix1×9×CalfInterinalPhosphataseBuffer（10×）0.4µl3.6µlLabelingSpike-In1.1µl9.9µlCalfIntestinalPhosphatase0.5µl4.5µlTotal2µl18µl(3)PCR仪反应：条件37℃，30min（若不进行下列反应，可置于-80℃冰箱保存）。(4)样品变性：加入2.8μl100%DMSO到每管样品中，离心混匀；在PCR仪中置入上述混合液，100℃，7min；迅速冷却，放入冰水浴。(5)连接标记：1)37℃孵育T4RNALigaseBuffer（10×），间隔涡旋，全部溶解沉淀，冷却室温备用；2)配制连接反应混合液，如下表所示：LigationMasterMix1×9×66 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证Cyanine3-pCp3µl27µlT4RNALigase0.5μl4.5µl10×T4RNALigaseBuffer1µl9µltotal4.5μl40.5µl注：上述反应液在使用前配制，放在冰上，并15min内使用；3)PCR反应：16℃温育2h；4)标记后RNA纯化：PurifylabeledRNAremoveto2mltube1000g2minremoveto1.5mltube加38.7μlRFwatertosample到50µl1000g4mincloseto50μl5)纯化后样品抽干：45℃浓缩1h；将抽干的样品重新溶解在无RNA酶的去离子水（17μl）中。6)准备GEBlockingAgent（10×）:在冻干的GEBlockingAgent（10×）管中加入125μl无RNA酶的去离子水，轻微涡旋，直至完全溶解，必要时置37℃孵育4-5min；稍离心，予以备用，可在-20℃放置2个月。7)准备杂交反应：配置反应体系：HybridizationMixHybSpike-In1µlsample17µl2×Hi-RPMHybridizationBuffer22.5µlGEBlockingAgent（10×）4.5µltotal45µl反应条件：100℃，5min，后为冰水混合物：5min；上芯片，20rpm滚动杂交，20h，55℃；67 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证(6)芯片洗涤1)取出芯片在洗液1中洗涤5min；2)再将芯片放在洗液2中37℃，洗涤5min；(7)芯片扫描在扫描仪中放入芯片AgilentScannerG2505C（AgilentTechnologies），并设置参数扫描并记录保存数据。标记两张芯片为PATIENT和NORMAL同相应细胞来源的RNA相对应。2.1.5芯片数据分析使用FeatureExtraction软件（version10.7.1.1，AgilentTechnologies）处理原始图像提取原始数据。应用Genespring软件（version12.5）进行标准化和后续处理。将数据转化为log以2为底的对数，在二维直角坐标系平面中，绘制散点图，用于评估两组数据总体分布集中趋势。对标准化后的数据，比较的每组样本中至少有一组100%标记为“Detected”的探针留下用于后续分析。进行差异性miRNA筛选，标准为上调或者下调，且倍数的变化值≥2.0。2.2qRT-PCR检测筛选的差异miRNAs表达2.2.1总RNA重复本部分步骤2.1.1和2.1.2提取总RNA。2.2.2总RNA反转录合成cDNA使用stem-loop法进行miRNAs的验证检测。（1）反应体系如下:总RNA模板1.0µgdNTPs（10mM）0.5µlStem-loopRTPrimer（500nM）1.0µl5×RTBuffer2.0µlM-MLV逆转录酶（200µ/µl）1.0µlRNaseinhibitor（40U/µl）0.25µl加DEPC水至10µl68 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证（2）逆转录反应：使用前小心混匀并短暂离心,反应条件16℃，30min；42℃，60min；85℃，5min，将逆转录反应体系放入设置好的PCR扩增仪，开始逆转录反应。反应结束后，进行后续试验，或-20℃保存。2.2.4Real-timeRTPCR检测miRNAs的表达水平（1）将上一步所得产物于冰上融冻，将无RNA酶EP管置于冰上并加入如下试剂（表2.6），制备PCR反应体系：TMSYBR®PremixExTaq2×25μl10μMForwardPrimer1μl10μMReversePrimer1μlcDNA模板（稀释10倍）4μlROXReferenceDyeⅡ1µl加DEPC水至50µl（2）将PCR反应体系置于Real-timePCR内，设置仪器反应条件：95℃预变性10min；95℃变性5s，60℃退火和延伸34s循环：40；绘制熔解曲线：70℃-95℃。-△Ct（3）结果计算：应用相对定量的方法，选择U6作为内参，数据采用2法进行分析，其中△Ct=(CtmiRNA-CtU6)。2.3统计学方法芯片结果在2.1.5芯片数据分析中讲述，qRT-PCR的数据结果使用统计软件（SPSS17.0）进行分析，正态分布的两组miRNAs之间的数据差异用t检验分析，P<0.05时认为差异有统计学意义。69 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证3结果3.1质量检测结果3.1.1细胞总RNA的总量和质控总RNA（HRMC）提取纯化后，用紫外分光光度计测定A260/A280，结果显示PATIENT和NORMAL两种细胞提取的总RNAA260nm/A280nm比值都大于1.9，说明无蛋白残留（表4.2）；琼脂糖凝胶电泳图显示28S、18S和5S三条带清晰（依次表示rRNA、tRNA和mRNA），且28S和18S的亮度比接近2:1，说明RNA无降解，无DNA污染（图4.1）；两种细胞总RNA完整性数值（RIN:RNAInteghtyNumber）均为10.0，符合芯片杂交的要求(表4.2，图4.1)。表4.2PATIENT和NORMAL细胞总RNA质检结果样本编号浓度(µg/µl)A260/A280体积(µl)总量（µg）28S/18S结果NORMAL0.42041.91208.41.9合格PATIENT0.34791.91207.01.8合格注：质检参考指标质检情况28S/18S2100RIN合格≥0.7≥7.0部分降解（1）28S/18S<0.72100RIN≥7.0部分降解（2）——6.0≤2100RIN＜7.0降解——＜6.0(a）70 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证(b)图4.1PATIENT和NORMAL细胞总RNA质量分析图图a为PATIENT和NORMAL细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳图，28S/18S≥0.7，完整性好，无明显污染和降解；图b显示细胞总RNA28S和18S条带的峰值图，1000nt-4000nt之间有2个峰，1900nt处为18S峰，4700nt处为28S峰，RINS≥7。3.1.2芯片质控结果芯片杂交结果显示其CV参数,即代表重复性探针变异系数，均小于15%，为质控合格，见表4.3。表4.3芯片杂交结果评估样本编号芯片号荧光标记CV（%）结果NORMAL111784-1cy37.79成功PATIENT111784-2cy37.08成功注：Cy3：Cyanine-3-CTP3.2PATIENT和NORMAL细胞microRNAs的差异性筛选3.2.1芯片杂交图像AgilentmicroRNA微阵列芯片使用U6作为内参，每张芯片都有质量控制点。杂交的结果中，每一个miRNA都有3个点阵相对应，所以单次的结果即可保证杂交结果的可靠性。芯片杂交扫描图见图4.2。图4.2miRNAs芯片杂交扫描图71 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证（左图：PATIENT的microRNAs与芯片杂交扫描图；右图：NORMAL的microRNAs与芯片杂交扫描图）3.2.2芯片杂交散点图散点图4.3中，每个点表示芯片上的探针点，该点在图上的位置由其X轴坐标和Y轴坐标确定。图4.3散点图(scatterplot)。X轴：该点在NORMAL芯片中标准化以后的信号值。Y轴：该点在PATIENT芯片中标准化以后的信号值。3.2.3差异性表达的microRNAs筛选根据方法中所述标准，筛选出17个表达水平有显著差异的microRNAs；其中变化趋势（Regulation）用up和Down表示,Up表示在PATIENT细胞中是高表达,在NORMAL中低表达；Down则反之。有12个microRNAs在PATIENT中低表达，5个microRNAs在PATIENT中高表达。（见表4.4）72 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证表4.4差异性筛选的miRNAsmiRNAs_NameFCAbsoluteRegulationchrMirbaseAccessionNo.hsa-miR-3613-3p12.07899downchr13MIMAT0017991hsa-miR-223-3p6.062048downchrXMIMAT0000280hsa-miR-1237-3p5.979005downchr11MIMAT0005592hsa-miR-5635.945993downchr3MIMAT0003227hsa-miR-100-3p5.658483downchr11MIMAT0004512hsa-miR-19b-1-5p5.579245downchr13MIMAT0004491hsa-miR-615-3p5.417756downchr12MIMAT0003283hsa-miR-16-2-3p5.348918downchr3MIMAT0004518hsa-miR-508-5p5.20174downchrXMIMAT0004778hsa-miR-877-3p5.124506downchr6MIMAT0004950hsa-miR-301b4.659726downchr22MIMAT0004958hsa-miR-490-5p4.093744downchr7MIMAT0004764hsa-miR-44992.014724upchr13MIMAT0019035hsa-miR-60762.134367upchr14MIMAT0023701hsa-miR-12462.277243upchr2MIMAT0005898hsa-miR-1224-5p2.628441upchr3MIMAT0005458hsa-miR-146a-5p3.630579upchr5MIMAT0000449FCAbsolute：指这种miRNAs在两种细胞内表达的倍数改变的绝对值，为PATIENTvsNORMAL；Regulation：PATIENT中的这种miRNA相对NORMAL中表达的趋势；chr：在染色体中的位置。3.2.4聚类分析筛查的结果的聚类分析使用Cluster3.0，差异的结果用树状图形表示。绿色表示表达降低，红色表示表达升高。(图4.4)73 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证图4.4PATIENT与NORMAL差异性miRNAs表达谱的聚类分析图3.3差异表达miRNAs的qRT-PCR验证以U6为内参，经过qRT-PCR验证，结果可见，上述筛选的12个下调的miRNAs趋势也为下调，并且同NORMAL相比有统计学差异（P<0.01：miR-3613-3p、miR-223-3p、miR-563、miR-100-3p、miR-19b-1-5p、miR-615-3p、miR-16-2-3p、miR-508-5p、miR-490-5p，P<0.05：miR-1237-3p、miR-877-3p、miR-301b，图4.5a）；5个上调的miRNAs中，趋势均为上调，大部分有统计学差异（P<0.01：miR-4499、miR-1246、miR-1224-5p，P<0.05：miR-146a-5p），只有miR-6076的PATIENT与NORMAL相比表达差异不明显，考虑在芯片中结果可能为假阳性（图4.b）。74 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证(a)(b)图4.5差异性表达miRNAs的qRT-PCR验证**：同NORMAL中该相应miRNA的表达量比较，P<0.01；*：同相应miRNA的NORMAL中的表达量相比较，P<0.0575 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证4讨论本课题前面部分已经证实，在IgAN中，SIgA可以沉积在肾组织，激活补体通路，参与肾脏的损伤，能够刺激HRMC增殖、活化，使其分泌促炎、促增殖、促纤维化等多种细胞因子，具有致病性。在对肿瘤的机制及致病靶点研究发现，非编码基因与肿瘤疾病的发生发展密切相关，特别是一类高度保守的非编码单链小RNA(microRNAs，miRNAs)，已成为肿瘤在临床诊断、分型、治疗[82]及预后等各方面的分子标志物，其作为肿瘤治疗的靶点已处于热门研究阶段。如果我们找到SIgA致病时调控的miRNAs，研究其作用靶点并加以干预，则有望减轻或阻止IgAN的进展。miRNAs是一种小的非编码RNA，通过与靶基因的mRNA3‘UTR碱基完全/部分配对，引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA翻译，来发挥生物学效应。miRNAs在物种进化中相对比较保守，动物，植物和真菌中发现其[83]表达具有严格的组织特异性和时序性。miRNAs在细胞生长和发育进程中起到[84]多种作用，包括调控发育，分化，凋亡和增殖等。miRNAs的生物合成需要复杂的蛋白系统，在核内先转录成最初产物既pri-miRNA，而后经过各种酶及辅助因子的作用剪切为22个核苷酸左右长度的双链，进入RISC中参与调控[85]mRNA。在哺乳动物中常常是miRNAs与靶基因mRNA的3’端UTR区呈不完全互补的结合，来抑制蛋白质翻译；在植物中常常是与靶位点完全或几乎完[86]全互补，通常在mRNA的编码区，引起靶基因mRNA的降解。每个miRNA可以调控多个靶基因，而几个miRNAs也可以共同作用同一个靶基因，这样形成复杂的调控网，精细地调控功能基因的表达。目前，只有很少一部分miRNAs的生物学功能得到阐明。在疾病中的调控是现在的热门。尤其肿瘤研究邻域，已经在研究将miRNAs作为某些诊断和预后标志物，甚至已有实验支持其模拟物或抑制物在体内应用，特异性靶向结合致病miRNAs的miRNAs调节剂，如[87,88]抗miRNA寡核苷酸（AMOs）和反义miRNA（antagomirs）等。miRNAs在肾脏疾病尤其是IgAN邻域也发挥着重要的调控作用（图4.6）。[89,90]如miR-148b是IgAl糖基化过程重要介导物质C1GALT1的首要调节因子；肾间质纤维化的IgAN肾脏miR-29c表达显著降低,经研究miR-29c的预测靶基因是参与肾间质纤维化的胶原α1链(COL2A1)和原肌球蛋白α1链(TPM1)，也就[91]是说miR-29c与COL2A1和TPM1的3’UTR区结合位点匹配；miR-200c在上76 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证[92]皮细胞间充质转分化和小管间质纤维化的进展起了重要作用；miR-192同肾小[92,球硬化程度明显相关，主要在TGF-β的信号通路及I型胶原表达的调节方面93]；下调miR-205可以降低肾小管上皮细胞内质网应激并且减轻miR-205介导[94][93]的上皮间充质细胞转分化；Wang等证实IgAN患者肾组织miR-146a和miR-155的含量显著高于健康人，肾组织和尿中miR-146a和miR-155的含量都与蛋白尿严重程度呈正相关，与GFR呈负相关。尿miR-146a同尿IL-1β,IL-6和肿瘤坏死因子（tumournecrosisfactor，TNF)的mRNA呈负相关，相类似的是尿[93]miR-155同尿IL-1β和TNF呈负相关。miRNAs在IgAN的研究邻域现今只是初步研究，还需要继续探索。在本课题的研究中，我们也发现了miR-146a在致病性SIgA刺激的HRMC中是高表达的，但其原因和HRMC中的致病靶基因仍需探索。图4.5：miRNAs在IgAN发病中的可能作用[引自SzetoCCandLiPK,NatRevNephrol.2014,May;10(5):250]表达谱分析是研究miRNAs功能的重要依据，研究表明其在生物不同发育阶段表达不同，而同一生物体内不同的组织器官中或者肿瘤同正常组织，它的77 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证分布也有明显的差别。对于miRNA整体水平的分析，可以识别生理病理过程中的关键调控点。但miRNAs很小，只有20多个碱基，前体和成熟miRNA同时[81]存在，并且人类现今已发现超2000种miRNAs，其表达的动态范围还很广。故为了检验各个miRNAs表达水平，高通量的miRNAs芯片检测成为首选。它可以囊括几乎所有成熟的人类miRNAs，并且具有所需样本量少、灵敏度高等优点。本实验应用的是AgilentHumanmiRNAs3.0芯片，具有以下优点：特殊的探针设计，只识别成熟miRNAs，可灵敏识别一个碱基差异，只需要100ng的总RNA，高重复探针既每个miRNA可重复20次。为进一步探讨IgAN患者SIgA导致HRMC活化、炎症因子释放的机制，我们将提纯的IgAN患者及正常人唾液的SIgA，分别用来刺激HRMC，提取细胞内miRNAs，进行miRNAs芯片杂交技术，并分析比较，PCR验证，发现了16种差异明显的miRNAs。而通过上述结果，我们认为可能在IgAN中SIgA通过影响系膜细胞中这部分miRNAs的下调及上调，来调控一系列的生物学效应，如系膜细胞增殖、促炎促纤维化因子的表达增强等，以发挥其在IgAN的致病性。芯片筛查结果有时也会存在个别假阳性，为了提高可靠性，我们在对两组细胞中的miRNAs芯片筛选的17个miRNAs，还进行了qRT-PCR的验证，发现趋势均相同，只有miR-6076的表达在两种细胞中差异不明显，其余差异均明显。这样就很大程度上降低了筛查结果的假阳性。目前对于这方面的研究国内外均未见相关报道。对这16个差异表达的miRNAs进行生物功能学方面的研究，靶基因预测，探讨SIgA在IgAN中的致病机制，就成为了当今研究的热点。本部分在芯片检测结果中发现miR-16-2-3p和miR-100-3p在致病性SIgA刺激的HRMC是低表达的，而且在Toll样受体介导的NF-κB信号通路中miR-16同多[95]种炎症因子的相关性大，miR-100同高致病性禽流感H5N2对小鼠肺部感染炎[96]症反应的调控有关，故我们将在第五部分中对miR-16-2-3p和miR-100-3p进行靶基因预测及调控研究。另外，本课题只应用了两组细胞的miRNAs进行比较，未行重复实验。由于在miRNAs芯片检测中，每个miRNA均至少重复3次，并且具有高灵敏的特点，因此本身既是小样本的精确实验，并且芯片分析完后还进行了3次qRT-PCR重复验证了结果，只检验出一个假阳性。78 第四部分与分泌型IgA致病性有关的microRNAs筛选及验证5小结本部分运用AgilenthumanmiRNAs芯片分析技术和qRT-PCR验证，筛查了同SIgA对系膜细胞生物学效应相关的miRNAs共16个；从而得到了一组可能与SIgA在IgAN中致病性有关的miRNAs，也说明SIgA在IgAN发挥致病性的机制中有miRNAs的参与。79 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制MiRNAs在IgAN的发病机制中起了越来越显著的作用。并且部分miRNAs的改变具有特异性，可能作为IgAN诊断和监测疾病进展的生物标志物。在第四部分我们将IgAN患者及正常人唾液中提纯的SIgA刺激HRMC后，用miRNAs芯片杂交技术筛选并验证了两组细胞内差异性表达的miRNAs共16个。但由于在SIgA的致病性中，对miRNAs的作用方面迄今为止国内外还未见研究报道，因此我们根据SIgA可以刺激HRMC分泌多种促炎因子的生物学效应，并且miR-16-2-3p和miR-100-3p在患者SIgA刺激的HRMC中都是低表达的，以及miR-16家族和miR-100家族在炎症因子免疫反应中的作用，选取了芯片筛选结果中的miR-16-2-3p和miR-100-3p，进行与炎症因子相关的靶基因预测分析，研究致病性SIgA是否可以通过这两个miRNAs负向调控系膜细胞中炎性因子的释放，来发挥肾损伤作用。1实验材料1.1细胞1.1.1HRMC：来源于第三部分制备冻存，此部分实验中第5-6代内完成。1.1.2大肠杆菌DH5α：由Promaga公司提供。1.2载体pmirGLO（Promega公司）：报告基因载体，为新型的含双荧光素酶的miRNA靶表达载体。80 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制图5.1pmirGLO结构示意图1.3引物以下引物均由由上海生工生物技术有限公司合成。1.3.1IL-63’UTR区扩增引物(1)扩增引物：野生型IL-63’UTR区IL-6-Forward5’CAACTCGAGCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGT3’XhoIIL-6-Reverse5’ACCTCTAGACCACTTTCCATTATTATTTCAAAAC3’XbaI长度：256bp(2)扩增引物：突变型IL-63’UTR区1)扩增引物：突变型IL-63’UTR上半区IL-6-Forward5’CAACTCGAGCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGT3’IL-6M-Reverse5’CACATATTTAAATATTAATAAATTAAAAATAATTAAAATAGTGTC3’（IL-6-Forward+IL-6M-Reverse）扩增片段长度：161bp2)扩增引物：突变型IL-63’UTR下半区IL-6M-Forward5’TTAATTTATTAATATTTAAATATGTGAAGCTGAGTTA81 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制ATTTATGT3’IL-6-Reverse5’ACCTCTAGACCACTTTCCATTATTATTTCAAAAC3’（IL-6M-Forward+IL-6-Reverse）扩增片段长度：121bp3)扩增引物：突变型IL-63’UTR区全长IL-6-Forward5’CAACTCGAGCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGT3’XhoIIL-6-Reverse5’ACCTCTAGACCACTTTCCATTATTATTTCAAAAC3’XbaI长度：256bp1.3.2IL-83’UTR区扩增引物(1)扩增引物：野生型IL-83’UTR区IL-8-Forward5’ATACTCGAGATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTT3’XhoIIL-8-Reverse5’TGTTCTAGACATATTTACTTTTATATTTCCATAC3’XbaI长度：292bp(2)突变型IL-83’UTR区扩增引物1)扩增引物：突变型IL-83’UTR上半区IL-8-Forward5’ATACTCGAGATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTT3’IL-8M-Reverse5’TATATGATTCCTGAGTATAAAATGCAGTCATTTAAATAATATTAT3’（IL-8-Forward+IL-8M-Reverse）扩增片段长度：209bp2)扩增引物：突变型IL-83’UTR下半区IL-8M-Forward5’TTTATACTCAGGAATCATATATTTTTAACTTTAAGATGTTTTTAT3’IL-8-Reverse5’TGTTCTAGACATATTTACTTTTATATTTCCATAC3’（IL-8M-Forward+IL-8-Reverse）扩增片段长度：102bp3)扩增引物：突变型IL-83’UTR区全长IL-8-Forward5’ATACTCGAGATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTT3’XhoI82 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制IL-8-Reverse5’TGTTCTAGACATATTTACTTTTATATTTCCATAC3’XbaI长度：292bp1.3.3RT-PCR检测引物(1)IL-6mRNA表达检测引物Forward5’GTTGTTAATGGGCATTCCTT3’Reverse5’ATAGTGTCCTAACGCTCATAC3’(2)IL-8mRNA表达检测引物Forward5’TGAAGAGGGCTGAGAATTCATA3’Reverse5’GCAACCCTACAACAGACC3’(3)GAPDHForward5’TGTTGCCATCAATGACCCCTT3’Reverse5'CTCCACGACGTACTCAGCG3’1.4主要实验试剂T4DNA连接酶大连宝生物有限公司，中国限制性DNA内切酶XhoI大连宝生物有限公司，中国限制性DNA内切酶XbaI大连宝生物有限公司，中国DNA回收试剂盒北京天根生化科技有限公司，中国质粒小量提取试剂盒北京天根生化科技有限公司，中国基因组提取试剂盒北京天根生化科技有限公司，中国miRNAsMimic上海吉玛公司，中国miRNAsScramble上海吉玛公司，中国TAE缓冲液（50×）大连宝生物有限公司，中国随机引物6聚体Promega，美国琼脂糖Promega，美国蛋白分子量MarkerPromega，美国逆转酶AMVPromega，美国琼脂粉Promega，美国83 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制DNA分子量MarkerDL2000大连宝生物公司，中国Dual-Glo®LuciferaseAssayKitPromega，美国胰蛋白胨Oxoid，英国酵母提取物Oxoid，英国SOB培养基上海抚生生物科技有限公司，中国LB培养基北京诺博莱德科技有限公司，中国细胞用青霉素、链霉素ScienCell,美国系膜细胞培养基ScienCell,美国系膜细胞生长因子ScienCell,美国兔抗人IL-6单克隆抗体Abcam，美国兔抗人IL-8单克隆抗体Abcam，美国HRP标记的山羊抗兔IgG北京中杉生物试剂公司，中国1.5实验主要仪器报告基因荧光定量检测仪Promega，美国微量核酸、蛋白定量仪Thermo，美国紫外凝胶检测仪BIO-RAD，美国ABI7500fast实时荧光定量PCR仪ABI，美国电转仪系统BTX2001HarvardApparatus，美国凝胶数码图像处理系统BIO-RAD，美国化学发光成像分析仪GEHealthcare，英国全自动酶标仪BIO-RAD，美国PCR扩增仪Sensoquest，德国1.6实验液体配置Westernblot部分所用实验液体见第三部分1.5.4。84 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制2实验方法2.1miR-16-2-3p作用靶基因IL-6和miR-100-3p作用靶基因IL-8的预测依据第三部分实验结果，SIgA刺激HRMC可以分泌多种促炎因子（IL-6、IL-8、MCP-1和TGF-β1）的生物学效应，第四部分结果中发现miR-16-2-3p和miR-100-3p在致病性SIgA刺激的HRMC是低表达的，并且查阅文献发现这两种miRNAs家族在炎症因子免疫反应中起了一定的作用，故选取了芯片筛选结果中的miR-16-2-3p和miR-100-3p进行下一步对IgAN中SIgA致病机制的探索。使用目前最常用miRNAs靶基因预测数据库：TargetScan、picTar和miRanda，分别进行预测分析miR-16-2-3p和miR-100-3p是否能够与IL-6、IL-8、MCP-1和TGF-β1中某个炎症因子的调控区相结合。2.2野生型IL-63’UTR报告基因载体的构建2.2.1制备野生型IL-63’UTR目的基因(1)扩增野生型IL-63’UTR目的基因：以人基因组DNA作为扩增模板，使用野生型IL-63’UTR区扩增引物IL-6-Forward和IL-6-Reverse扩增得到目的基因。扩增体系：缓冲液（10×）3.0µl4×dNTP2.0µlIL-6Forwardprimer0.5µlIL-6Reverseprimer0.5µl人基因组DNA2.0µlTaq酶0.5µlDEPC水加至30µl扩增条件：预变性—94℃2min，变性—93℃45s，复性—55℃45s，延伸—72℃55s，扩增25个循环，最后5min末延伸。(2)扩增片段的酶切：取目的基因扩增产物，用XhoI和XbaI双酶切成粘末端，反应体系：缓冲液（10×）3µl扩增产物24µl85 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制XhoI1.5µlXbaI1.5µl反应条件：孵育—120min（37℃水浴），然后灭活内切酶—70℃（5min）。(3)目的基因纯化，使用DNA胶回收纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司)，回收纯化步骤按照说明书。1）首先计算EP管的重量；2）切下目的DNA条带，放入上述EP管中，用电子天平称量计算凝胶净重；3）捣碎凝胶，加入胶重量体积三倍的SolutionI，以及SolutionⅡ10μl；4）放入恒温水浴箱中加热15min（55℃），使凝胶完全融化，并且每3min摇EP管混悬一次；5）冷却至25℃，6000g离心120s（室温），弃去上清；6）加入500μlWashSolution，6000g离心120s（室温），弃去上清；7）重复上述步骤6）一次；8）再次6000g离心120s（室温），弃去液体残留；9）开盖干燥15min（室温），加入ElutionBuffer50μl，溶解10min（室温），得到纯化的DNA回收产物（既野生型IL-63’UTR）。2.2.2制备DH5α感受态细菌(1)将含15mMMgSO4的SOB培养基共50ml加入250ml规格的三角瓶中，按1:100接种冻存的菌液于SOB培养基；(2)200-250rpm震荡培养（37℃），约在2-4h当OD550为0.3-0.5时停止；(3)将摇菌瓶置冰水浴10min；(4)按照比例选用合适的离心管和加液体量，将菌液装入离心管，4000rpm10min（4℃），回收细菌，弃去上清；(5)将得到的细菌沉淀（约需50ml菌液），在15ml或约1/3体积的转化缓冲液（冰冷）中轻轻振荡重悬沉淀，把重悬细胞冰浴10min；(6)回收细菌4000rpm10min（4℃），弃去上清，把残留液体流尽；(7)用原菌液约5ml或1/10体积转化缓冲液（冰冷）轻轻振荡重悬沉淀；(8)置冰水浴加强感受态：按照比例为每1ml获得的菌液加35μlEnhancer；(9)在细菌悬液中加入Enhancer175μl，轻轻混匀，10min冰浴；(10)再次在其中加入175μlEnhancer溶液，轻轻混匀，冰浴5min；86 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制(11)立即使用或冻存在-80℃冰箱。2.2.3目的基因与载体pmirGLO的链接与转化(1)目的基因与载体pmirGLO的链接体系：T4Buffer（2×）5μl线性双粘载体pmirGLO1μlT4DNA连接酶1μl双粘目的片段1μlDEPC水加至10µl(2)反应条件：4℃，时间12h。(3)在连接完成后，将反应物在72℃水浴，反应时间10min，以灭活T4连接酶活性；(4)感受态DH5α细胞（上步制备）50μl+灭活的连接物溶液5μl，轻轻混匀，孵育30min（放置冰浴中）；(5)热休克45s：42℃的水浴；(6)快速冷却3min（在冰浴中）；(7)转移至37℃，加入不含抗生素的(LB)培养基600μl，震荡45min用于复苏培养，使细胞逐步开始表达抗生素抗性标记基因；(8)取上述转化的菌液100μl涂在含氨苄青霉素的LB平板，并于37℃培养。2.2.4重组载体酶切鉴定和测序鉴定(1)提取质粒：挑取少量菌苔（含重组质粒）接种于LB液体培养基(含Amp)，摇菌培养约16h（37℃）；使用质粒DNA提取纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取质粒DNA，步骤按照说明书具体如下：1）全部RNaseA溶液加入溶液A，摇匀；2）用取菌环挑取含有质粒的单菌落，放入培养基中，摇床300rpm震荡培养16h（37℃）；3）1.5mL离心管收集1-4ml上述的培养饱和菌液，12000rpm离心1min（室温)，离心，尽弃残留液体；4）溶液A250μl+RNaseA15μl混合，枪头充分吹打使菌体重悬，使用漩涡振荡器或Tip吸头吹打沉淀至完全混匀；87 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制5）添加溶液B250μl，反复混匀4-6次；6）加入溶液C350μl，反复混匀4-6次，冰上放置2min；7）12000rpm以上离心5min(室温)，将上清液移到离心吸附柱中;8)12000rpm离心1min（室温），弃去废液；9）将通用洗柱液500μl加入，离心1min（12000rpm，室温），弃去收集管中废液；10）重复上步骤1次；11）12,000rpm离心1min（室温），甩干残留液体；12）离心吸附柱放在新的1.5mLEP管中，加入65℃预热的DNA洗脱液30-100μl，放置2min（室温）。13）12,000rpm离心1min（室温），离心管底溶液即质粒DNA。(2)双酶切鉴定：鉴定野生型IL-63’UTR目的基因插入载体pmirGLO（XhoI和XbaI双酶切的方法）。酶切体系：缓冲液（10×）1µl重组质粒7µlXhoI1µlXBaI1µl反应条件：37℃水浴孵育120min；酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳照相记录结果。(3)测序鉴定：选取双酶切鉴定正确的转化阳性菌菌落摇菌，过夜培养，次日密封后送上海生工生物有限公司测序。检测插入序列与GenBank中公布的IL-6基因序列进行同源性比较和鉴定（采用DNASTAR等生物学软件）。2.3突变型IL-63’UTR报告基因载体的构建2.3.1突变型IL-63’UTR目的基因的制备通过overlapPCR扩增的方法：(1)扩增含突变IL-63’UTR基因上半区片段：用突变型IL-63’UTR上半区扩增引物IL-6-Forward和IL-6M-Reverse，通过PCR扩增出含突变IL-63’UTR基因上半区片段，具体方法同2.2.1。88 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制(2)扩增含突变IL-63’UTR基因下半区片段：用突变型IL-63’UTR上半区扩增引物IL-6M-Forward和IL-6-Reverse，使用PCR扩增出含突变IL-63’UTR基因上半区片段，具体步骤同2.2.1。(3)突变IL-63’UTR基因全长OverlapPCR扩增：用以上两步得到的含突变目的基因上半区片段和含突变目的基因下半区片段，以及突变型目的基因全长扩增引物IL-6-Forward和IL-6-Reverse同时做模板OverlapPCR扩增，具体组成同2.2.1。(4)酶切：同2.2.1(5)目的基因纯化：既突变型IL-63’UTR，步骤同2.2.12.3.2目的基因与载体pmirGLO的链接及转化具体步骤同2.2.3。2.3.3重组载体酶切鉴定和测序鉴定具体方法同2.2.42.4野生型IL-83’UTR报告基因载体的构建2.4.1野生型IL-83’UTR目的基因的制备(1)野生型IL-83’UTR目的基因扩增：使用方法中野生型IL-83’UTR区扩增引物IL-8-Forward和IL-8-Reverse扩增得到目的基因：缓冲液（10×）3.0µl4×dNTP2.0µlIL-8Forwardprimer0.5µlIL-8Reverseprimer0.5µl人基因组DNA2.0µlTaq酶0.5µlDEPC水加至30µl扩增条件：预变性—94℃2min，变性—93℃45s，复性—55℃45s，延伸—72℃55s，扩增25个循环，最后5min末延伸。(2)扩增片段的酶切：取扩增产物，用XhoI和XbaI切成粘末端，反应体系：89 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制缓冲液（10×）3µl扩增产物24µlXhoI1.5µlXbaI1.5µl反应条件：孵育—120min（37℃水浴），然后灭活内切酶—70℃（5min）。(3)目的基因纯化：既野生型IL-83’UTR，步骤同2.2.1.2.4.2制备DH5α感受态细菌步骤同2.2.2。2.4.3目的基因与载体pmirGLO的链接及转化(1)目的基因与载体pmirGLO的链接体系：线性双粘载体pmirGLO1μlT4Buffer（2×）5μlT4DNA连接酶1μl双粘目的片段1μlDEPC水加至10µl(2)反应条件：4℃，时间12h。(3)在连接完成后，将反应物在72℃水浴，反应时间10min，以灭活T4连接酶活性；(4)感受态DH5α细胞（上步制备）50μl+灭活的连接物溶液5μl，冰浴孵育30min；(5)水浴42℃，热休克45s；(6)迅速冷却3min（到冰浴中）；(7)加入不含抗生素的(LB)培养基600μl，震荡复苏培养45min（37℃）；(8)取转化菌液100μl涂于含氨苄青霉素的LB平板，在37℃孵箱中培养。2.4.4重组载体酶切鉴定和测序鉴定首先需得到单菌落保种：用取菌环随机挑取野生型IL-63’UTR目的基因与载体pmirGLO链接后转化长出的阳性单克隆转化菌，经过3次细菌分离划线，单菌落培养；另外进行酶切鉴定和测序鉴定：同时接种含氨苄青霉素的LB震荡90 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制培养，提取重组质粒。具体步骤如下。(1)质粒提取：同2.2.4。双酶切（XhoI和XbaI）鉴定：为鉴定野生型IL-83’UTR目的基因插入载体pmirGLO，使用XhoI和XbaI双酶切。酶切体系：缓冲液（10×）1µl重组质粒7µlXhoI1µlXBaI1µl反应条件：37℃水浴孵育120min；(2)测序鉴定：同2.2.4。2.5突变型IL-83’UTR报告基因载体的构建2.5.1突变型IL-83’UTR目的基因的制备采用overlapPCR：(1)含突变IL-83’UTR基因上半区片段：具体步骤同2.2.1。(2)含突变IL-83’UTR基因下半区片段：具体方法同2.2.1。(3)突变IL-83’UTR基因全长OverlapPCR扩增：具体组成同2.2.1，只是将模板更换。(4)扩增片段的酶切：同2.2.1(5)目的基因纯化：既突变型IL-83’UTR，步骤同2.2.12.5.2目的基因与载体pmirGLO的链接及转化具体步骤同2.2.3。2.5.3重组载体酶切鉴定和测序鉴定具体方法同2.2.4。91 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制2.6双报告基因测定2.6.1报告基因载体与miRNAs的共转染IL-6转染共分4组，2组是野生型IL-63’UTR报告基因载体与miRNAs共转染，2组是突变型IL-63’UTR报告基因载体与miRNAs共转染。IL-8转染共分4组，其中2个是野生型IL-83’UTR报告基因载体与miRNAs共转染，2个是突变型IL-83’UTR报告基因载体与miRNAs共转染。具体如下:(1)IL-6转染1)Scramble+pmirGLO-Wt组：Scramble与pmirGLO-Wt共同电转染入HRMC。2)miR-16-2-3pMimic+pmirGLO-Wt组：miR-16-2-3pMimic与pmirGLO-Wt共同电转染入HRMC。3)Scramble+pmirGLO-Mut组：Scramble与pmirGLO-Mut共同电转染入HRMC。4)miR-16-2-3pMimic+pmirGLO-Mut组：miR-16-2-3pMimic与pmirGLO-Mut共同电转染入HRMC。注：Wt指野生型IL-63’UTR；Mut指突变型IL-63’UTR(2)IL-8转染1)Scramble+pmirGLO-Wt组：Scramble与pmirGLO-Wt共同电转染入HRMC。2)miR-100-3pMimic+pmirGLO-Wt组：miR-100-3pMimic与pmirGLO-Wt共同电转染入HRMC。3)Scramble+pmirGLO-Mut组：Scramble与pmirGLO-Mut共同电转染入HRMC。4)miR-100-3pMimic+pmirGLO-Mut组：miR-100-3pMimic与pmirGLO-Mut共同电转染入HRMC。注：Wt指野生型IL-83’UTR；Mut指突变型IL-83’UTR使用美国HarvardApparatus公司电转仪系统BTX2001进行电转：收集7HRMC，将其稀释为2.0×10个/ml细胞悬液。实验按上组，使用2mm间隙电极杯，每个电杯中加入miRNAs（Scramble或miR-16-2-3pmimics或miR-100-3pmimics）10μl以及上述密度的HRMC250μl，直流低电压方波进行电转。电转后接种在细胞24孔培养板中，加入含血清的MCM，放入37℃5%CO2的孵育箱中并进行下列实验。92 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制2.6.2荧光素酶活性测定收集转染48h后的细胞，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测，测定细胞的萤火虫萤光素信号及海肾荧光素信号。具体步骤如下：(1)吸尽培养液，用PBS洗三遍；(2)加入200µlPLB裂解液(1×)，晃动15min，须见到细胞碎片；(3)将裂解产物从培养板上吹打下来，并吸出转移到EP管中，12000g离心5min；(4)取离心上清20μl加入96孔微孔板中，每组设三个复孔；(5)设定程序：每孔加萤火虫荧光素酶底物LARII100µL，2s延时，10s读数，再加入Stop&Glo（1×）100μl终止，读数。2.7转染miR-16-2-3p对靶基因IL-6表达的影响2.7.1转染及刺激细胞取HRMC分为3组，前两组分别转染miR-16-2-3pmimic和Scramble,转染方法同前，第三组不转染；培养后48h后，按第四部分方法中的2.1.1用提纯的P-SIgA刺激3组细胞；24h后，分别收集各组上清液用于后面Westernblot检测IL-6的蛋白水平，收集细胞用于定量RT-PCR方法检测各组细胞中IL-6mRNA表达水平。2.7.2RT-PCR检测(1)RNA提取，按照微量RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)的步骤提取，具体如下：1)将上步收集的空白组、类似物组和诱导组细胞，1000g离心5min，弃掉上清；2)取溶液A300μl，剧烈震荡10s，放置10min（25℃）；3)加入溶液B400μl，剧烈震荡10s；4)12000g离心20min（25℃），弃去上清，保留管底的核酸；5)加入溶液C1ml，振荡器上剧烈震荡10s；6)12000g离心8min（25℃），弃去上清，保留管底的核酸；7)干燥10min（25℃），加入溶液D100μl，轻轻吹打溶解沉淀，即为总RNA，-80℃冰箱保存。(2)逆转录（整个操作在冰上）反应体系：93 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制缓冲液（5×）6µlRNA样本2µl随机引物6聚体1µldNTP1µlAMV0.5µlDEPC水加至30µl孵育45min，42℃恒温加热器。(3)荧光定量PCR扩增：使用荧光定量PCR检测法，以IL-6检测引物Forward，Reverse以及内参照检测引物Forward、Reverse，以IL-6的表达量与内参照表达量的比值为其相对表达水平，每组均设6个重复。TMPremixExTaq（2×）25μlROXReferenceDyeII（50×）1μlcDNA模板4μlForwardPrimer（10μM）1μlReversePrimer（10μM）1μlDEPC水18μlTotal50μl反应条件：预变性：95℃30s循环1次；PCR反应：94℃5s——60℃25s循环40次。2.7.2Westernblot检测(1)蛋白样品制备：将3组细胞上清液与β巯基乙醇上样缓冲液（非还原型）按4:1混合放100℃煮沸5分钟；(2)Westernbolt：具体方法同第三部分1.2.5（2），其中加入一抗分别为IL-6单抗一抗和GAPDH一抗。2.8转染miR-100-3p对靶基因IL-8表达的影响取HRMC分为3组，前两组分别转染miR-100-3pmimic和Scramble,转染方法同前，第三组不转染；培养后48h后，按第四部分方法中的2.1.1用提纯的P-SIgA和N-SIgA刺激94 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制3组细胞；24h后，分别收集各组上清液用于后面Westernblot检测IL-8的蛋白水平，收集细胞用于定量RT-PCR方法检测各组细胞中IL-8mRNA表达水平2.8.1RT-PCR检测(1)RNA提取：同2.7.1。(2)逆转录：同2.7.1。(3)荧光定量PCR扩增：使用荧光定量PCR检测法，以IL-8检测引物Forward，Reverse以及内参照检测引物Forward、Reverse，以IL-6的表达量与内参照表达量的比值为其相对表达水平，每组均设6个重复。TMPremixExTaq（2×）25μlROXReferenceDyeII（50×）1μlcDNA模板4μlForwardPrimer（10μM）1μlDEPC水18μlReversePrimer（10μM）1μl总共50μl反应条件：预变性：95℃30s循环1次；PCR反应：94℃5s——60℃25s循环40次。2.8.2Westernbolt检测(1)蛋白样品制备：将3组细胞上清液与β巯基乙醇上样缓冲液（非还原型）按4:1混合放100℃煮沸5分钟；(2)进行Westernbolt：具体方法同第三部分2.5.2，其中加入一抗分别为IL-8单抗一抗和GAPDH一抗。2.9统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析，作图采用GraphPadPrism6.0完成。定量资料用均数±标准差（mean±SD）表示。正态分布的两组间样本比较采用t检验，多组样本间的比较用单因素方差分析。当P<0.05时认为差异有统计学意义。95 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制3实验结果3.1miR-16-2-3p作用靶基因IL-6的预测和分析结果经miRNAsTarget预测软件TargetScan、picTar和miRanda,都预测出miR-16-2-3p可能与IL-6基因3’UTR区存在seedregion，见图5.2。图5.2miRNA-16-2-3p作用靶基因IL-6的预测结果3.2miR-100-3p作用靶基因IL-8的预测和分析结果经miRNAsTarget预测软件TargetScan、picTar和miRanda，都预测出miR-100-3p可能与IL-8基因3’UTR区存在seedregion，见图5.3。96 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制图5.3miRNA-100-3p作用靶基因IL-8的预测结果3.3野生型/突变型IL-63’UTR报告基因载体的构建结果3.3.1野生型/突变型IL-63’UTR报告基因全长片段扩增结果扩增引物得到野生型/突变型IL-63’UTR报告基因全长片段。经如图5.4所示：电泳后两者均在100bp和250bp之间，靠近250bp处，与设计扩增片段完全一致。图5.4野生型/突变型IL-63’UTR报告基因全长片段扩增结果1：野生型IL-63’UTR报告基因全长片段扩增产物，2：突变型IL-63’UTR报告基因全长片段扩增产物，M：分子量Marker。3.3.2野生型/突变型IL-63’UTR报告基因重组载体双酶切鉴定结果理论预计正确野生型/突变型IL-63’UTR报告基因重组子酶切得到两个片段，大片段7.3Kb，小片段256bp，实际酶切结果与理论预测完全一致。如图5.5可见转化重组子质粒XhoI和XbaI双酶切结果。97 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制图5.5野生型/突变型IL-63’UTR报告基因重组质粒双酶切产物电泳结果1：野生型IL-63’UTR报告基因重组子酶切产物，2：突变型IL-63’UTR报告基因重组子酶切产物，M：分子量Marker。3.3.3野生型/突变型IL-63’UTR报告基因重组子测序结果经测序结果显示野生型IL-63’UTR报告基因重组子插入序列与GenBank中IL-63’UTR序列完全一致，突变型IL-63’UTR报告基因重组子插入序列与GenBank中IL-63’UTR序列仅seedregion区不一致，其余部分完全一致，见图5.6及下面序列，与设计完全一致。说明构建的野生型/突变型IL-63’UTR报告基因载体成功。图5.6IL-6突变型的突变序列示意图W-3’UTR：IL-63’UTR野生型部分序列，M-3’UTR：IL-63’UTR突变型部分序列，框选区为突变区。98 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制（1）野生型报告基因重组质粒插入序列与GenBank中IL-6序列同源性比较（见下），其中IL6.SEQ指GenBank中IL-6序列,WT-WNT.SEQ指野生型IL-63’UTR报告基因重组质粒插入序列。No.TargetfileDefinitionMatch%Over.INITOPT1749W4.SEQ100.025610241024102030405060IL6UTRW.SEQCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGTTAATGGGCATTCCTTCTTCTGGTCAGAAACCTGTCX:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::749W4.SEQCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGTTAATGGGCATTCCTTCTTCTGGTCAGAAACCTGTC60708090100110708090100110120IL6UTRW.SEQCACTGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTATGGAGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::749W4.SEQCACTGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTATGGAGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACA120130140150160170130140150160170180IL6UTRW.SEQCTATTTTAATTATTTTTAATTTATTAATATTTAAATATGTGAAGCTGAGTTAATTTATGT::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::749W4.SEQCTATTTTAATTATTTTTAATTTATTAATATTTAAATATGTGAAGCTGAGTTAATTTATGT180190200210220230190200210220230240IL6UTRW.SEQAAGTCATATTTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTTATGTATTAGTTTTGAAA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::749W4.SEQAAGTCATATTTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTTATGTATTAGTTTTGAAA240250260270280290250IL6UTRW.SEQTAATAATGGAAAGTGG:::::::::::::::X749W4.SEQTAATAATGGAAAGTGG300310（2）突变型报告基因重组质粒插入序列同GenBank中IL-6序列同源性的比较。如下所示，其中IL6.SEQ指GenBank中IL-6序列,MUT-WNT.SEQ指突变型IL-63’UTR报告基因重组质粒插入序列。No.TargetfileDefinitionMatch%Over.INITOPT1750M1.SEQ100.025610241024102030405060IL6UTRM.SEQCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGTTAATGGGCATTCCTTCTTCTGGTCAGAAACCTGTC99 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制X:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::750M1.SEQCATGGGCACCTCAGATTGTTGTTGTTAATGGGCATTCCTTCTTCTGGTCAGAAACCTGTC60708090100110708090100110120IL6UTRM.SEQCACTGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTATGGAGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::750M1.SEQCACTGGGCACAGAACTTATGTTGTTCTCTATGGAGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACA120130140150160170130140150160170180IL6UTRM.SEQCTATTTTAATTATTTTTAATTTATCTTCCAATAAATATGTGAAGCTGAGTTAATTTATGT::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::750M1.SEQCTATTTTAATTATTTTTAATTTATCTTCCAATAAATATGTGAAGCTGAGTTAATTTATGT180190200210220230190200210220230240IL6UTRM.SEQAAGTCATATTTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTTATGTATTAGTTTTGAAA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::750M1.SEQAAGTCATATTTATATTTTTAAGAAGTACCACTTGAAACATTTTATGTATTAGTTTTGAAA240250260270280290250IL6UTRM.SEQTAATAATGGAAAGTGG:::::::::::::::X750M1.SEQTAATAATGGAAAGTGG3003103.4野生型/突变型IL-83’UTR报告基因载体的构建结果3.4.1野生型/突变型IL-83’UTR报告基因全长片段扩增结果如图5.7所示：电泳后两者均在250bp和500bp之间，与设计扩增片段292bp完全一致。图5.7野生型/突变型IL-83’UTR报告基因全长片段扩增结果100 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制1：野生型IL-83’UTR报告基因全长片段扩增产物，2：突变型IL-83’UTR报告基因全长片段扩增产物，M：分子量Marker。3.4.2野生型/突变型IL-83’UTR报告基因重组载体双酶切鉴定结果理论预计正确野生型/突变型IL-83’UTR报告基因重组子酶切得到两个片段，大片段7.3Kb，小片段292bp。如图5.8可见转化重组子质粒XhoI和XbaI双酶切结果。图5.8野生型/突变型IL-83’UTR报告基因重组质粒双酶切产物电泳结果1：野生型IL-83’UTR报告基因重组子酶切产物，2：突变型IL-83’UTR报告基因重组子酶切产物，M：分子量Marker。3.4.3野生型/突变型IL-83’UTR报告基因重组子插入序列测序比较结果经测序结果显示野生型IL-83’UTR报告基因重组子插入序列与GenBank中IL-83’UTR序列完全一致，突变型IL-83’UTR报告基因重组子插入序列与GenBank中IL-83’UTR序列仅seedregion区不一致，其余部分完全一致，见图5.9及下面序列，与设计完全一致。说明构建的野生型/突变型IL-83’UTR报告基因载体成功。101 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制图5.9IL-8突变型的突变序列示意图W-3’UTR：IL-83’UTR野生型部分序列，M-3’UTR：IL-83’UTR突变型部分序列，框选区为突变区。（1）野生型报告基因重组质粒插入序列与GenBank中IL-8序列同源性比较（见下），其中IL8.SEQ指GenBank中IL-8序列,WT-WNT.SEQ指野生型IL-83’UTR报告基因重组质粒插入序列。No.TargetfileDefinitionMatch%Over.INITOPT1W6-1.SEQ100.029211681168102030405060IL8UTRW.SEQATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTTGTCATTGCCAGCTGTGTTGGTAGTGCTGTGTTGAAX:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::W6-1.SEQATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTTGTCATTGCCAGCTGTGTTGGTAGTGCTGTGTTGAA60708090100110708090100110120IL8UTRW.SEQTTACGGAATAATGAGTTAGAACTATTAAAACAGCCAAAACTCCACAGTCAATATTAGTAA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::W6-1.SEQTTACGGAATAATGAGTTAGAACTATTAAAACAGCCAAAACTCCACAGTCAATATTAGTAA120130140150160170130140150160170180102 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制IL8UTRW.SEQTTTCTTGCTGGTTGAAACTTGTTTATTATGTACAAATAGATTCTTATAATATTATTTAAA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::W6-1.SEQTTTCTTGCTGGTTGAAACTTGTTTATTATGTACAAATAGATTCTTATAATATTATTTAAA180190200210220230190200210220230240IL8UTRW.SEQTGACTGCATTTTTAAATACAAGGCTTTATATTTTTAACTTTAAGATGTTTTTATGTGCTC::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::W6-1.SEQTGACTGCATTTTTAAATACAAGGCTTTATATTTTTAACTTTAAGATGTTTTTATGTGCTC240250260270280290250260270280290IL8UTRW.SEQTCCAAATTTTTTTTACTGTTTCTGATTGTATGGAAATATAAAAGTAAATATG:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::XW6-1.SEQTCCAAATTTTTTTTACTGTTTCTGATTGTATGGAAATATAAAAGTAAATATG300310320330340350（2）突变型报告基因重组质粒插入序列与GenBank中IL-8序列同源性比较。如下所示，其中IL8.SEQ指GenBank中IL-8序列,MUT-WNT.SEQ指突变型IL-83’UTR报告基因重组质粒插入序列。No.TargetfileDefinitionMatch%Over.INITOPT1M1-1.SEQ100.029211681168102030405060IL8UTRM.SEQATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTTGTCATTGCCAGCTGTGTTGGTAGTGCTGTGTTGAAX:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::M1-1.SEQATCCTAGTTTGATACTCCCAGTCTTGTCATTGCCAGCTGTGTTGGTAGTGCTGTGTTGAA708090100110120708090100110120IL8UTRM.SEQTTACGGAATAATGAGTTAGAACTATTAAAACAGCCAAAACTCCACAGTCAATATTAGTAA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::M1-1.SEQTTACGGAATAATGAGTTAGAACTATTAAAACAGCCAAAACTCCACAGTCAATATTAGTAA130140150160170180130140150160170180IL8UTRM.SEQTTTCTTGCTGGTTGAAACTTGTTTATTATGTACAAATAGATTCTTATAATATTATTTAAA::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::M1-1.SEQTTTCTTGCTGGTTGAAACTTGTTTATTATGTACAAATAGATTCTTATAATATTATTTAAA190200210220230240190200210220230240IL8UTRM.SEQTGACTGCATTTTATACTCAGGAATCATATATTTTTAACTTTAAGATGTTTTTATGTGCTC::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::M1-1.SEQTGACTGCATTTTATACTCAGGAATCATATATTTTTAACTTTAAGATGTTTTTATGTGCTC250260270280290300250260270280290IL8UTRM.SEQTCCAAATTTTTTTTACTGTTTCTGATTGTATGGAAATATAAAAGTAAATATG:::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::XM1-1.SEQTCCAAATTTTTTTTACTGTTTCTGATTGTATGGAAATATAAAAGTAAATATG310320330340350103 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制3.5双报告基因测定结果3.5.1IL-6各组细胞双报告基因测定数据见表5.1。转染野生型目的基因的双报告系统荧光活性下降（P<0.01），见图5.10所示。这样证实了IL-6是miR-16-2-3p调控的靶基因。表5.1各组细胞双报告基因荧光活性测定结果GroupNRelativeluciferaseactivitypmirGLO-Wt/Scramble61pmirGLO-Wt/Mimic60.615±0.07pmirGLO-Mut/Scramble61.047±0.1pmirGLO-Mut/Mimic60.987±0.09图5.10两组细胞荧光素酶活性比较Wt：野生型，Mut：突变型，P<0.01。104 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制3.5.2IL-8各组细胞双报告基因测定数据见表5.2。转染野生型目的基因的双报告系统荧光活性下降（P<0.01），这样证实了IL-8是miR-100-3p调控的靶基因。表5.2各组细胞双报告基因荧光活性测定结果GroupNRelativeluciferaseactivitypmirGLO-Wt/Scramble61pmirGLO-Wt/Mimic60.677±0.08pmirGLO-Mut/Scramble60.976±0.10pmirGLO-Mut/Mimic61.027±0.11图5.11两组细胞荧光素酶活性比较Wt：野生型，Mut：突变型，P<0.01。3.6转染miR-16-2-3p对靶基因IL-6表达的影响3.6.1RT-PCR检测结果转染并加SIgA刺激后的细胞和同样条件未转染加刺激的细胞共3组，分别使用TaqMan定量RT-PCR方法检测各组细胞中IL-6mRNA表达水平，见表5.3。统计学分析显示，3组细胞的IL-6mRNA表达水平基本一致，差异无显著性105 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制（P>0.05），转染miR-16-2-3pmimic并不能影响细胞中IL-6mRNA的表达。见图5.12。表5.3各组细胞IL-6mRNA表达水平测定结果组别例数相对表达量未转染组61.36±0.10无关对照组61.3±0.12miR-16-2-3pMimic组61.34±0.1图5.12各组HRMC中IL-6mRNA表达水平比较Blank：为转染组，Scramble：无关对照组，Mimic：miR-16-2-3pMimic组；P>0.05。3.6.2Westernblot结果未转染及转染（Mimic和Scramble）后加SIgA刺激的细胞共3组，Western结果见图5.13。未转染的空白组与转染Scramble的无关对照组细胞上清液分泌IL-6蛋白条带深浅一致；转染miR-16-2-3pMimic细胞的蛋白条带最浅，显著低于前两个对照组（空白组和无关对照组），表示这组细胞分泌IL-6的蛋白水平降低了。说明IL-6是miR-16-2-3p的靶基因，并受其调控的是转录后水平。106 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制图5.13各组HRMC上清液中IL-6蛋白表达水平比较1：未转染组，2：无关对照组，3：miR-16-2-3pMimic组。3.7转染miR-100-3p对靶基因IL-8表达的影响3.7.1RT-PCR检测结果转染并加SIgA刺激后的细胞和同样条件未转染加刺激的细胞共3组，分别使用TaqMan定量RT-PCR方法检测各组细胞中IL-8mRNA表达水平，各组其数据见表5.4。统计学分析显示，3组细胞IL-8mRNA表达水平一致，差异无显著性（P>0.05）；转染miR-100-3pmimic并不能影响细胞中IL-8mRNA的表达。见图5.14。表5.4各组细胞IL-8mRNA表达水平测定结果组别例数相对表达量未转染组61.23±0.1无关对照组61.26±0.15miR-100-3pMimic组61.25±0.09107 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制图5.14各组IL-8mRNA表达水平比较Blank：为转染组，Scramble：无关对照组，Mimic：miR-100-3pMimic组；P>0.05。3.7.2Westernblot结果未转染及转染（Mimic和Scramble）后加SIgA刺激的细胞共3组，Western结果见图5.15。未转染的空白组与转染Scramble的无关对照组细胞上清液分泌IL-8蛋白条带深浅一致；转染miR-100-3pMimic细胞的蛋白条带最浅，显著低于前两个对照组（空白组和无关对照组），表示这组细胞分泌IL-8的蛋白水平降低了。说明IL-8是miR-100-3p的靶基因，并受其调控的是转录后水平。图5.15各组IL-8蛋白表达水平比较1：未转染组，2：无关对照组，3：miR-100-3pMimic组。108 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制4讨论由于在上一部分我们将IgAN患者及正常人唾液中提纯的SIgA刺激HRMC后，通过miRNAs芯片杂交技术筛选了差异性表达的miRNAs共16个。那么其中的miRNAs在SIgA的致病中起了什么样的作用呢？如何找到同SIgA致病性相关的作用靶点呢？miR-16家族的靶基因包括许多控制细胞周期的进程相关的基因，如细胞周[97,98]期蛋白D1、细胞周期蛋白E、和抗凋亡蛋白和Bcl-2。因此在肿瘤研究领域发现，miR16家族可以通过靶向协同调控这些细胞周期相关基因的表达诱导细胞[99]G1期阻滞从而参与调控肿瘤细胞周期进程；miR-16还同前列腺癌细胞生长有[100][101]关，与人乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性有关，可以通过巨噬细胞[102][103]发挥肿瘤抑制的作用，还能够抑制恶性胶质瘤的增殖及血管生成；炎症调控方面，miR-16在Toll样受体介导的NF-κB信号通路中调控多种炎症反应，并[95]参与调控了LPS刺激细胞的多种炎症因子如IL-8和IL-1α等的分泌。另一种miR-100家族在肿瘤调控方面发挥了许多重要的作用，沉默miR-100表达增强胃[104]癌细胞对化疗的敏感性，并可通过Notch信号通路调控肿瘤细胞的凋亡；miR-100参与浸润性膀胱尿路上皮癌的细胞增殖、凋亡和细胞中mRNA的表达[105]异常；炎症反应方面，miR-100可以在急性移植物抗宿主病中参与炎症性新[106]生血管，它还同高致病性禽流感H5N2对小鼠肺部感染炎症反应的调控有关[96]。但在IgAN方面的研究均未见这两种miRNAs的报道，我们通过第三部分发现SIgA刺激HRMC使其分泌IL-6、IL-8、MCP-1和TGF-β1等炎症因子表达增多；经第四部分的实验发现，芯片结果中miR-16-2-3p和miR-100-3p在PATIENT中表达都是下调并且差异明显；因此我们设想miR-16-2-3p和miR-100-3p是否能与上述的个别炎症因子3’UTR区结合，来负向调控炎症因子的表达，从而阐述了SIgA调控肾脏系膜细胞炎症因子释放的分子机制。我们采用miRNATarget预测软件TargetScan、picTar和miRanda，都预测出miR-16-2-3p可能与IL-6基因3’UTR区存在结合区域，miRNA-100-3p可能与IL-8基因3’UTR区存在结合区域即seedregion。故预测miR-16-2-3p可能与IL-6基因3’UTR互补结合,以及miR-100-3p可能与IL-8基因3’UTR互补结合。那么如何验证这些预测呢？报告基因系统（reportgene）是研究基因调控的一种简便方法，通常把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。对于miRNAs调控所适用的是双荧光素酶报109 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制告基因测试。这种报告基因以萤火虫与海洋腔肠荧光素酶结合的先进共报告基因检测技术，在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常用第二个报告基因来减少实验因素变化带来的误差。传统的共报告基因由于各测试方法、处理要求及检测特点存在明显差异，使用不方便。而我们使用的双报告系统，结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中即可进行双荧光素酶报告基因测试。该系统检测灵敏、快速并且简便，由Promega公司开发。本实验应用这种报告基因测试，发现：miR-16-2-3p能够抑制融合IL-6基因的3’UTR的荧光素酶报告基因表达，miR-100-3p能够抑制融合IL-8基因的3’UTR的荧光素酶报告基因表达。既miR-16-2-3p和miR-100-3p可以同IL-6和IL-8基因的3’UTR想结合，这样初步验证了我们的靶基因预测。但是报告基因的方法只能初步证明miRNAs对靶基因3‘UTR存在功能性作用，不能最终确定该miRNAs是否对靶基因存在内源性的调控，另外这种报告[107]基因分析也存在假阳性的可能。如ZhaoY等用报告基因的方法证实miR-1对融合胸腺素β4的基因3’UTR的报告基因具有显著抑制作用，但过表达miR-1的转基因小鼠中并没有发现胸腺素β4蛋白表达的变化。因此，miRNAs是否能够调控靶基因转录后的表达还需要更直接的方法加以验证。本部分仍然选用HRMC，由于P-SIgA可以活化其明显表达IL-6及IL-8（mRNA和蛋白水平）增多。因此我们利用HRMC分别转染miR-16-2-3p和miR-100-3p，并加入P-SIgA刺激。随后同未转染组和无关对照组相比，转染miR-16-2-3p的细胞中IL-6在蛋白水平分泌明显减少，而mRNA的表达无明显改变；转染miR-100-3p的细胞中IL-8在蛋白水平分泌明显减少，而mRNA的表达无明显改变。以上就更明确地验证了miRNAs对靶基因预测的准确性，说明miR-16-2-3p是通过结合IL-63’UTR，进行转录后调控，负向调节IL-6的蛋白水平表达；miR-100-3p是通过结合IL-83’UTR，进行转录后调控，负向调节IL-8的蛋白水平表达。基于以上的研究我们推测，致病性SIgA可能通过miRNA的调控作用，介导了系膜细胞炎症因子的释放：即SIgA沉积在肾组织后，激活系膜细胞并通过某种途径，下调miR-16-2-3p和miR-100-3p等miRNAs的表达，使其抑制IL-6、IL-8等炎症因子翻译的作用减弱，从而促进系膜细胞分泌IL-6、IL-8等炎症因子增多。这是首次对SIgA在IgAN致病性进行分子机制的探索。110 第五部分miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制5小结本部分基于重组克隆技术，以pmirGLO质粒作为表达载体，应用荧光素酶报告双基因分析系统和对内源性靶基因调控的检测，阐述了miR-16-2-3p和miR-100-3p调控IL-6和IL-8的分子机制，是对SIgA在IgAN发挥致病性进行分子机制的探索。111 全文结论全文结论1.粘膜免疫同IgAN密切相关，SIgA参与了IgAN的发病，它的沉积同一定的临床肾脏病理指标相联系；2.SIgA在IgAN中具有致病性，它可能激活MBL途径及旁路途径，造成肾损伤；3.SIgA在IgAN中具有致病性还表现在，它可以刺激系膜细胞增殖和活化HRMC生成促炎促纤维化细胞因子，并且SIgA与pIgA对系膜细胞的生物学效应是不完全相同的；4.SIgA在IgAN发挥致病性的机制中，miRNAs参与其中；5.SIgA通过作用miR-16-2-3p和miR-100-3p来分别调控系膜细胞产生IL-6和IL-8，这可能是SIgA在IgAN产生致病性的分子机制之一。112 参考文献参考文献[1]FloegeJ,MouraIC,DahaMR.NewinsightsintothepathogenesisofIgAnephropathy[J].SeminImmunopathol,2014,36(4):431-442.[2]CaiGY,ChenXM.ImmunoglobulinAnephropathyinChina:progressandchallenges[J].AmJNephrol,2009,30(3):268-273.[3]LiLS,LiuZH.EpidemiologicdataofrenaldiseasesfromasingleunitinChina:analysisbasedon13,519renalbiopsies[J].KidneyInt,2004,66(3):920-923.[4]KerrMA.ThestructureandfunctionofhumanIgA[J].BiochemJ,1990,271(2):285-296.[5]MathiasA,CorthesyB.Recognitionofgram-positiveintestinalbacteriabyhybridoma-andcolostrum-derivedsecretoryimmunoglobulinAismediatedbycarbohydrates[J].JBiolChem,2011,286(19):17239-17247.[6]TanY,ZhangJJ,LiuG,etal.ThelevelofurinarysecretoryimmunoglobulinA(sIgA)ofpatientswithIgAnephropathyiselevatedandassociatedwithpathologicalphenotypes[J].ClinExpImmunol,2009,156(1):111-116.[7]RivaF,BonavitaE,BarbatiE,etal.TIR8/SIGIRRisanInterleukin-1Receptor/TollLikeReceptorFamilyMemberwithRegulatoryFunctionsinInflammationandImmunity[J].FrontImmunol,2012,3:322.[8]XieY,ChenX,NishiS,etal.RelationshipbetweentonsilsandIgAnephropathyaswellasindicationsoftonsillectomy[J].KidneyInt,2004,65(4):1135-1144.[9]SuzukiH,KirylukK,NovakJ,etal.ThepathophysiologyofIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2011,22(10):1795-1803.[10]徐夏.鼻咽癌血浆microRNA分子标志物的筛选及意义[D];南方医科大学,2014.[11]SzetoCC,LiPK.MicroRNAsinIgAnephropathy[J].NatRevNephrol,2014,10(5):249-256.[12]BergerJ,HinglaisN.[IntercapillarydepositsofIgA-IgG][J].JUrolNephrol(Paris),1968,74(9):694-695.[13]OortwijnBD,vanderBoogPJ,RoosA,etal.ApathogenicroleforsecretoryIgAinIgAnephropathy[J].KidneyInt,2006,69(7):1131-1138.[14]KoyamaA,SharminS,SakuraiH,etal.StaphylococcusaureuscellenvelopeantigenisanewcandidatefortheinductionofIgAnephropathy[J].KidneyInt,2004,66(1):121-132.[15]AmoreA,CoppoR,NedrudJG,etal.TheroleofnasaltoleranceinamodelofIgAnephropathyinducedinmicebySendaivirus[J].ClinImmunol,2004,113(1):101-108.[16]SuzukiH,SuzukiY,NaritaI,etal.Toll-likereceptor9affectsseverityofIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2008,19(12):2384-2395.[17]ZhangJJ,XuLX,LiuG,etal.ThelevelofserumsecretoryIgAofpatientswithIgA113 参考文献nephropathyiselevatedandassociatedwithpathologicalphenotypes[J].NephrolDialTransplant,2008,23(1):207-212.[18]LeveyAS,BoschJP,LewisJB,etal.Amoreaccuratemethodtoestimateglomerularfiltrationratefromserumcreatinine:anewpredictionequation.ModificationofDietinRenalDiseaseStudyGroup[J].AnnInternMed,1999,130(6):461-470.[19]GrubbA,NymanU,BjorkJ,etal.SimplecystatinC-basedpredictionequationsforglomerularfiltrationratecomparedwiththemodificationofdietinrenaldiseasepredictionequationforadultsandtheSchwartzandtheCounahan-Barrattpredictionequationsforchildren[J].ClinChem,2005,51(8):1420-1431.[20]XuPC,ZhangJJ,ChenM,etal.Urinarykidneyinjurymolecule-1inpatientswithIgAnephropathyiscloselyassociatedwithdiseaseseverity[J].NephrolDialTransplant,2011,26(10):3229-3236.[21]WorkingGroupoftheInternationalIgANN,theRenalPathologyS,CattranDC,etal.TheOxfordclassificationofIgAnephropathy:rationale,clinicopathologicalcorrelations,andclassification[J].KidneyInt,2009,76(5):534-545.[22]XingGQ,ChenM,LiuG,etal.Complementactivationisinvolvedinrenaldamageinhumanantineutrophilcytoplasmicautoantibodyassociatedpauci-immunevasculitis[J].JClinImmunol,2009,29(3):282-291.[23]WyattRJ,JulianBA.IgAnephropathy[J].NEnglJMed,2013,368(25):2402-2414.[24]OortwijnBD,EijgenraamJW,RastaldiMP,etal.TheroleofsecretoryIgAandcomplementinIgAnephropathy[J].SeminNephrol,2008,28(1):58-65.[25]LawrenceHP,FilleryED,MatearDW,etal.SalivarysIgAandcortisol:markersforfunctionaldependenceinolderadults[J].SpecCareDentist,2005,25(5):242-252.[26]BrandtzaegP.Inductionofsecretoryimmunityandmemoryatmucosalsurfaces[J].Vaccine,2007,25(30):5467-5484.[27]AlmogrenA.Characterization,quantification,andassessmentofimmuneprotectionpotentialofsecretoryimmunoglobulinAincolostrumsamplesfromSaudiwomen[J].SaudiMedJ,2013,34(10):1013-1019.[28]RostokerG,PechMA,Petit-PharM,etal.Mucosalimmunityinadultprimaryglomerulonephritis.I.EvaluationofsalivaryIgAsubclassesandcomponents[J].Nephron,1990,54(1):42-46.[29]YamabeH,OzawaK,FukushiK,etal.ElevatedserumsecretoryIgAinpatientswithIgAnephropathy[J].Nephron,1989,51(4):499-501.[30]OortwijnBD,RoosA,RoyleL,etal.DifferentialglycosylationofpolymericandmonomericIgA:apossibleroleinglomerularinflammationinIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2006,17(12):3529-3539.[31]SuzukiS,KobayashiH,SatoH,etal.ImmunohistochemicalcharacterizationofglomerularIgAdepositsinIgAnephropathy[J].ClinNephrol,1990,33(2):66-71.[32]EmancipatorSN,GalloGR,RazaboniR,etal.Experimentalcholestasispromotesthe114 参考文献depositionofglomerularIgAimmunecomplexes[J].AmJPathol,1983,113(1):19-26.[33]O'SeaghdhaCM,TinA,YangQ,etal.AssociationofacystatinCgenevariantwithcystatinClevels,CKD,andriskofincidentcardiovasculardiseaseandmortality[J].AmJKidneyDis,2014,63(1):16-22.[34]FillerG,PriemF,VollmerI,etal.Diagnosticsensitivityofserumcystatinforimpairedglomerularfiltrationrate[J].PediatrNephrol,1999,13(6):501-505.[35]AbramowskyCR,SwinehartGL.Secretoryimmuneresponsesinhumankidneys[J].AmJPathol,1986,125(3):571-577.[36]ChanLY,LeungJC,TsangAW,etal.Activationoftubularepithelialcellsbymesangial-derivedTNF-alpha:glomerulotubularcommunicationinIgAnephropathy[J].KidneyInt,2005,67(2):602-612.[37]LeW,LiangS,ChenH,etal.Long-termoutcomeofIgAnephropathypatientswithrecurrentmacroscopichematuria[J].AmJNephrol,2014,40(1):43-50.[38]FloegeJ,FeehallyJ.IgAnephropathy:recentdevelopments[J].JAmSocNephrol,2000,11(12):2395-2403.[39]SuzukiK,HondaK,TanabeK,etal.IncidenceoflatentmesangialIgAdepositioninrenalallograftdonorsinJapan[J].KidneyInt,2003,63(6):2286-2294.[40]RoosA,RastaldiMP,CalvaresiN,etal.GlomerularactivationofthelectinpathwayofcomplementinIgAnephropathyisassociatedwithmoresevererenaldisease[J].JAmSocNephrol,2006,17(6):1724-1734.[41]McCoyRC,AbramowskyCR,TisherCC.IgAnephropathy[J].AmJPathol,1974,76(1):123-144.[42]GiannakakisK,FeriozziS,PerezM,etal.AberrantlyglycosylatedIgA1inglomerularimmunedepositsofIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2007,18(12):3139-3146.[43]BergerSP,DahaMR.Complementinglomerularinjury[J].SeminImmunopathol,2007,29(4):375-384.[44]GewurzH,ZhangXH,LintTF.Structureandfunctionofthepentraxins[J].CurrOpinImmunol,1995,7(1):54-64.[45]AgrawalA.CRPafter2004[J].MolImmunol,2005,42(8):927-930.[46]ChakravartiDN,CampbellRD,PorterRR.ThechemicalstructureoftheC4dfragmentofthehumancomplementcomponentC4[J].MolImmunol,1987,24(11):1187-1197.[47]OliveiraGH,BrannCN,BeckerK,etal.Dynamicexpressionofthemembraneattackcomplex(MAC)ofthecomplementsysteminfailinghumanmyocardium[J].AmJCardiol,2006,97(11):1626-1629.[48]HiemstraPS,GorterA,StuurmanME,etal.ActivationofthealternativepathwayofcomplementbyhumanserumIgA[J].EurJImmunol,1987,17(3):321-326.[49]RitsM,HiemstraPS,BazinH,etal.ActivationofratcomplementbysolubleandinsolubleratIgAimmunecomplexes[J].EurJImmunol,1988,18(12):1873-1880.[50]HisanoS,MatsushitaM,FujitaT,etal.MesangialIgA2depositsandlectin115 参考文献pathway-mediatedcomplementactivationinIgAglomerulonephritis[J].AmJKidneyDis,2001,38(5):1082-1088.[51]OortwijnBD,RastaldiMP,RoosA,etal.DemonstrationofsecretoryIgAinkidneysofpatientswithIgAnephropathy[J].NephrolDialTransplant,2007,22(11):3191-3195.[52]RoosA,BouwmanLH,vanGijlswijk-JanssenDJ,etal.HumanIgAactivatesthecomplementsystemviathemannan-bindinglectinpathway[J].JImmunol,2001,167(5):2861-2868.[53]AbboudHE.Mesangialcellbiology[J].ExpCellRes,2012,318(9):979-985.[54]MonteiroRC,MouraIC,LaunayP,etal.PathogenicsignificanceofIgAreceptorinteractionsinIgAnephropathy[J].TrendsMolMed,2002,8(10):464-468.[55]AmoreA,CirinaP,ContiG,etal.GlycosylationofcirculatingIgAinpatientswithIgAnephropathymodulatesproliferationandapoptosisofmesangialcells[J].JAmSocNephrol,2001,12(9):1862-1871.[56]NovakJ,TomanaM,MatousovicK,etal.IgA1-containingimmunecomplexesinIgAnephropathydifferentiallyaffectproliferationofmesangialcells[J].KidneyInt,2005,67(2):504-513.[57]MouraIC,BenhamouM,LaunayP,etal.TheglomerularresponsetoIgAdepositioninIgAnephropathy[J].SeminNephrol,2008,28(1):88-95.[58]MouraIC,Arcos-FajardoM,GdouraA,etal.EngagementoftransferrinreceptorbypolymericIgA1:evidenceforapositivefeedbackloopinvolvingincreasedreceptorexpressionandmesangialcellproliferationinIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2005,16(9):2667-2676.[59]MonteiroRC,Halbwachs-MecarelliL,Roque-BarreiraMC,etal.ChargeandsizeofmesangialIgAinIgAnephropathy[J].KidneyInt,1985,28(4):666-671.[60]MoldoveanuZ,WyattRJ,LeeJY,etal.PatientswithIgAnephropathyhaveincreasedserumgalactose-deficientIgA1levels[J].KidneyInt,2007,71(11):1148-1154.[61]WarnerRH,StevensFM,McCarthyCF.SalivarySIgAandSIgA1incoeliacdisease,inflammatoryboweldiseaseandcontrols[J].IrJMedSci,1999,168(1):33-35.[62]EijgenraamJW,OortwijnBD,KamerlingSW,etal.SecretoryimmunoglobulinA(IgA)responsesinIgAnephropathypatientsaftermucosalimmunization,aspartofapolymericIgAresponse[J].ClinExpImmunol,2008,152(2):227-232.[63]HikiY,ItoA,YamamotoY,etal.IgAnephropathyandaberrantglycosylationoftonsillar,serumandglomerularIgA1[J].AdvOtorhinolaryngol,2011,72:68-70.[64]MengH,OhtakeH,IshidaA,etal.IgAproductionandtonsillarfocalinfectioninIgAnephropathy[J].JClinExpHematop,2012,52(3):161-170.[65]HikiY,HorieA,YasudaY,etal.IgAnephropathyandtonsils--anapproachfromthestructureofIgA1producedbytonsillarlymphocytes[J].ActaOtolaryngolSuppl,2004,(555):28-31.[66]ColettaI,SoldoL,PolentaruttiN,etal.SelectiveinductionofMCP-1inhuman116 参考文献mesangialcellsbytheIL-6/sIL-6Rcomplex[J].ExpNephrol,2000,8(1):37-43.[67]TamKY,LeungJC,ChanLY,etal.MacromolecularIgA1takenfrompatientswithfamilialIgAnephropathyortheirasymptomaticrelativeshavehigherreactivitytomesangialcellsinvitro[J].KidneyInt,2009,75(12):1330-1339.[68]BiswasP,DelfantiF,BernasconiS,etal.Interleukin-6inducesmonocytechemotacticprotein-1inperipheralbloodmononuclearcellsandintheU937cellline[J].Blood,1998,91(1):258-265.[69]YokoyamaH,WadaT,FuruichiK,etal.Urinarylevelsofchemokines(MCAF/MCP-1,IL-8)reflectdistinctdiseaseactivitiesandphasesofhumanIgAnephropathy[J].JLeukocBiol,1998,63(4):493-499.[70]McClellanJL,DavisJM,SteinerJL,etal.Linkingtumor-associatedmacrophages,inflammation,andintestinaltumorigenesis:roleofMCP-1[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2012,303(10):G1087-1095.[71]KimMJ,McDaidJP,McAdooSP,etal.SpleentyrosinekinaseisimportantintheproductionofproinflammatorycytokinesandcellproliferationinhumanmesangialcellsfollowingstimulationwithIgA1isolatedfromIgAnephropathypatients[J].JImmunol,2012,189(7):3751-3758.[72]GoumenosDS,TsakasS,ElNahasAM,etal.Transforminggrowthfactor-beta(1)inthekidneyandurineofpatientswithglomerulardiseaseandproteinuria[J].NephrolDialTransplant,2002,17(12):2145-2152.[73]LiXZ,FengJT,HuCP,etal.DoesArkadiacontributetoTGF-beta1-inducedIgAexpressionthroughup-regulationofSmadsignalinginIgAnephropathy?[J].IntUrolNephrol,2010,42(3):719-722.[74]KanekoY,OtsukaT,TsuchidaY,etal.Integrinalpha1/beta1andalpha2/beta1asareceptorforIgA1inhumanglomerularmesangialcellsinIgAnephropathy[J].IntImmunol,2012,24(4):219-232.[75]WangC,LiuX,PengH,etal.MesangialcellsstimulatedbyimmunoglobinA1fromIgAnephropathyupregulatestransforminggrowthfactor-beta1synthesisinpodocytesviarenin-angiotensinsystemactivation[J].ArchMedRes,2010,41(4):255-260.[76]TsugeT,SuzukiY,ShimokawaT,etal.Monocytechemoattractantprotein(MCP)-1productionviafunctionallyreconstitutedFcalphareceptor(CD89)onglomerularmesangialcells[J].InflammRes,2003,52(10):428-432.[77]LaiKN.PathogenesisofIgAnephropathy[J].NatRevNephrol,2012,8(5):275-283.[78]YangC,GlassWF,2nd.Expressionofalpha-actinin-1inhumanglomerularmesangialcellsinvivoandinvitro[J].ExpBiolMed(Maywood),2008,233(6):689-693.[79]ZuoN,SuzukiY,SugayaT,etal.Protectiveeffectsoftubularliver-typefattyacid-bindingproteinagainstglomerulardamageinmurineIgAnephropathy[J].NephrolDialTransplant,2011,26(7):2127-2137.[80]HuangJ,GuerreroA,ParkerE,etal.Site-specificglycosylationofsecretory117 参考文献immunoglobulinafromhumancolostrum[J].JProteomeRes,2015,14(3):1335-1349.[81]Griffiths-JonesS,SainiHK,vanDongenS,etal.miRBase:toolsformicroRNAgenomics[J].NucleicAcidsRes,2008,36(Databaseissue):D154-158.[82]李书军.人NSCLC转移相关microRNAs筛选及功能研究[D];天津医科大学,2011.[83]WangG,KwanBC,LaiFM,etal.IntrarenalexpressionofmicroRNAsinpatientswithIgAnephropathy[J].LabInvest,2010,90(1):98-103.[84]ChandrasekaranK,KarolinaDS,SepramaniamS,etal.RoleofmicroRNAsinkidneyhomeostasisanddisease[J].KidneyInt,2012,81(7):617-627.[85]BhattK,MiQS,DongZ.microRNAsinkidneys:biogenesis,regulation,andpathophysiologicalroles[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2011,300(3):F602-610.[86]BartelDP.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions[J].Cell,2009,136(2):215-233.[87]CastanoIM,CurtinCM,ShawG,etal.Anovelcollagen-nanohydroxyapatitemicroRNA-activatedscaffoldfortissueengineeringapplicationscapableofefficientdeliveryofbothmiR-mimicsandantagomiRstohumanmesenchymalstemcells[J].JControlRelease,2015,200:42-51.[88]YooSS,RazzakR,BedardE,etal.Layeredgadolinium-basednanoparticleasanoveldeliveryplatformformicroRNAtherapeutics[J].Nanotechnology,2014,25(42):425102.[89]LiGS,ZhangH,LvJC,etal.VariantsofC1GALT1geneareassociatedwiththegeneticsusceptibilitytoIgAnephropathy[J].KidneyInt,2007,71(5):448-453.[90]SmithAC,MolyneuxK,FeehallyJ,etal.O-glycosylationofserumIgA1antibodiesagainstmucosalandsystemicantigensinIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2006,17(12):3520-3528.[91]FangY,YuX,LiuY,etal.miR-29cisdownregulatedinrenalinterstitialfibrosisinhumansandratsandrestoredbyHIF-alphaactivation[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2013,304(10):F1274-1282.[92]WangG,LaiFM,LaiKB,etal.Intra-renalandurinarymRNAexpressionofpodocyte-associatedmoleculesfortheestimationofglomerularpodocyteloss[J].RenFail,2010,32(3):372-379.[93]WangG,KwanBC,LaiFM,etal.ElevatedlevelsofmiR-146aandmiR-155inkidneybiopsyandurinefrompatientswithIgAnephropathy[J].DisMarkers,2011,30(4):171-179.[94]PuhrM,HoeferJ,SchaferG,etal.Epithelial-to-mesenchymaltransitionleadstodocetaxelresistanceinprostatecancerandismediatedbyreducedexpressionofmiR-200candmiR-205[J].AmJPathol,2012,181(6):2188-2201.[95]ZhouR,LiX,HuG,etal.miR-16targetstranscriptionalcorepressorSMRTandmodulatesNF-kappaB-regulatedtransactivationofinterleukin-8gene[J].PLoSOne,2012,7(1):e30772.[96]ChoiEJ,KimHB,BaekYH,etal.DifferentialmicroRNAexpressionfollowinginfection118 参考文献withamouse-adapted,highlyvirulentavianH5N2virus[J].BMCMicrobiol,2014,14(1):252.[97]LiuQ,FuH,SunF,etal.miR-16familyinducescellcyclearrestbyregulatingmultiplecellcyclegenes[J].NucleicAcidsRes,2008,36(16):5391-5404.[98]BonciD,CoppolaV,MusumeciM,etal.ThemiR-15a-miR-16-1clustercontrolsprostatecancerbytargetingmultipleoncogenicactivities[J].NatMed,2008,14(11):1271-1277.[99]ZhuY,XiaY,NiuH,etal.MiR-16inducedthesuppressionofcellapoptosiswhilepromoteproliferationinesophagealsquamouscellcarcinoma[J].CellPhysiolBiochem,2014,33(5):1340-1348.[100]TakeshitaF,PatrawalaL,OsakiM,etal.SystemicdeliveryofsyntheticmicroRNA-16inhibitsthegrowthofmetastaticprostatetumorsviadownregulationofmultiplecell-cyclegenes[J].MolTher,2010,18(1):181-187.[101]ZhangX,WanG,MlotshwaS,etal.OncogenicWip1phosphataseisinhibitedbymiR-16intheDNAdamagesignalingpathway[J].CancerRes,2010,70(18):7176-7186.[102]LiT,MorganMJ,ChoksiS,etal.MicroRNAsmodulatethenoncanonicaltranscriptionfactorNF-kappaBpathwaybyregulatingexpressionofthekinaseIKKalphaduringmacrophagedifferentiation[J].NatImmunol,2010,11(9):799-805.[103]ZhangN,ZhouH,YuL,etal.[TheinfluenceofmiR-16onproliferationandangiogenesisofU87MGinvivo][J].ZhonghuaYiXueZaZhi,2014,94(33):2618-2621.[104]YangG,GongY,WangQ,etal.TheroleofmiR-100-mediatedNotchpathwayinapoptosisofgastrictumorcells[J].CellSignal,2015.[105]MoraisDR,ReisST,VianaN,etal.TheinvolvementofmiR-100inbladderurothelialcarcinogenesischangingtheexpressionlevelsofmRNAandproteinsofgenesrelatedtocellproliferation,survival,apoptosisandchromosomalstability[J].CancerCellInt,2014,14(1):119.[106]LeonhardtF,GrundmannS,BeheM,etal.Inflammatoryneovascularizationduringgraft-versus-hostdiseaseisregulatedbyalphavintegrinandmiR-100[J].Blood,2013,121(17):3307-3318.[107]ZhaoY,SamalE,SrivastavaD.Serumresponsefactorregulatesamuscle-specificmicroRNAthattargetsHand2duringcardiogenesis[J].Nature,2005,436(7048):214-220.119 综述综述MicroRNAs与IgA肾病关系的研究进展[1]IgA肾病（IgAnephropathy，IgAN）是全球最常见的原发性肾小球疾病，大约20-40%的患者经过10-20年就进入终末期肾病（end-stagerenaldisease，[2,3][4]ESRD），尤其在亚洲是发生ESRD的首要原因。在我国，IgAN约占原发[5]性肾小球疾病的45%，并且是我国慢性肾衰竭的主要病因，约占27%。它造成了个人和社会的极大负担，因此对IgAN的研究是非常必要的。图1IgAN发病的四重打击学说（引自SuzukiH,etal.JAmSocNephrol,2011,22(10):1795-1803.）现今很多临床及基础实验研究普遍认为，IgAN的发病经历了以下四重打击：首先因粘膜感染、外来抗原刺激以及基因突变在循环中形成了糖基化缺陷的120 综述IgA1，随后生成一种特异性识别缺失糖基的抗体IgG，二者结合形成IgA1-IgG循环免疫复合物，最后这种免疫复合物经血循环沉积在肾小球的系膜区，刺激系膜细胞，促炎症促纤维化细胞因子生成，致细胞外基质增多，并作用肾小球[6]的足细胞，引起尿蛋白，造成肾脏损伤（见图1）。其中，形成糖基化缺失的[7]IgA1是致病最重要的因素。上述是对其机制探讨的假说，IgAN的发病机制到现在仍然不清楚。如果找到其作用靶点并加以干预，则有望减轻或阻止IgAN的进展。在对肿瘤致病靶点的研究发现，非编码基因，特别是一类高度保守的非编[8]码单链小分子RNA(microRNAs,miRNAs)，有可能作为肿瘤治疗的靶点。是研究的热门，并且有关抑制miRNAs的药物已在实验阶段。现在已经有研究表明miRNAs同IgAN的发病中起了一定的调控作用，有可能作为诊断及治疗的分子标志物。在本文中，将就miRNAs在IgAN发病中的作用做一论述。1miRNAs的生物合成及功能miRNAs是非编码的单链小分子，由大约21-23个核苷酸组成，可特异性识别靶基因的mRNA的3’非翻译区（untranslatedregion，UTR）并与之结合,引起靶基因信使RNA（messengerRNA，mRNA）降解或翻译抑制，从而对基因进[7-11]行转录后表达调控。这种小RNA包含在多个物质，从蠕虫到哺乳动物。他们控制了相当比例的基因组表达，并且有助于多种细胞功能的调节，比如细胞[12-14][15]增殖，凋亡和分化。它参与调节几乎所有的细胞生物学过程。miRNAs的生物合成需要复杂的蛋白系统，在核内转录成最初产物既pri-miRNA，而后经过各种酶及辅助因子的作用剪切为22个核苷酸左右长度的双链，进入沉默复合体（RISC）中参与调控mRNA。在哺乳动物中常常是miRNAs与靶基因mRNA的3’端UTR区呈不完全互补的结合，来抑制蛋白质翻译；在植物中常常是与靶位点完全或几乎完全互补，通常在mRNA的编码区，引起靶基因mRNA的降解。在疾病中的调控是现在的热门。尤其肿瘤研究邻域，已经在研究将miRNAs作为某些诊断和预后标志物，甚至已有实验支持其模拟物或抑制物在体内应用，特异性靶向结合致病miRNAs的miRNAs调节剂，如抗miRNA[16,17]寡核苷酸（AMOs）和反义miRNA（antagomirs）等。121 综述2miRNAs在肾脏疾病中的作用[18,现在研究显示miRNAs在多种人类疾病包括肾脏病的发病中起了重要作用19]。在鼠类和人类组织的微阵列分析显示，在肾组织含有大量的miR-192，[20,21]miR-194，miR-204，miR-215和miR-216。一系列的研究表明在CKD的进展中miRNAs发挥了重要作用，尤其是把它[22,23]看做是引起高血压肾损害和糖尿病肾小球硬化的致病靶点。在对Dahl盐敏[24]感大鼠研究发现，miR-29b的表达明显增加；研究表明miR-192、miR-337和[25-27]miR-200b/c与糖尿病肾病小球病变密切相关；在急性肾损伤的研究中发现miRNAs在其中起了重要调控作用。miR-21，miR-205，miR-127和miR-494在[28-30]对缺血性急性肾损伤中起了保护或损伤作用，其中miR-494在肾脏缺血后[30]表达增加，造成肾小管损伤；在肾组织纤维化方面，miRNAs在上皮细胞间充质转分化（epithelial–mesenchymaltransition，EMT）中起了非常重要的作用，研[31]究报道miR-200家族和miR-205是EMT的重要调控因子，它们可以降低[32]E-cadherin的表达，从而导致肾脏上皮细胞EMT。Kriegel等研究发现miRNAs的表达异常可以参与调控TGF-β（transforminggrowthfactorbeta,TGF-β）诱导的EMT，促进肾组织纤维化的发生和进展。还有报道线粒体氧化应激也参与了肾脏EMT，如miR-382的高表达能够抑制超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase2,SOD2)的产生，促进线粒体的氧化应激，提示了一个EMT发生的新机制。3miRNAs与IgAN的发病miRNAs在IgAN发病中涉及了多个方面，如图2所示，具体阐述如下。122 综述图2：miRNAs在IgAN发病中的可能作用[引自SzetoCCandLiPK,NatRevNephrol.2014,May;10(5):250]3.1miRNAs高通量基因测序在IgAN中的研究有研究者通过高通量序列技术分析了6名IgAN患者肾组织及正常人癌旁肾组织，进行靶基因预测比较分析33，发现有85个miRNAs是有差异的，其中74个在IgAN患者肾组织中下调，11个上调。如miR-17-5p和miR-106b-5p调[33,34]控细胞周期进程和凋亡，miR-17-5p通过GTP酶激活蛋白TBC1D2参与调[35]节细胞内吞转运，miR-133a、miR-133b和miR-185主要调控细胞间粘附，[36]miR-185调控细胞的应激反应等。另外有证据表明miR-185、miR-133a和miR-133b参与了IgA1在肾小球系膜区的沉积，miR-106b-5p、miR-17-5p、[37]miR-133a、miR-133b和miR-185均参与了IgAN的发病。但是以上的这些高通量测序研究结果是基于6例活检肾组织对照分析得出的，样本量小，而且个别miRNAs的表达也较低，因此还需要更多的组织样本验证。[1,37]IgAN是系统性疾病，但最终受累的是肾脏，因此许多研究集中在寻找[38]肾外差异性基因表达方面。Serin等从7名IgAN患者分离出外周血单核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs），进行了miRNAs高通量芯片分析，在同7名健康人比较后发现，明显高表达的miRNAs是35个，明显低表达的是2个。而且，这37个不同表达的miRNAs正同先前肾组织的高通量芯片结果对123 综述[37]比却发现完全不同。有研究者在10个IgAN患者及10名健康人进行了实时荧光定量PCR验证，显示miR-148b,miR-188-5p,miR-361-3p,miR-886-3p,let-7b[38]和let-7d同IgAN有明显的相关性。其中在骨骼，肌肉和免疫系统研究发现，miR-148b是用来调节细胞组织生长和发育的，它参与天然免疫，如抗原呈递给[39][40,41]Toll样受体的树突状细胞，以及许多肿瘤的生长及进展。miR-361-3p和miR-886-3p参与了肺癌的发病，但这两个miRNAs在天然免疫及炎症方面的作用还未见报道。以上都是小样本的分析，并且有些miRNAs表达量还很低。故仍需要大样本及不同病种人群的对比试验。3.2miR-148b和IgA1的糖基化异常如前所述，现在理论认为低糖基化的IgA1是引起IgAN的关键因素，而IgA的糖基化主要是通过关键酶修饰形成，如β-1,3-半乳糖苷转移酶1(C1GAlT1)，[42,43]。虽然还有环境及基因的因素，但现在普遍认为在IgAN的发病机制中，[44]C1GAlT1致IgA1糖基化缺失是很重要的因素。高通量miRNAs分析显示在体内miR-148b调节C1GalT1的活性。miR-148b可以与C1GalT1mRNA的3’UTR相结合来发挥调控作用，并且这个结合区域在[38]多个物质中具有高度保守性。Serino等将miR-148b模拟物转染到人PBMCs后，充分地降低了内源性C1GalT1mRNA的表达，相反将miR-148b的抑制物转染至从IgAN患者体内分离的PBMCs后，内源性C1GalT1mRNA的表达又显著[38]升高；另一方面，转染miR-148b模拟物到淋巴细胞性DAKIKI细胞（一种能产生IgA1的细胞系），结果可以导致糖基化缺失的IgA1分泌明显增多，将[38]miR-148b抑制物转染入上述细胞内又得出相反的结果；此外，IgAN患者（不包括系膜增生性肾小球肾炎或局灶增生性肾小球硬化）显示存在低表达的C1GalT1，而且它的表达同miR-148b呈负相关；在一个有50名IgAN患者的队列研究中，miR-148b表达上调的程度同血清IgA1糖基化缺陷的水平具有直接关[38]联。这些数据都显示了miR-148b在IgAN的发病中具有举足轻重的作用，通过调控C1GalT1的表达，增加miR-148b与C1GalT1mRNA的结合，使这种酶介导的IgA1糖基化程度降低，造成IgA1的糖基化缺失。然而，PBMCs并不生成IgA1，在体内能产生IgA1的细胞主要在骨髓和粘膜上皮，PBMCs的多态性是否也存在于骨髓或粘膜表面仍然不清楚。以上数据说明了miR-148b同IgAN的发病息息相关，这方面的邻域还有待进一步研究和发现。3.3miRNAs在IgAN进展中的研究124 综述不论IgAN的病因是什么，最终导致的是一系列肾小球及小管间质的改变：[45,46]系膜增殖；足细胞足突凋亡等等。形成肾小球硬化和小管纤维化。IgAN的进展过程中，miRNAs的异常可以出现并调控其各个阶段。[15,47]香港的Cheuk-ChunSzeto等进行了一系列的IgAN患者的miRNAs方面检测。他们发现IgAN患者相对正常对照的肾组织中，miR-200c的表达降低，[15]其表达还同尿蛋白的水平相关。在肾脏纤维化中钙粘连蛋白E（E-cadherin）的减少可以促进EMT导致纤维化进展，而E-cadherin的表达同miR-200c有明显的相关性，说明miR-200c在EMT和小管间质纤维化的进展起了重要作用。IgAN患者肾活检组织中miR-192及miR-205的表达是明显增多的，其中miR-192与肾小球硬化程度明显相关，并同这部分患者在随诊期间肾功能下降的程度相[48]关。同时，肾组织miR-205同小管间质纤维化程度及肾功能明显相关。IgAN患者肾组织中还存在高表达的miR-146a和miR-155，并且它们的表达同肾小球[47]滤过率（estimatedglomerularfiltrationrate，eGFR）呈正相关。有研究发现[49]miR-146a调控着小鼠T细胞的反应系统，并且还同慢性肾脏炎症的进展相关[50][51]。此外，miR-155调控着髓系和淋巴细胞转录的激活。当然miR-146a和miR-155这两种miRNAs在IgAN的进展中作用尚不明确，还需要更进一步的队列调查及生物学信息验证。在IgAN的进程中，miR-29家族发挥着重要的作用。miR-29家族可以在很多疾病模型中调控多种胶原蛋白及细胞外基质的表达，尤其是肾间质纤维化方[24,52][53]面。FangY等发现，在存在肾脏纤维化的IgAN大鼠肾组织中，miR-29c的含量比假手术组的含量明显降低，并且通过生物信息学模型证实了miR-29c的靶向基因是II型胶原蛋白α1链（COL2A1）和原肌球蛋白α1链（TPM1），增加miR-29c可以下调COL2A1和TPM1的mRNA的表达。此外，在用TGF-β1刺激的人肾小管上皮细胞系中，miR-29c仍然能抑制TPM1的表达，COL2A1和TPM1的表达同miR-29c呈负相关。但是该研究大部分是在体外或动物模型中实施，对病人的研究只用了10名IgAN患者，有一定的局限性。还有一些miRNAs同CKD的慢性纤维化相关。miR-21通过沉默PPAR-α[54]（peroxisomeproliferator-activatedreceptorα）来促进肾脏纤维化。miR-192表[55]达的缺失可以增强5/6切除大鼠的肾纤维化和损伤其肾功能，在糖尿病肾病患[27]者也存在相同的调节，它还可以在肾小管上皮细胞中增强TGF-β介导的E-cadherin表达下调。在暴露于高糖的HK-2近曲小管细胞，以及盐敏感大鼠模125 综述型（一种高血压模型）中分离的肾髓质上皮细胞中，均观察到了miR-29可以调[24,56]控多种胶原蛋白的表达。另外，在体外培养的系膜细胞中，高糖和TGF-β[57]可以上调miR-377的表达，这个在糖尿病的动物模型也有相同的结果。miR-377[58]过表达时能够增加纤维粘连蛋白的生成，降低超氧化物歧化酶的产生，从而激活氧化应激，触发肾小球硬化。4尿中miRNAs做为IgAN的生物学标志物的研究在IgAN发病及进展中，尿中的miRNAs已经作为一种新的生物学标志物应[59-61]用在IgAN及其他肾脏病诊断和监测中。细胞外存在大量的miRNAs。血清[62]中一些miRNAs的含量同很多疾病如肿瘤、心血管疾病和肾脏病具有相关性。[59]现在许多研究已经开始关注检测尿中的miRNAs。已经有报道发现尿沉渣中的[59,63,miRNAs同泌尿生殖系统肿瘤、移植肾的排斥反应以及一些肾脏疾病相关64]。4.1检测方法[65]有学者成功完成了尿中miRNAs的分离及定量检测70。尿沉渣中的miRNAs大部分可以结合微泡（microvesicles）并通过常规的实时定量PCR检测出来。这种方法不需要复杂的实验检测技术，非常适用于临床检验。但尿液中[66,67]还包括部分miRNAs，是以“无蛋白”的形式存在，不能同微泡结合，这样检测就会存在一定的难度。4.2潜在的诊断价值[47]肾组织和尿液中miRNAs的水平具有相关性的。尿miR-146a和miR-155的水平同尿蛋白水平相关。尿miR-146a同尿IL-1β,IL-6和肿瘤坏死因子（tumournecrosisfactor，TNF)的mRNA呈负相关，同样尿miR-155同尿IL-1β和TNF呈[47][49-51]负相关。并且已有多个研究证实了这两个miRNAs的免疫调节作用。另外还发现，同健康人对照相比，IgAN患者尿中miR-29b和miR-29c的表达水平[68]更低，而miR-93的水平更高。这同前说述IgAN肾组织miR-29c的表达趋势[53]是相一致的。Cheuk-ChunSzeto等74调查了17名IgAN、17名糖尿病肾小球硬化以及22名高血压性肾小动脉硬化症患者，检测出IgAN患者尿中miR-17的含量最高，糖尿病肾小球硬化的患者尿中miR-15的含量最低，他们认为这两个miRNAs具有肾脏病潜在的诊断价值。以上都需要更进一步的研究验证才能应用到临床。126 综述4.3同肾损伤的严重程度相关一些研究显示尿miRNAs可以作为在IgAN肾功能损害程度的分子标志物。Cheuk-ChunSzeto等调查了56个CKD患者（约1/3为IgAN患者）发现尿中miR-216a、miR-15和miR-192的水平与尿蛋白严重程度呈负相关；尿miR-217、[69]miR-17、miR-192和miR-15的含量同肾功能水平相关；尿miR-217的含量还同小管间质纤维化的程度负相关。后续研究中，他们还报道了IgAN患者尿miR-146a和miR-155同尿蛋白的严重程度正相关；尿miR-29c、miR-200a、miR-200b及miR-429不但同尿蛋白严重程度呈负相关还普遍呈低水平表达，其[70]中尿miR-29c、miR-200b和miR-429同肾脏基础功能相关。另外，他们还发现尿miR-200a、miR-200b和miR-429同维生素基因的表达呈负相关，尿miR-200b同Smad相互作用蛋白1（ZEB2）的表达负相关。另有研究发现尿miR-21、miR-29c和miR-93同尿Smad3相关性也很明显。如前所述，在IgAN中miR-29c可以调控COL2A1和TPM1的mRNA表达，可以下调经TGF-β1刺激后人小管上皮细[53]胞TPM1的表达。因此，尿中miRNAs尤其是miR-29c可能作为IgAN肾损伤进展的一个分子标志物。不过，这些研究只在亚洲人群中检测验证，是否能适用于其他种族还需进一步的证实。4.4同肾功能的关联由于尿液的留取在临床上十分方便可行且无创，故若能利用检测尿中miRNA的水平而评估患者的肾脏病危险程度并指导预后，则会具有非常大的发展前景。但迄今这方面的研究还甚少。有研究中调查了43名经肾活检确诊的IgAN患者，平均随诊33.4±12.6个月，发现肾功能下降程度同尿miR-200b的[70]表达明显相关。另一项研究调查了56名CKD患者（约1/3为IgAN患者）后发现miR-21和miR-216a也同肾功能的下降相关，但在IgAN患者中并未发现上[69]述的相关性。因此，还需要大样本和多元化分析。4.5展望对miRNAs的研究已成为很多邻域的热门，在肾脏病中尿miRNAs水平的诊断价值已经日益彰显，提取和量化尿沉渣中的miRNAs已经做为一种重要的实验技术。但IgAN患者尿miRNAs的应用仍然只是在起步阶段，还需要大样本研究的验证和和随访的研究支持。miRNAs作为一种疾病危险分层和疾病监测的工具，其同肾组织病变程度的127 综述相关性还未有人涉足，同肾功能的相关性方面也只有极少报道，同肾脏终点事件（如死亡或进入透析）的关系也不明确。因此对于尿miRNAs在IgAN的邻域还有待于大量的研究和挖掘，并具有广阔的前景。5总结目前，miRNAs在IgAN发病及进展方面的研究数量还有限，方法上仍存在一些缺陷。而这一领域仍处于起步阶段，尤其对特定miRNA表达及与靶基因的分析方面，需要借助靶基因预测和富集分析，以及采用复制物和抑制物甚至其转基因模型或基因敲除动物模型进行验证，这是IgAN治疗靶点的研究突破口。过去十年，许多研究已经显示出miRNAs在IgAN的发病中起了重要的致病作用。这些致病miRNAs参与IgAN发病及进展，并且数据提示了它作为新治疗靶点的重要性。一种新的RNA靶向药物类已经在开发，既miRNA调节剂（如[71]antagomirs），它是一种寡核苷酸，在体内能特异且有效地抑制miRNAs的表达。总之，miRNAs用于IgAN诊断及临床治疗上还有很长的路要走。128 综述（参考文献）参考文献[1]WyattRJ,JulianBA.IgAnephropathy[J].NEnglJMed,2013,368(25):2402-2414.[2]LiPK,HoKK,SzetoCC,etal.PrognosticindicatorsofIgAnephropathyintheChinese--clinicalandpathologicalperspectives[J].NephrolDialTransplant,2002,17(1):64-69.[3]LeW,LiangS,HuY,etal.Long-termrenalsurvivalandrelatedriskfactorsinpatientswithIgAnephropathy:resultsfromacohortof1155casesinaChineseadultpopulation[J].NephrolDialTransplant,2012,27(4):1479-1485.[4]ZuoL,WangM,ChineseAssociationofBloodPurificationManagementofChineseHospitalA.CurrentburdenandprobableincreasingincidenceofESRDinChina[J].ClinNephrol,2010,74Suppl1:S20-22.[5]LiLS,LiuZH.EpidemiologicdataofrenaldiseasesfromasingleunitinChina:analysisbasedon13,519renalbiopsies[J].KidneyInt,2004,66(3):920-923.[6]SuzukiH,KirylukK,NovakJ,etal.ThepathophysiologyofIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2011,22(10):1795-1803.[7]RoosA,vanKootenC.UnderglycosylationofIgAinIgAnephropathy:morethanadiagnosticmarker?[J].KidneyInt,2007,71(11):1089-1091.[8]SzetoCC,LiPK.MicroRNAsinIgAnephropathy[J].NatRevNephrol,2014,10(5):249-256.[9]赵静,陈光辉,刘德军,etal.原发性肺癌患者外周血中microRNA-31的表达及意义[J].郑州大学学报(医学版),2014,(05):684-686.[10]刘婵.microRNA-630对IgA肾病人腭扁桃体TLR4及低糖基化IgA1表达的作用研究[D];中南大学,2014.[11]BhattK,MiQS,DongZ.microRNAsinkidneys:biogenesis,regulation,andpathophysiologicalroles[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2011,300(3):F602-610.[12]MoritaK,HanM.Multiplemechanismsareinvolvedinregulatingtheexpressionofthedevelopmentaltimingregulatorlin-28inCaenorhabditiselegans[J].EMBOJ,2006,25(24):5794-5804.[13]ChanSP,RamaswamyG,ChoiEY,etal.Identificationofspecificlet-7microRNAbindingcomplexesinCaenorhabditiselegans[J].RNA,2008,14(10):2104-2114.[14]BernsteinE,KimSY,CarmellMA,etal.Dicerisessentialformousedevelopment[J].NatGenet,2003,35(3):215-217.[15]WangG,KwanBC,LaiFM,etal.IntrarenalexpressionofmicroRNAsinpatientswithIgAnephropathy[J].LabInvest,2010,90(1):98-103.[16]CastanoIM,CurtinCM,ShawG,etal.Anovelcollagen-nanohydroxyapatitemicroRNA-activatedscaffoldfortissueengineeringapplicationscapableofefficient129 综述（参考文献）deliveryofbothmiR-mimicsandantagomiRstohumanmesenchymalstemcells[J].JControlRelease,2015,200:42-51.[17]YooSS,RazzakR,BedardE,etal.Layeredgadolinium-basednanoparticleasanoveldeliveryplatformformicroRNAtherapeutics[J].Nanotechnology,2014,25(42):425102.[18]BartelsCL,TsongalisGJ.MicroRNAs:novelbiomarkersforhumancancer[J].ClinChem,2009,55(4):623-631.[19]XiaoC,RajewskyK.MicroRNAcontrolintheimmunesystem:basicprinciples[J].Cell,2009,136(1):26-36.[20]TianZ,GreeneAS,PietruszJL,etal.MicroRNA-targetpairsintheratkidneyidentifiedbymicroRNAmicroarray,proteomic,andbioinformaticanalysis[J].GenomeRes,2008,18(3):404-411.[21]SunY,KooS,WhiteN,etal.Developmentofamicro-arraytodetecthumanandmousemicroRNAsandcharacterizationofexpressioninhumanorgans[J].NucleicAcidsRes,2004,32(22):e188.[22]LorenzenJM,HallerH,ThumT.MicroRNAsasmediatorsandtherapeutictargetsinchronickidneydisease[J].NatRevNephrol,2011,7(5):286-294.[23]ChandrasekaranK,KarolinaDS,SepramaniamS,etal.RoleofmicroRNAsinkidneyhomeostasisanddisease[J].KidneyInt,2012,81(7):617-627.[24]LiuY,TaylorNE,LuL,etal.RenalmedullarymicroRNAsinDahlsalt-sensitiverats:miR-29bregulatesseveralcollagensandrelatedgenes[J].Hypertension,2010,55(4):974-982.[25]KatoM,ZhangJ,WangM,etal.MicroRNA-192indiabetickidneyglomerulianditsfunctioninTGF-beta-inducedcollagenexpressionviainhibitionofE-boxrepressors[J].ProcNatlAcadSciUSA,2007,104(9):3432-3437.[26]KasinathBS,FeliersD.ThecomplexworldofkidneymicroRNAs[J].KidneyInt,2011,80(4):334-337.[27]KrupaA,JenkinsR,LuoDD,etal.LossofMicroRNA-192promotesfibrogenesisindiabeticnephropathy[J].JAmSocNephrol,2010,21(3):438-447.[28]XuX,KriegelAJ,LiuY,etal.DelayedischemicpreconditioningcontributestorenalprotectionbyupregulationofmiR-21[J].KidneyInt,2012,82(11):1167-1175.[29]Muratsu-IkedaS,NangakuM,IkedaY,etal.DownregulationofmiR-205modulatescellsusceptibilitytooxidativeandendoplasmicreticulumstressesinrenaltubularcells[J].PLoSOne,2012,7(7):e41462.[30]LanYF,ChenHH,LaiPF,etal.MicroRNA-494reducesATF3expressionandpromotesAKI[J].JAmSocNephrol,2012,23(12):2012-2023.[31]NeilsonEG.Mechanismsofdisease:Fibroblasts--anewlookatanoldproblem[J].NatClinPractNephrol,2006,2(2):101-108.[32]KriegelMA,LiMO,SanjabiS,etal.Transforminggrowthfactor-beta:recentadvancesonitsroleinimmunetolerance[J].CurrRheumatolRep,2006,8(2):138-144.130 综述（参考文献）[33]TanzerA,StadlerPF.MolecularevolutionofamicroRNAcluster[J].JMolBiol,2004,339(2):327-335.[34]CloonanN,BrownMK,SteptoeAL,etal.ThemiR-17-5pmicroRNAisakeyregulatoroftheG1/Sphasecellcycletransition[J].GenomeBiol,2008,9(8):R127.[35]ServaA,KnappB,TsaiYT,etal.miR-17-5pregulatesendocytictraffickingthroughtargetingTBC1D2/Armus[J].PLoSOne,2012,7(12):e52555.[36]WangJ,HeJ,SuF,etal.RepressionofATRpathwaybymiR-185enhancesradiation-inducedapoptosisandproliferationinhibition[J].CellDeathDis,2013,4:e699.[37]TanK,ChenJ,LiW,etal.Genome-wideanalysisofmicroRNAsexpressionprofilinginpatientswithprimaryIgAnephropathy[J].Genome,2013,56(3):161-169.[38]SerinoG,SallustioF,CoxSN,etal.AbnormalmiR-148bexpressionpromotesaberrantglycosylationofIgA1inIgAnephropathy[J].JAmSocNephrol,2012,23(5):814-824.[39]LiuX,ZhanZ,XuL,etal.MicroRNA-148/152impairinnateresponseandantigenpresentationofTLR-triggereddendriticcellsbytargetingCaMKIIalpha[J].JImmunol,2010,185(12):7244-7251.[40]ChenY,SongYX,WangZN.ThemicroRNA-148/152family:multi-facetedplayers[J].MolCancer,2013,12:43.[41]CiminoD,DePittaC,OrsoF,etal.miR148bisamajorcoordinatorofbreastcancerprogressioninarelapse-associatedmicroRNAsignaturebytargetingITGA5,ROCK1,PIK3CA,NRAS,andCSF1[J].FASEBJ,2013,27(3):1223-1235.[42]RaskaM,MoldoveanuZ,SuzukiH,etal.IdentificationandcharacterizationofCMP-NeuAc:GalNAc-IgA1alpha2,6-sialyltransferaseinIgA1-producingcells[J].JMolBiol,2007,369(1):69-78.[43]SuzukiH,MoldoveanuZ,HallS,etal.IgA1-secretingcelllinesfrompatientswithIgAnephropathyproduceaberrantlyglycosylatedIgA1[J].JClinInvest,2008,118(2):629-639.[44]LiGS,ZhangH,LvJC,etal.VariantsofC1GALT1geneareassociatedwiththegeneticsusceptibilitytoIgAnephropathy[J].KidneyInt,2007,71(5):448-453.[45]FloegeJ.ThepathogenesisofIgAnephropathy:whatisnewandhowdoesitchangetherapeuticapproaches?[J].AmJKidneyDis,2011,58(6):992-1004.[46]LoefflerI,WolfG.Transforminggrowthfactor-betaandtheprogressionofrenaldisease[J].NephrolDialTransplant,2014,29Suppl1:i37-i45.[47]WangG,KwanBC,LaiFM,etal.ElevatedlevelsofmiR-146aandmiR-155inkidneybiopsyandurinefrompatientswithIgAnephropathy[J].DisMarkers,2011,30(4):171-179.[48]PuhrM,HoeferJ,SchaferG,etal.Epithelial-to-mesenchymaltransitionleadstodocetaxelresistanceinprostatecancerandismediatedbyreducedexpressionofmiR-200candmiR-205[J].AmJPathol,2012,181(6):2188-2201.[49]YangL,BoldinMP,YuY,etal.miR-146acontrolstheresolutionofTcellresponsesin131 综述（参考文献）mice[J].JExpMed,2012,209(9):1655-1670.[50]IchiiO,OtsukaS,SasakiN,etal.AlteredexpressionofmicroRNAmiR-146acorrelateswiththedevelopmentofchronicrenalinflammation[J].KidneyInt,2012,81(3):280-292.[51]VigoritoE,KohlhaasS,LuD,etal.miR-155:anancientregulatoroftheimmunesystem[J].ImmunolRev,2013,253(1):146-157.[52]QinW,ChungAC,HuangXR,etal.TGF-beta/Smad3signalingpromotesrenalfibrosisbyinhibitingmiR-29[J].JAmSocNephrol,2011,22(8):1462-1474.[53]FangY,YuX,LiuY,etal.miR-29cisdownregulatedinrenalinterstitialfibrosisinhumansandratsandrestoredbyHIF-alphaactivation[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2013,304(10):F1274-1282.[54]ChauBN,XinC,HartnerJ,etal.MicroRNA-21promotesfibrosisofthekidneybysilencingmetabolicpathways[J].SciTranslMed,2012,4(121):121ra118.[55]ChungAC,HuangXR,MengX,etal.miR-192mediatesTGF-beta/Smad3-drivenrenalfibrosis[J].JAmSocNephrol,2010,21(8):1317-1325.[56]DuB,MaLM,HuangMB,etal.Highglucosedown-regulatesmiR-29atoincreasecollagenIVproductioninHK-2cells[J].FEBSLett,2010,584(4):811-816.[57]WangQ,WangY,MintoAW,etal.MicroRNA-377isup-regulatedandcanleadtoincreasedfibronectinproductionindiabeticnephropathy[J].FASEBJ,2008,22(12):4126-4135.[58]FleissnerF,JazbutyteV,FiedlerJ,etal.Shortcommunication:asymmetricdimethylarginineimpairsangiogenicprogenitorcellfunctioninpatientswithcoronaryarterydiseasethroughamicroRNA-21-dependentmechanism[J].CircRes,2010,107(1):138-143.[59]HankeM,HoefigK,MerzH,etal.ArobustmethodologytostudyurinemicroRNAastumormarker:microRNA-126andmicroRNA-182arerelatedtourinarybladdercancer[J].UrolOncol,2010,28(6):655-661.[60]CortezMA,CalinGA.MicroRNAidentificationinplasmaandserum:anewtooltodiagnoseandmonitordiseases[J].ExpertOpinBiolTher,2009,9(6):703-711.[61]MitchellPS,ParkinRK,KrohEM,etal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection[J].ProcNatlAcadSciUSA,2008,105(30):10513-10518.[62]GiladS,MeiriE,YogevY,etal.SerummicroRNAsarepromisingnovelbiomarkers[J].PLoSOne,2008,3(9):e3148.[63]LorenzenJM,VolkmannI,FiedlerJ,etal.UrinarymiR-210asamediatorofacuteT-cellmediatedrejectioninrenalallograftrecipients[J].AmJTransplant,2011,11(10):2221-2227.[64]WangG,TamLS,LiEK,etal.SerumandurinaryfreemicroRNAlevelinpatientswithsystemiclupuserythematosus[J].Lupus,2011,20(5):493-500.[65]WangG,SzetoCC.MethodsofmicroRNAquantificationinurinarysediment[J].132 综述（参考文献）MethodsMolBiol,2013,1024:211-220.[66]TurchinovichA,WeizL,LangheinzA,etal.CharacterizationofextracellularcirculatingmicroRNA[J].NucleicAcidsRes,2011,39(16):7223-7233.[67]WangG,TamLS,LiEK,etal.Serumandurinarycell-freeMiR-146aandMiR-155inpatientswithsystemiclupuserythematosus[J].JRheumatol,2010,37(12):2516-2522.[68]WangG,KwanBC,LaiFM,etal.UrinarymiR-21,miR-29,andmiR-93:novelbiomarkersoffibrosis[J].AmJNephrol,2012,36(5):412-418.[69]SzetoCC,Ching-HaKB,Ka-BikL,etal.Micro-RNAexpressionintheurinarysedimentofpatientswithchronickidneydiseases[J].DisMarkers,2012,33(3):137-144.[70]WangG,KwanBC,LaiFM,etal.ExpressionofmicroRNAsintheurinarysedimentofpatientswithIgAnephropathy[J].DisMarkers,2010,28(2):79-86.[71]KrutzfeldtJ,RajewskyN,BraichR,etal.SilencingofmicroRNAsinvivowith'antagomirs'[J].Nature,2005,438(7068):685-689.133 个人简历个人简历梁艳，女，1981年01月出生，山西省长治市人；2004年毕业于西安交通大学，专业：临床医学，获学士学位；2007年毕业于南昌大学，专业：内科学（肾脏病学），获硕士学位；2007年-2011年，工作于郑州大学附属郑州中心医院肾内科；2011年就读郑州大学第一附属医院，专业内科学（肾脏病学）。134 攻读博士期间发表文章及研究成果攻读博士期间发表文章及研究成果发表文章[1]LiangY,ZhangJJ,ZhouYL,etal.ProliferationandcytokineproductionofhumanmesangialcellsstimulatedbysecretoryIgAisolatedfrompatientswithIgAnephropathy[J].CellPhysiolBiochem.Accepted.[2]LiangY,ZhangJJ,LiuDW,etal.RetrospectivestudyofmycophenolatemofetiltreatmentinIgAnephropathywithproliferativepathologicalphenotype[J].ChinMedJ(Engl).2014;127(1):102-8.[3]LiangY,ZhangJJ,LiuZS.ThedepositionofsecretoryIgAinpatientswithIgAnephropathyareassociatedwithclinicalandpathologicalphenotypes[Abstract].JAmSocNephrol2012,23(11):197A.[4]ZhangJJ,LiangY,LiuZS.ThedepositionofsecretoryIgAinpatientswithIgAnephropathyareassociatedwithdefferentclinicalpathologyandcomplementactivation[Abstract].JAmSocNephrol2013,24(11):492A.[5]LiuDW,ZhenXG,LiangY,etal.Persistentasthmaincreasestheriskofchronickidneydisease:aretrospectivecohortstudyof2354patientswithasthma[J].ChinMedJ(Engl).2013;126(21):4093-9.研究成果参加研究项目[1]国家自然科学基金项目《分泌型IgA在IgA肾病发病机制中的作用研究》(项目批准号：81100510/H0509）；[2]国家重点基础研究发展计划（973计划）项目《常见肾小球疾病发病机制及其早期诊断》（编号：2012CB517600）；[3]郑州市创新团队（编号：10CXTD142）。申请基金[1]郑州大学优秀博士学位论文基金：分泌型IgA在IgA肾病发病机制中的作用研究。获奖情况[1]2012年中华医学会全国肾病年会优秀论文：《IgA肾病患者中分泌型IgA的沉积与其临床病理之间的关系》。[2]2013年郑州大学优秀研究生；[3]2014年郑州大学三好研究生；135 攻读博士期间发表文章及研究成果[4]2014年郑州大学百优研究生；[5]2014年郑州大学优秀科研奖;[6]2015年郑州大学优秀毕业生。136 致谢致谢行文至此，我的论文已接近尾声；岁月如梭，我的博士生活即将结束。回首四年，我想说声着实不易！但正是大家对我的指导、关心、爱护，才使我有了今天的进步。首先，感谢我的导师刘章锁教授对我的帮助和关怀！感谢导师在博士期间对我学习上的谆谆教诲，工作上的严格要求，生活上的悉心关怀！导师严谨的治学态度，认真仔细的工作作风，宽厚待人的博大胸怀，都是今后生活、工作中学习的榜样！导师的人格魅力会一直深深感染和影响着我！其次，衷心感谢张军军副教授对我科研上的指导和培养，正是她细心无私的教导，才使我从实验的每个困难中坚强并正确地走出来，使我掌握了各种实验技能，学会了科学的思维；感谢北京大学第一医院肾脏病研究所的赵明辉教授、张宏教授在实验上一如既往的无私帮助和指导，使我能在他们研究所进行实验。在这种国家级重点实验室的平台上，使我的科研水平有了很大的提高，这种人生的财富让我倍感珍惜！还有实验室的王凤梅、李建男、宋迪、李淼等好伙伴们，感谢他们在我每每实验遇到困难时都能帮我一起克服，我们一起渡过的岁月会成为美好的记忆留存心底！感谢郑州大学基础医学院的赵国强教授对我科研上的指导及无私的帮助，他严谨和忘我的工作作风深深影响着我！在他身体不适时还为我指导论文，让我非常感动和钦佩！以及微免实验中心的王媛媛、陈肖楠、杜玉文、李萍等好姐妹，谢谢她们无私的关心和帮助！感谢我科郭佳老师对我实验完成及论文书写的耐心指导！感谢我科的各位老师对我实验的支持，以及学习和工作上的关心和帮助！衷心感谢我的同学刘东伟、张茜、杨杨和各位师弟、师妹，以及同学李琳琳等对我的指导和帮助！感谢各位参加论文评阅和答辩的各位老师！由衷感谢我的家人，正是他们的支持才使我没有负担地读完博士四年。最后，向关心过我的每一个人表达我最诚挚的谢意！137
此文档下载收益归作者所有
